刺梨（Rosa roxburghii）是蔷薇科多年生落叶灌木缫丝花的果实，生长在海拔500～2 500 m的地区，分布于陕西、甘肃及西南（云贵川）等地区，其中贵州所产刺梨最为出名[1]。刺梨果肉中含有维生素C、P、B1、B2、K1等16种维生素，其中维生素C含量是苹果、梨等的500倍，维生素P含量是柑橘的120倍[2]。除此之外，刺梨还含有丰富的黄酮、有机酸、多糖、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、多酚、三萜类、甾醇等生物活性物质，具有增强机体免疫力[3]、预防动脉粥样硬化[4]、抗疲劳[5-6]、α-葡萄糖苷酶抑制活性[7]、促消化[8]等多种功效。
刺梨具有药食两用属性，应用前景广阔，但是刺梨产品的开发和加工技术还处于初级阶段，精深加工产品较少[9-10]。这与其独特的酸涩感和刺梨鲜果较短的收获期[11]有关。目前，刺梨酒类产品研究多以刺梨果酒为主，深加工产品单一，刺梨多用于制成果汁、冲泡茶片、果脯类产品，对刺梨附加值提升有限。
白兰地是以葡萄或其他水果为原料，经发酵、蒸馏、陈酿、调配而成的蒸馏酒，酒精度一般为40%vol～43%vol[12]。本研究以刺梨汁为原料酿造刺梨酒，并经过蒸馏制备刺梨白兰地，考察发酵初始糖度、酵母菌添加量、发酵温度及初始pH对刺梨酒酒精度、总酸含量的影响，通过单因素试验及响应面试验优化刺梨酒发酵工艺。刺梨白兰地的开发旨在丰富刺梨深加工产品，增加刺梨产品附加值，促进刺梨产业发展。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
刺梨清汁（可溶性固形物含量7.85%，总酸含量12.25g/L，还原糖含量46 g/L）：贵州省六盘水市某公司；RW果酒酿造酵母：安琪酵母有限公司；果胶酶（酶活40 000 U/g）、纤维素酶（酶活10 000 U/g）：索莱宝生物科技有限公司；白砂糖（食品级）：市售；柠檬酸、碳酸钾（均为分析纯）：山东潍坊英轩实业有限公司。其他试剂均为国产分析纯。
1.2 仪器与设备
FA2004N精密电子天平：上海菁海仪器有限公司；DFD-700恒温水浴锅、6202高速粉碎机：常州澳华仪器有限公司；SPX-250B生化培养箱：上海琅玕实验设备有限公司；SB-400DTY型超声波清洗器：宁波新芝生物科技股份有限公司；722S可见分光光度计：上海菁华科技仪器有限公司；ZD-2A型自动电位滴定仪：上海大普仪器有限公司。
1.3 方法
1.3.1 刺梨白兰地加工工艺流程及操作要点
操作要点：
原料的筛选及预处理：选取无腐烂、病虫害，果实大、肉厚，充分成熟的新鲜刺梨，使用蒸馏水进行表面清洗后沥干，置于高速粉碎机中粉碎至果皮完全破裂。
酶解：向粉碎后的刺梨果浆中加入100 mg/L偏重亚硫酸钾和质量分数0.5%的柠檬酸，再加入0.05%的果胶酶与0.1%纤维素酶，50 ℃条件下酶解40 min[13-14]，用100目、80目过滤袋过滤两次，取滤液得到刺梨清汁。
酸度、糖度调节：使用柠檬酸和碳酸钾调节刺梨清汁的初始pH值，使用白砂糖调节刺梨清汁的初始糖度。
酵母活化：称取10.0 g酵母粉溶解于100 mL、35 ℃温水中，静置20 min进行活化[15]。
接种发酵：将活化后的酵母按照一定接种量加入刺梨清汁中充分混匀，转入不锈钢发酵罐内，每罐5 L（装液量不超过总体积的60%），在一定温度下恒温发酵，当发酵液残糖＜6 g/L时视为发酵结束[16-17]。
蒸馏：将过滤获得的猕猴桃酒置入蒸馏装置中，采用二次蒸馏法：一次蒸馏温度约95 ℃，收集10%vol～70%vol酒精度的蒸馏酒。二次蒸馏收集30%vol～70%vol酒精度的蒸馏酒，剩余的酒头与酒尾与预蒸馏的原酒混合，重复蒸馏[18-19]。
陈酿：将蒸馏酒放入储酒桶中满罐密封，于室温下（约25 ℃）陈酿45 d [20]，即得刺梨白兰地。
1.3.2 分析检测
还原糖含量的测定：采用3,5-二硝基水杨酸法[21]；总酸含量的测定：参照国标GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》中的电位滴定法[22]；酒精度的测定：参照国标GB/T 11856—2008《白兰地》中的酒精计法[23]；可溶性固形物含量的测定：参照国标GB/T 12143—2008《饮料通用分析方法》中的折光计法[24]。
1.3.3 刺梨酒发酵工艺优化
（1）单因素试验
初始糖度的确定：固定酵母添加量为600 mg/L，初始pH值为3.4，添加白砂糖调整刺梨清汁糖度分别为：18°Bx、20°Bx、22°Bx、24 °Bx、26 °Bx，在发酵温度26 ℃条件下发酵7 d。定期测定其总酸含量、酒精度，考察不同初始糖度对刺梨酒发酵的影响。
