酵母抽提物（yeast extract，YE）是活性酵母乳液经过破壁和自溶等处理工艺，将胞内的前体物质分别降解为呈味氨基酸、肽、肌苷酸、鸟苷酸等具有鲜味的物质，再通过一系列的离心分离、浓缩及喷雾干燥等加工处理最终得到的风味突出的膏状或粉状产品[1-3]。近些年，随着国内YE生产技术的快速发展，市场上YE的种类趋于多样化，基础型、增强鲜味型、富含多肽型、特殊风味型等。各类型YE在实际应用中的效果较好，拓宽了其应用范围，在食品中具有极其广阔的发展前景[4-5]。
酱香风味是我国传统发酵食品中非常有特色的风味，具有酱香风味的发酵食品有酱油[6]、豆（瓣）酱[7]、豆豉、酱香型白酒[8-9]等。酱香风味物质除了有传统发酵食品中的苯乙醇、乳酸乙酯、乙酸乙酯等花果香[10]、甜香风味化合物外，还包括愈创木酚、2,5-二甲基吡嗪、糠醛及4-羟基-2,5-二甲基-3[2H]-呋喃酮（4-hydroxy-2，5-dimethyl-3[2H]-furanone，HDMF）[11]等物质。与传统发酵食品不同，通过高温长时间反应生产得到的YE也具有一定的酱香风味，说明酱香风味的产生不仅与微生物发酵[12-13]有关，还与美拉德热反应有密切联系[10]。
酱香YE在酱油中的应用效果好且市场需求较大，但目前市场对酱香YE的品质和风味要求较高，现有酱香YE的风味已不能满足市场需求，目前YE的研究主要集中在滋味方面，其挥发性风味研究相对较少，尤其是对酱香、烤香和蒜香等有典型风味YE的研究。酱油特征风味的研究方法较成熟，且酱香YE主要应用于酱油等调味领域，其整体气味与酱油有相似性，所以酱油特征风味的研究对酱香YE的风味研究具有一定的借鉴意义。
本研究以2种酱油和不同类型及不同工艺的11种酱香YE为实验材料，利用气相色谱-质谱联用（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）技术检测酱油及酱香YE中的挥发性风味物质，再结合感官评价和偏最小二乘法（partial least squares，PLS）确定各类风味物质对酱香风味的贡献值以及酱香特征风味物质，为现有酱香YE产品的工艺改进、新产品开发和在酱油领域的应用推广提供了数据支撑和理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
酱油1（水分含量64.2%，食用盐16.5%，氨基酸态氮1.7%）、酱油2（水分含量64.7%，食用盐15.6%，氨基酸态氮1.8%）：宜昌沃尔玛超市；酱香YE-1、酱香YE-2、酱香YE-3、酱香YE-4、酱香YE-5、酱香YE-6、酱香YE-7、酱香YE-8、酱香YE-9、酱香YE-10、酱香YE-11（YE-1～YE-6为不同热反应工艺的风味型酵母抽提物，YE-7～YE-11为不同基础工艺的纯品型酵母抽提物）：安琪酵母股份有限公司；酱油原油（水分含量71.3%，食用盐17.1%，氨基酸态氮1.68%）：烟台欣和企业食品有限公司。
1.2 仪器与设备
7690B-5977B气相色谱-质谱联用仪：安捷伦科技（中国）有限公司；50/30 μm DVB/CAR/PDMS固相微萃取吸附头：美国Supelco公司；FA2204B电子天平：上海第二天平厂。
1.3 实验方法
1.3.1 挥发性风味物质检测
（1）样品前处理
采用顶空固相微萃取（headspace solid-phase microextraction，HS-SPME）对样品的挥发性气味化合物进行提取和富集。称取样品2.0 g，加入1.5 g NaCl和5 mL蒸馏水，再加入1 μL内标邻二氯苯（质量浓度185 μg/mL），将称取好的样品立即用带有硅橡胶垫的瓶盖密封，放入旋转振荡器中，50 ℃平衡30 min，用DVB/CAR/PDMS复合萃取头在50 ℃条件下萃取30 min，然后进样，250 ℃解吸5 min。
（2）GC-MS分析条件
