酒糟是白酒生产过程中的主要次产物之一，其含有大量的淀粉、蛋白质及矿物质元素，营养价值较高，对于酒糟的深加工也是目前研究的热点之一[1]。而利用酒糟酿醋可以有效实现酒糟的再利用，同时节约了粮源，因此受到了研究者的广泛关注[2-3]。但目前的酒糟酿醋技术尚有一些不足，由于酒糟中酒精含量较低，需要将其酒化后再进行醋酸发酵，使得发酵过程复杂且周期较长。此外，目前常用的酒糟酿醋技术并未完全利用酒糟中含有的大量蛋白质，这在一定程度上影响了酒糟酿造食用醋的产量与品质。酒尾与黄水也是白酒生产的重要副产物，因酸类物质较多且邪味较大而不能直接使用，但其酒精度相对较高[4]，可为醋酸发酵初始阶段提供较为充足的乙醇，此外其还含有较高的酸类物质和风味物质，黄水中还含有一定量的还原糖[5]，对于食醋的生产酿造较为有利，因此在酒糟酿醋过程中添加酒尾黄水不仅可以简化发酵过程，降低生产周期，同时对食醋的风味与质量也有显著的提升作用。
氨基酸是食用醋中极为重要的营养成分，同时也是食醋鲜味的重要来源，其含量的高低可直接影响食醋的质量[6-7]。酒糟中含有大量未被利用的蛋白质[8]，因此在酒糟中添加酸性蛋白酶，使其分解产生游离氨基酸，不仅解决了酒糟中营养物质利用不充分的问题，实现了酿酒次产物的再利用，同时还可以增加食醋中的氨基酸含量，提升其鲜味和营养价值。
本研究利用糖化酶和酸性蛋白酶分解酒糟中的淀粉与蛋白质，并将其与酒尾、黄水混合发酵来生产食醋。通过解析不同生产因素对于混合酿醋品质和产率的影响，对生产工艺参数进行了优化，使得混合酿造食醋在醋酸含量与营养价值等方面均有一定提高。为有效处理酿酒副产物，同时得到高价值的食醋，实现变废为宝提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
小曲清香型白酒酒糟、酒尾、黄水：醉清风酒业股份有限公司；醋酸杆菌（Acetobacter）：本实验室保藏菌种；糖化酶（酶活100 000 U/g）、蛋白酶（酶活50 000 U/g）：河南万邦实业有限公司；粮食酿造食醋、糠壳、玉米粉：市售。
氢氧化钠、酚酞、酒石酸钾钠、硫酸铜、碘等（均为分析纯）：国药集团化学试剂有限公司。
1.2 仪器与设备
FA2204C电子分析天平：上海天美天平有限责任公司；752N紫外可见分光光度计：上海仪电分析仪器有限公司；L-2000高效液相色谱仪：日本日立公司；LRH-100A恒温培养箱：广东泰宏君科学仪器股份有限公司；HH-S11.6恒温水浴锅：江苏金怡仪器科技有限公司；FE28电子pH计：梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；852A磁力搅拌器：苏州赛恩斯仪器有限公司。
1.3 方法
1.3.1 酒糟与酒尾、黄水混合酿醋操作要点
将新鲜酒糟于85 ℃烘干8 h，并将烘干结束后的酒糟粉碎至颗粒直径为1.5～2 mm左右。将初步粉碎后的酒糟蒸煮30 min左右，水浴冷却至35 ℃后加入一定量的糖化酶与酸性蛋白酶，待淀粉与蛋白质分解完成后，加入酒尾、黄水补充至一定酒精度，接种一定量的醋酸菌在一定温度条件下进行醋酸发酵，至酸度停止增加后进行挤压粗过滤，粗过滤完成后进行精细膜过滤（过滤孔径为0.22 μm）。同时利用巴氏杀菌（75 ℃、15 min），杀菌结束后制得成品醋。
1.3.2 淀粉与蛋白质酶解条件优化
蛋白酶添加量的影响：将酒糟蒸煮灭菌后分别添加300 U/g的糖化酶与30 U/g、60 U/g、90 U/g、120 U/g与150 U/g的酸性蛋白酶，40 ℃酶解8 h。
糖化酶添加量的影响：将酒糟蒸煮灭菌后分别添加100U/g、200U/g、300U/g、400U/g、500U/g的糖化酶与120U/g酸性蛋白酶，40 ℃酶解8 h。
酶解温度的影响：将酒糟蒸煮灭菌后分别添加400 U/g的糖化酶与120 U/g的酸性蛋白酶，分别于25 ℃、30 ℃、35 ℃、40 ℃、45 ℃酶解8 h。
酶解时间的影响：将酒糟蒸煮灭菌后添加400 U/g的糖化酶与120 U/g的酸性蛋白酶，35 ℃分别酶解4 h、6 h、8 h、10 h、12 h。