初始pH值的确定：固定酵母添加量为600 mg/L，用柠檬酸和碳酸钾调节初始pH值分别为：3.0、3.2、3.4、3.6、3.8，调糖至22°Bx，在发酵温度26 ℃条件下发酵7 d。定期测定总酸含量、酒精度，考察不同初始pH值对刺梨酒发酵的影响。
发酵温度的确定：固定酵母添加量为600 mg/L，初始pH值为3.4，调糖至22°Bx，在发酵温度分别为：22 ℃、24 ℃、26 ℃、28 ℃、30 ℃条件下发酵7 d。定期测定其总酸含量、酒精度，考察不同发酵温度对刺梨酒发酵的影响。
酵母添加量的确定：固定初始pH值为3.4，调糖至22°Bx，酵母添加量分别为：200mg/L、400mg/L、600mg/L、800mg/L、1 000 mg/L，在发酵温度26 ℃条件下发酵7 d。定期测定其总酸含量、酒精度，考察不同酵母添加量对刺梨原料酒发酵的影响。
（2）响应面试验
在单因素试验基础上，根据Box-Behnken试验设计，以初始糖度（A）、酵母添加量（B）、初始pH值（C）、发酵温度（D）四个单因素为自变量，以酒精度（Y）为响应值，Box-Behnken试验设计因素与水平见表1。
表1 Box-Behnken试验设计因素与水平
Table 1 Factors and levels of Box-Behnken experiments design
1.3.4 数据处理
每组试验设置3个平行，采用Excel 2016、Origin 2018、SPSS 19.0、Design-Expert 11.0等相关软件进行绘图及数据分析。
2 结果与分析
2.1 刺梨酒发酵工艺优化单因素试验
2.1.1 不同初始糖度对刺梨酒发酵的影响
由图1a和图1b可知，五组样液均在第4天之后趋于平稳，初始糖度为22°Bx原料酒在发酵结束时酒精度最高为9.97%vol，发酵前期速率较其他4组快，且残糖量较低；初始糖度为18°Bx、20°Bx两组样液发酵至4 d基本结束，溶液中还原糖未被充分利用，发酵结束后酒精度较其他三组样液低，原因是糖类物质偏低使得酵母菌后期生长所需碳源物质不足，酵母菌衰亡使得发酵速率下降；初始糖度为24°Bx、26°Bx前期发酵速率较慢，发酵结束后酒精度分别为9.60%vol、8.99%vol，可能是由于溶液渗透压偏高，酵母菌生长受到抑制所导致。由图1c可知，初始糖度对发酵过程中总酸含量的影响不大。综上，选取初始糖度20 °Bx、22°Bx、24°Bx进行响应面试验。
图1 不同的初始糖度对刺梨酒酒精度（a）、残糖量（b）及总酸含量（c）的影响
Fig.1 Effect of different initial sugar contents on alcohol content (a),residual sugar contents (b) and total acid contents (c) of Rosa roxburghii wine
2.1.2 不同初始pH值对刺梨酒发酵的影响
由图2a和图2b可知，五组样液发酵前4 d还原糖被酵母菌消耗速率快，发酵液酒精度上升速率也较快，发酵至6～7 d基本停止发酵。初始pH值为3.6时，样液残糖量最低，酒精度最高，分别为6.43 g/L、10.39%vol。初始pH值为3.0时，残糖量最高，酒精度也较低，分别为13.58 g/L、9.90%vol，其原因是由于低pH的环境会抑制酵母生命活动。由图2c可知，发酵过程中，总酸含量总体呈上升-下降-上升的波动趋势，并且发酵结束时与发酵初的总酸含量相差不大，这是因为发酵后期微生物代谢活动都比较缓慢，产酸减少，同时微生物也在将酸不断地转化成酯、醛、酮等其他物质并加以利用，使得总酸含量略有降低。综上，选取初始pH值为3.4、3.6、3.8进行响应面试验。
图2 不同的初始pH值对刺梨酒酒精度（a）、残糖量（b）及总酸含量（c）的影响
Fig.2 Effect of different initial pH on alcohol content (a),residual sugar contents (b) and total acid contents (c) of Rosa roxburghii wine
2.1.3 不同发酵温度对刺梨酒发酵的影响