气相色谱条件：DB-HeavyWAX色谱柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm），载气为高纯氦气（He），流速1.66 mL/min，不分流，运行时间43 min，升温程序为初温40 ℃保持3 min，以5 ℃/min速率升至200 ℃，以10 ℃/min速率升至250 ℃，保持3 min。质谱条件：电子电离（electronic ionization，EI）源，四极杆温度150 ℃，离子源温度230 ℃，传输线温度250 ℃。
（3）定性定量方法
挥发性风味成分的鉴定结果以美国国家标准技术研究所（National Institute of Standards and Technology，NIST）17谱库检索和人工图谱解析共同确定，选择匹配度＞800的成分为有效挥发性成分[14]。化合物的相对含量按照内标法确定，挥发性风味成分含量（μg/kg）=化合物峰面积/内标物峰面积×内标物浓度[15]。
1.3.2 酱香YE的感官评分
组织感官小组人员在25 ℃的感官评价室进行，男性5人和女性5人，年龄25～40岁，具有3年以上感官评定工作经验。每名评价人员对实验YE样品的酱香整体风味按照0～100分的区间进行打分，去掉每个样品的最高分和最低分，取其余评分的平均值作为每个酱香YE的最终得分[15]。
1.3.3 酱香YE在酱油酿造中的应用
以酿造好的酱油原油为基料，先进行灭菌澄清，再按照1%的添加量将酱香YE加入到酱油原油中搅拌溶解均匀，再进行感官评价。
酱油的感官评价方法[16]：选取酱香风味好且感官评分较高的酱香YE，按照1%的添加比例添加至酱油原油中，并组织15名感官小组人员按照GB/T13868—2009《感官分析建立感官分析实验室的一般导则》在25℃具有独立品评间的感官室进行感官评价，男性10人和女性5人，年龄25～40岁，具有三年以上感官评定工作经验。品评员按照表1的评分标准对带有编号的酱油样品从酱香香气、鲜味、甜味、咸味、酸味、苦味、浓厚味7个方面进行感官打分，满分100分。
表1 酱油的感官评价标准
Table 1 Sensory evaluation standards of soy sauce
1.3.4 统计分析
运用Qualitative Navigator B.08.00对GC-MS检测结果进行处理，用Origin Pro 8.5软件作图，采用JMP13（SW）软件对实验结果进行偏最小二乘法统计分析，每个数据重复测定3次，实验结果以“平均值±标准差”表示。
2 结果与分析
2.1 样品中主要挥发性风味物质的测定
酱油及酱香YE样品中主要挥发性风味物质测定结果见表2。
由表2可知，酱油与酱香YE样品中共检测出21种有效的挥发性风味物质，两种酱油中均检测出16种挥发性风味物质，均含有3种醇类，1种酚类，3种醛类，1种酸类。此外，酱油1中含有5种吡嗪类和3种其他类物质，酱油2中含有6种吡嗪类和2种其他类物质，由于研究对象、风味提取方式和分析仪器以及定性定量方法不同，所以本研究中分析鉴定出的酱油风味物质数量和种类与文献中存在较大的差异。两个酱油样品中含量较高的风味物质有：糠醇、苯乙醇、3-甲硫基丙醛、苯甲醛、苯乙醛和愈创木酚。醇类物质中的苯乙醇是酱油的关键风味物质[17-18]，愈创木酚和3-甲硫基丙醛对酱油的整体风味贡献也较大，分别赋予酱油烟熏味和焦糖味[19-20]，苯乙醛被认为是传统酱油中典型的挥发性化合物，在酱油中提供花香气味[6]。醛类物质主要是相应的氨基酸通过Ehrlich途径的降解产生的，对食物的气味有很强的影响[21]。虽然酱油的工艺不同，检测出的风味物质有所差异，但是本研究中检测出的含量较高的物质在不同文献中均有报道[22-23]，说明本实验采用的风味检测方法可行。YE-1、YE-2、YE-4～YE-6中均检测出19种挥发性风味物质，YE-3中检测出20种挥发性风味物质，YE-7～YE-9中均检测出17种挥发性风味物质，YE-10和YE-11中均检测出18种挥发性风味物质，11种酱香YE中风味物质的差异主要为吡嗪类物质和其他类物质，由于YE-1～YE-6是通过外加葡萄糖、味精等原料经过高温反应制备得到的风味型YE，所以这6种YE中吡嗪类的种类多于其他5种YE；YE-7～YE-11是按照基础生产工艺，不额外添加其他原料且不通过高温热反应工序制备的纯品型YE，其中吡嗪类物质和其他类物质比YE-1～YE-6少。