1.3.3 醋酸发酵条件优化
（1）醋酸发酵条件优化单因素试验
初始酒精度对醋酸产量的影响：利用上述工艺酿醋，添加酒尾、黄水，使酒精度分别为5%vol、6%vol、7%vol、8%vol、9%vol，接种3%醋酸菌，于30 ℃条件下开始醋酸发酵，分析初始酒精度对醋酸产量的影响。
发酵温度对醋酸产量的影响：利用上述工艺酿醋，添加酒尾、黄水，使酒精度为6%vol，接种3%醋酸菌，分别在26 ℃、28 ℃、30 ℃、32 ℃、34 ℃条件下开始醋酸发酵，分析发酵温度对醋酸产量的影响。
醋酸菌接种量对醋酸产量的影响：利用上述工艺酿醋，添加酒尾、黄水，使酒精度为6%vol，分别接种原料质量1%、2%、3%、4%、5%的醋酸菌活化菌液，于28 ℃条件下开始醋酸发酵，分析醋酸菌接种量对醋酸产量的影响。
（2）醋酸发酵条件优化响应面试验
在单因素试验的基础上，以醋酸产量（Y）为响应值，选择初始酒精度（A）、发酵温度（B）、醋酸菌接种量（C）为3个自变量，采用Design-Expert 8.0.6软件设计响应面分析试验对醋酸发酵条件进行优化。Box-Behnken试验设计因素与水平见表1。
表1 醋酸发酵条件优化Box-Behnken试验设计因素与水平
Table 1 Factors and levels of Box-Behnken experiment for acetic acid fermentation conditions optimization
1.3.4 测定方法
蛋白质含量：使用考马斯亮蓝法测定[9]；氨基酸态氮含量：使用甲醛滴定法测定[10]；还原糖含量：采用斐林试剂法测定[11]；淀粉含量：使用酸水解法测定[12]；醋酸含量（以乙酸计）：利用酸碱滴定法测定[13]；游离氨基酸含量：使用高效液相色谱法测定[14]；酒精度：使用酒度计检测。
1.3.5 数据处理
每个试验重复3次，使用Excel 2019软件计算误差值，数据表示为“平均值±标准差”。使用Origin 2016软件进行绘图。
2 结果与分析
2.1 酒糟与酒尾、黄水营养成分分析
酒糟与酒尾、黄水中均含有大量的营养成分，其中酒尾、黄水中还含有一定量的酒精，这是其可以被生产再利用的基础，酒糟与酒尾、黄水营养成分含量见表2。由表2可知，酒糟中的主要成分为蛋白质、淀粉、还原糖等，淀粉含量达到16.23%，蛋白质含量达到22.41%，其中淀粉可以被分解为还原糖，是酵母、醋酸菌生长繁殖的基础营养物，蛋白质可被分解为游离氨基酸，成为衡量食醋质量的重要指标。酒尾、黄水则以酒精和氨基酸态氮为主，相比干酒糟，酒尾、黄水中酒精度较高，分别为24.85%vol和10.43%vol，通过调配可保持适宜醋酸菌产酸的初始酒精度；黄水中还含有还原糖、氨基酸态氮等酿醋原料物质。综合而言，酒糟、酒尾、黄水均为优质的酿醋生产原料[15]。
表2 酒糟、酒尾和黄水的组成成分
Table 2 Composition of distiller's grains,distillate tail and Huangshui
注：n.d表示含量未被检测出。
2.2 淀粉与蛋白质酶解条件优化
由2.1的结果可知，酒糟中含有部分淀粉和蛋白质，具有较高营养价值，但蛋白质与淀粉难以被醋酸菌等微生物直接利用。因而应将其转化成为易于微生物利用的还原糖和小分子肽。为尽可能的利用酒糟中残余的营养成分，提升酒糟的利用率，需要探究分解淀粉和蛋白质的最优工艺条件，因此分别研究了糖化酶、蛋白酶添加量、酶解温度和酶解时间对淀粉与蛋白质酶解的影响。
糖化酶和蛋白酶添加量对淀粉与蛋白质酶解效果的影响见图1。
图1 糖化酶、蛋白酶添加量对还原糖（a）及氨基酸态氮（b）含量的影响
Fig.1 Effect of glycosylase and protease addition on contents of reducing sugar (a) and amino acid nitrogen (b)
由图1可知，酶用量与酒糟中蛋白质与淀粉分解效果呈正相关，当糖化酶和蛋白酶达到400 U/g、120 U/g时，酒糟中还原糖与氨基酸态氮含量分别为77.3 g/kg、12.1 g/kg，添加量继续增加时，还原糖与氨基酸态氮含量增加速度显著变缓，结合经济与分解效果，确定糖化酶用量为400 U/g，蛋白酶用量为120 U/g。
酶解温度、酶解时间对还原糖及氨基酸态氮含量的影响见图2。
图2 酶解温度（a）、酶解时间（b）对还原糖及氨基酸态氮含量的影响
Fig.2 Effect of enzymatic hydrolysis temperature (a) and time (b) on contents of reducing sugar and amino acid nitrogen
由图2可知，当酶解温度较低时，酶活性较低，反应不充分，而当酶解温度较高时，也会导致部分酶类失活[16]。糖化酶反应的适宜温度为40 ℃，而蛋白酶的适宜温度为35 ℃，但糖化酶在35 ℃、40 ℃的温度下活性相差较小，因此选择35 ℃作为适宜的酶解温度。而酶解时间则与分解效果呈正相关，酶解时间10 h时，酒糟中还原糖与氨基酸态氮含量较高，分别为83.3 g/kg与12.9 g/kg；但当酶解时间过长时，微生物生长繁殖会消耗营养成分，造成氨基酸态氮含量略微下降。因此，选择10 h的分解时间较为适宜。
综上所述，确定淀粉与蛋白质酶解条件为糖化酶添加量400U/g，蛋白酶添加量120U/g，35℃条件下酶解10h。此时原料分解后还原糖含量达83.3g/kg，氨基酸态氮含量达12.9g/kg。
2.3 醋酸发酵条件优化单因素试验
2.3.1 初始酒精度对醋酸产量的影响
不同初始酒精度对醋酸产量的影响见图3。由图3可知，随初始酒精度升高，醋酸产量呈先升高后降低的趋势；当初始酒精度为6%vol时，醋酸产量最高，为41.28 g/L；初始酒精度较低时，醋酸产量也较低，这是由于酒精作为醋酸菌生成醋酸的主要原料，其含量低会导致原料不足，故而醋酸生成量较低，而过高的酒精度则会抑制醋酸菌的生长繁殖，同样影响醋酸的形成[18]。因此，选择初始酒精度为6%vol进行后续试验。
图3 初始酒精度对醋酸产量的影响
Fig.3 Effect of initial ethanol content on acetic acid yield
2.3.2 发酵温度对醋酸产量的影响
发酵温度是影响醋酸产量的另一关键因素，不同发酵温度对于醋酸产量的影响见图4。由图4可知，随发酵温度的升高，醋酸产量亦呈先升高后降低的趋势，当发酵温度为28 ℃时，醋酸产量最高，为45.67 g/L。醋酸菌作为温度敏感菌，过高的发酵温度会严重影响菌种生长，甚至造成菌种死亡，无法生成产物，而较低的温度则会导致其活性极低，即醋酸菌的繁殖代谢陷于停滞，因此保持适宜的温度对于醋酸生成极为重要[19]。因此，选择发酵温度为28 ℃进行后续试验。
图4 发酵温度对醋酸产量的影响
Fig.4 Effect of fermentation temperature on acetic acid yield
2.3.3 醋酸菌接种量对醋酸产量的影响
醋酸菌是食醋酿造的主要菌种，在有氧条件下，醋酸菌以乙醇、还原糖等为主要原料，生长代谢并形成醋酸。不同醋酸菌接种量对于醋酸产量的影响如图5所示。由图5可知，随醋酸菌接种量的增加，醋酸产量同样呈先升高后降低的趋势，当醋酸菌接种量为4%时，醋酸的产量出现峰值，说明此接种量较为适宜乙酸的形成，产量为48.12 g/L。醋酸接种量较低时，会导致其繁殖代谢速率降低，进而增加延滞期，使得生成乙酸的时间也随之延长。当接种量过高也会导致醋酸菌过早衰老，甚至自溶，进而造成乙酸产量的下降[20-21]。因此，选择醋酸菌接种量为4%进行后续试验。
图5 醋酸菌接种量对醋酸产量的影响
Fig.5 Effect of inoculum of acetic acid bacteria on acetic acid yield
2.4 醋酸发酵工艺优化响应面试验
醋酸发酵条件优化Box-Behnken试验设计与结果见表3，方差分析见表4。
表3 醋酸发酵条件优化Box-Behnken试验设计与结果
Table 3 Design and results of Box-Behnken experiment for acetic acid fermentation conditions optimization