YE的挥发性风味物质研究相关的报道较少，现有报道主要是对粉末状YE的酵母挥发性风味物质进行研究。ZHANG Y等[24]分别采用固相微萃取（solid phase microextraction，SPME）和溶剂辅助风味蒸发（solvent assisted flavor evaporation，SAFE）对3种具有酵母气味的YE的挥发性成分进行萃取，并利用气相色谱-嗅觉-质谱（gas chromatography-olfactory-mass spectrometry，GC-O-MS）法和芳香提取物稀释分析（aromatic extract dilution analysis，AEDA）技术进行分析，共检出了30种香气活性化合物，其中4-甲基苯酚、3-甲基吡啶、3-甲基丁酸、丙酸被确定引起酵母气味的关键物质。LIN M L等[25]采用动态顶空萃取和同步蒸馏萃取法提取YE的芳香活性化合物，采用气相色谱-嗅觉-质谱联用动态顶空稀释分析或芳香提取物稀释分析进行检测，发现YE中3-甲基丁醛、2,3-丁二酮、2,3,5-三甲基-吡嗪、乙酸乙烯酯、2-乙酰基-1-吡咯啉、（E,E）-2,4-癸二烯醛是YE具有烤香风味的关键芳香活性化合物。酱油和酱香YE样品中的挥发性风味物质种类整体上一致，部分风味物质有一定的差异，如酱油中的3-甲硫基丙醛在YE-1至YE-9中都未检出，YE-10和YE-11中虽然检出但其含量较低，说明3-甲硫基丙醛是酱油的特征风味物质；酱香YE样品中乙酸、异丁酸、3,5-二乙基-2-甲基吡嗪、二甲基二硫和二甲基三硫在酱油中未检出或含量较低。
由于酱油和酱香YE中挥发性风味物质较多，无法直接判断单一物质对酱香风味的影响程度，所以需要先将挥发性风味物质进行分类，再通过偏最小二乘法找出对酱香风味贡献较大的风味物质类型和具体特征风味物质。
2.2 各类挥发性风味物质含量
对酱油及酱香YE中的挥发性风味物质进行分类分析，结果见图1。由图1可知，挥发性风味物质总含量从高到低依次排序为：YE-3＞YE-9＞YE-4＞YE-8＞YE-1＞酱油2＞YE-11＞酱油1＞YE-6＞YE-10＞YE-2＞YE-5＞YE-7。结果表明，两种酱油样品中酸类和吡嗪类物质的含量较低，这可能与样品的生产工艺有关，因为YE的生产过程中伴随着调节pH、长时间酶解和高温热反应等工序，这些过程都会导致酸类和吡嗪类物质的产生和累积。
图1 酱油及酱香YE中各类风味物质的含量
Fig.1 Contents of various types of volatile flavor substances in soy sauce and sauce-flavor YE
2.3 酱油及酱香YE的酱香风味感官评分
由感官小组的人员对各样品的酱香气味进行打分，然后剔除异常分值，以每个样品的感官评分的平均值作为该样品的最终得分，具体得分情况见图2。
图2 酱油及酱香YE中挥发性风味物质总含量及感官评分
Fig.2 Total contents of volatile flavor substances and sensory score of soy sauce and sauce-flavor YE
由图2可知，挥发性风味物质的总含量高低与酱香气味之间并不是呈线性关系，挥发性风味物质总含量与酱香气味感官评分之间无明显规律性。酱油1中风味物质总含量＜800 μg/kg，但其感官评分最高；而YE-4中风味物质总含量排序第3，但其感官评分却排序最后3位。由此说明样品的整体酱香风味是多种挥发性物质相互影响、相互作用的结果，所以利用偏最小二乘法进行分析，找出各类挥发性风味物质对酱香气味的贡献程度。结果表明，酱香YE-3的酱香风味和感官评分最佳。
2.4 偏最小二乘法确定特征风味物质