表4 回归模型方差分析
Table 4 Variance analysis of regression model
注：“*”表示对结果影响显著（P＜0.05）；“**”表示对结果影响极显著（P＜0.01）。
将初始酒精含量（A）、发酵温度（B）和醋酸菌接种量（C）与响应值（Y）进行回归拟合，得到影响混合酿造食醋中醋酸含量的回归方程：
由表4可知，该试验构建的混合酿造食醋醋酸产量模型极显著（P＜0.01），同时失拟项不显著（P＞0.05），说明此方程模型具有统计学意义。分析不同因素对醋酸产量的影响发现，一次项B、C，二次项A2、B2、C2，交互项AB、AC对醋酸含量的影响均达到极显著水平（P＜0.01）；一次项A、交互项BC对醋酸含量影响达到显著水平（P＜0.05）。分析F值可知，各因素对醋酸含量的影响程度为发酵温度＞醋酸菌接种量＞初始酒精度。
各因素交互作用对醋酸产量影响的响应曲面和等高线见图6。响应面图越陡峭、等高线图越接近椭圆，说明两因素间交互作用对醋酸产量的影响越大。由图6可知，交互项AB、AC的等高线形状最接近椭圆，对醋酸产量的影响较大；而BC的形状则接近圆形，对醋酸产量有一定影响，这与表4的结论一致。
图6 各因素间交互作用对醋酸产量影响的响应曲面和等高线
Fig.6 Response surface plots and counter lines of effects of interaction between each factor on acetic acid yield
对于混合酿造食醋而言，醋酸作为食醋在发酵过程中的主要产物，是决定食醋质量与产量的最关键因素，提升食醋醋酸含量，不仅可以确保产品质量，同时亦能增加产量[22-23]。当初始酒精度为6.03%vol、发酵温度为28.38 ℃、醋酸菌接种量为3.95%时，醋酸的理论产量达到最大值为48.43 g/L；为便于实际生产，修正发酵条件为初始酒精度6.0%vol、发酵温度28.4 ℃，醋酸菌接种量4.0%，在此条件下实际醋酸产量为48.32 g/L，两者差距较小，说明该模型具有较好的准确性。
2.5 混合酿造醋与粮食酿造醋比较
游离氨基酸对于增加酿造食醋的鲜味具有显著意义，可提升酿造食醋的品质[24-25]。利用2.4中确定的混合酿醋最佳生产工艺，生产混合酿造醋，与粮食酿造醋部分理化指标的对比结果见表5。
表5 酒糟混合酿造醋与粮食酿造醋部分理化指标对比
Table 5 Comparison of some physicochemical indexes between distiller's grains mixed brewing vinegar and grain brewing vinegar g/L
注：“**”表示差异极显著（P＜0.01）。
由表5可知，混合酿造食醋中的醋酸与游离氨基酸含量分别为48.32 g/L、34.26 g/L，均极显著高于粮食酿造醋（P＜0.01）。说明利用酒糟、黄水、酒尾混合酿醋可显著提升醋酸和游离氨基酸含量。
3 结论
酒糟、黄水、酒尾作为酿酒过程中的重要副产物，由于其中含有大量的糖类、蛋白质、酒精、酸类物质和风味物质，是酿造食醋的绝佳原料。因此采用混合酿造食醋工艺，通过添加酶类分解原料中的营养成分，在此基础上添加酒尾、黄水补充酒精进行醋酸发酵。并通过单因素、响应面试验对醋酸发酵条件进行优化。结果表明，淀粉与蛋白质分解条件为糖化酶用量400 U/g，蛋白酶用量120 U/g，35 ℃条件下酶解10 h；醋酸发酵条件为添加酒尾、黄水使初始酒精含量6.0%、发酵温度28.4 ℃、醋酸菌接种量4.0%。利用上述工艺生产混合酿造醋，其醋酸含量达到48.32 g/L，游离氨基酸总量达到34.26 g/L。与传统粮食酿造醋相比，品质提升较为显著。由此可得，利用酒糟等混合酿造食醋能够实现酿酒废弃物资源化高效利用，是合理解决白酒副产物的有效方式。
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