以醇酚类、醛类、酸类、吡嗪类、其他类风味物质的总含量作为自变量，感官评分作为因变量，将上述数据导入JMP 13分析软件中，按照多元分析中的PLS进行分析[26]，结果PLS模型主成分回归系数Q2=0.955 6，模型区分参数累计贡献率（R2Y）=0.906 16，矩阵结实率累计贡献率（R2X）=0.753 86，它们的数据均＞0.5，说明建立的模型稳定可靠，提取相关系数（R）和变量投影重要性（variable importance in the projection，VIP）值见表3。
表3 各风味物质种类与感官评分的相关性和变量投影重要性值
Table 3 Correlation between each flavor substance type and sensory score and variable importance in projection
由表3可知，五类挥发性风味物质中醇酚类、醛类和其他类物质与酱香感官评分呈正相关，酸类和吡嗪类与酱香感官评分呈负相关。醇酚类、醛类和酸类VIP贡献值大于吡嗪类和其他类物质，吡嗪类物质对酱香风味的贡献最小。酱油和酱香YE中醇酚类、醛类和酸类的主要特征风味物质有糠醇、5-甲基-2-呋喃甲醇、苯乙醇、愈创木酚、3-甲硫基丙醛、苯甲醛、苯乙醛、乙酸、异丁酸、异戊酸，其中两种酱油中3种醇类物质的含量总体上高于11个酱香YE，醇类物质的挥发性较好，所以酱油的整体气味较清爽；3-甲硫基丙醛几乎只在两种酱油中检出，YE-1～YE-9中未检测出该物质，YE-10和YE-11中虽然可以检测出3-甲硫基丙醛，但其含量较低，而且酱香YE的酱香气味评分与酱油差异较大，酱香YE中乙酸、异丁酸和异戊酸的含量较高，而酱油中未检出乙酸和异丁酸，说明酸类物质可能会增加样品整体风味的厚重感，不利于良好风味的挥发。通过上述分析得出以下结论：酱油的酱香特征风味物质与酱香YE的酱香特征风味物质有一定差异，酱油的酱香风味较清爽，其特征风味物质主要为糠醇、5-甲基-2-呋喃甲醇、苯乙醇、愈创木酚、3-甲硫基丙醛、苯甲醛、苯乙醛；酱香YE的酱香风味较厚重，其特征风味物质主要为糠醇、5-甲基-2-呋喃甲醇、苯乙醇、愈创木酚、苯甲醛、苯乙醛、乙酸、异丁酸、异戊酸。
2.5 酱香YE在酱油酿造中的应用
以酿造好的酱油原油为基料，先进行灭菌澄清，再按照1%的添加量将酱香YE-3加入酱油原油中搅拌均匀，再分别对未添加YE的酱油原油和添加酱香YE-3的酱油原油进行感官评价，结果见图3。
图3 添加YE-3酱油的感官评价雷达图
Fig.3 Radar map of sensory evaluation of soy sauce with YE-3 addition
由图3可知，在酱油原油中添加1%的酱香YE-3后，苦味、酸味和甜味无明显变化，酱香香气、鲜味、咸味和浓厚味分别提升了17.5%、34.8%、24.8%和36.6%。李沛等[27]对酱香型风味YE在酱油中减盐后的口感和风味进行了研究，发现酱香型YE可以在减盐酱油中很好的弥补因原油用量减少而造成的呈味呈香物质的稀释。添加酱香YE实现酱油的减盐不减味的方法不涉及新设备和新技术的投入以及发酵工艺的变动，用现有原油便可实现，是适合酱油行业广泛推广的一种减盐方案及途径。
3 结论
通过GC-MS技术、感官评分和偏最小二乘法确定了各类风味物质对酱香风味的贡献以及酱油和酱香YE的特征风味物质。醇酚类、醛类和其他类的含量与酱香风味呈正相关，酸类和吡嗪类与酱香风味呈负相关；酱油的酱香较清爽，其特征风味物质主要为糠醇、5-甲基-2-呋喃甲醇、苯乙醇、愈创木酚、3-甲硫基丙醛、苯甲醛、苯乙醛；酱香YE的酱香较厚重，其特征风味物质主要为糠醇、5-甲基-2-呋喃甲醇、苯乙醇、愈创木酚、苯甲醛、苯乙醛、乙酸、异丁酸、异戊酸。添加酱香YE-3可以提升酱油原油的酱香香气、鲜味、咸味和浓厚味，分别提升了17.5%、34.8%、24.8%和36.6%。本研究探究酱香YE与酱油酱香风味物质的差异以及不同生产条件对酱香YE风味的影响，为现有酱香YE的工艺改进、新酱香风味产品的开发以及酱香YE在酱油领域的应用推广提供了数据支撑和理论依据。
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