由图3a和图3b可知，发酵温度为30 ℃的样品，在前3 d酒精度上升最快，但到达第4天样液酒精度趋于平衡，这是由于发酵温度过高，酵母菌前期急剧生长，消耗的糖类物质不能完全转换为酒精，发酵不平稳导致，并且酵母菌衰亡期也提前到来，导致最终酒精度只有9.83%vol；而发酵温度22 ℃、24 ℃两组相比发酵温度26 ℃、28 ℃两组发酵速率降低，酵母菌活性和发酵结束时酒精度较低，同时残糖量偏高。发酵温度26 ℃组样液，发酵液酒精度上升速率和残糖量消耗速率趋于平稳，最终发酵液酒精度为10.11%vol，发酵较其他几组彻底。由图3c可知，发酵结束时总酸含量与初始发酵液相差不大，大多在1.0 g/L范围内波动。综上，选取发酵温度24 ℃、26 ℃、28 ℃进行响应面试验。
图3 不同的发酵温度对刺梨酒酒精度（a）、残糖量（b）及总酸含量（c）的影响
Fig.3 Effect of different fermentation temperature on alcohol content(a),residual sugar contents (b) and total acid contents (c) of Rosa roxburghii wine
2.1.4 不同酵母菌添加量对刺梨酒发酵的影响
由图4a和图4b可知，五组样液在发酵至第4 天酒精度趋于平缓，酵母添加量200 mg/L、400 mg/L两组样液酒精度较低，这是因为酵母菌添加量过少，糖类物质消耗不完全。酵母添加量为600 mg/L、800 mg/L、1 000 mg/L三组样液在发酵前期酒精度上升速率较快，且酒精度随着酵母添加量逐渐减小，这是因为酵母添加量过高，酵母菌利用糖类物质和其它养分，主要产生呼吸作用，产酒底物减少，导致产酒量少[25-26]。由图4c可知，原料酒的总酸含量呈现先上升后下降的趋势，这可能是由于发酵前4 d 微生物处于快速生长繁殖阶段，其代谢活动剧烈，使总酸含量快速上升[27]。发酵至第7天原料酒总酸含量与发酵0 d 原料酒变化不大均在1 g/L范围内波动。酵母添加量过少易使发酵不充分，酵母接种量过多易使发酵过快，从而导致酒精度下降、还原糖含量升高，直接影响酒的品质。综上，选取酵母添加量400 mg/L、600 mg/L、800 mg/L进行响应面试验。
图4 不同的酵母添加量对刺梨酒酒精度（a）、残糖量（b）及总酸含量（c）的影响
Fig.4 Effect of different yeast addition on alcohol content (a),residual sugar contents (b) and total acid contents (c) of Rosa roxburghii wine
2.2 刺梨酒发酵工艺优化响应面试验
在单因素试验基础上，根据Box-Behnken试验设计，以酒精度（Y）为响应值，利用Design-Expert 11.0软件设计出29组试验，Box-Behnken试验设计及结果见表2，方差分析结果见表3。
表2 Box-Behnken试验设计及结果
Table 2 Design and results of Box-Behnken experiments
表3 回归模型方差分析
Table 3 Variance analysis of regression model
注：“**”表示对结果影响极显著（P＜0.01）；“*”表示对结果影响显著（P＜0.05）。
利用Design-Expect 11.0对表2结果进行分析，得到回归方程如下：
方差分析中3种因素对不同因变量影响的显著性由F检验判断，P值越小表明因素对因变量影响显著程度越高。由表3可知，模型P值=0.004＜0.01，极显著，失拟项P值=0.079 2＞0.05，不显著。决定系数R2=0.818 4，调整决定系数
=0.636 8，证明该回归模型方程拟合度较好，误差小，该模型准确，可行性高，能用于本试验预测分析。由P值可知，一次项A、C以及二次项C2对刺梨酒中酒精度影响显著（P＜0.05）；一次项D以及二次项A2、B2、D2对刺梨酒中酒精度影响极显著（P＜0.01）。由F值可知，4个因素对结果影响顺序为D＞A＞C＞B。
2.3 响应面分析
响应面图可以比较直观地表现出两变量对因变量的影响关系，其中，三维图的曲面坡度越陡峭则各因素对响应值的影响越大，表明两变量之间的交互作用显著[28-29]。发酵温度、初始糖度、酵母添加量、初始pH值间相互作用对酒精度影响的响应面及等高线见图5。
图5 各因素间交互作用对刺梨酒酒精度影响的响应面及等高线
Fig.5 Response surface plots and contour lines of effect of interaction between various factors on alcohol content of Rosa roxburghii wine
由图5可知，初始糖度和酵母添加量（AB）、初始pH值和初始糖度（AC）、发酵温度和初始糖度（AD）、发酵温度和酵母添加量（BD）的响应面图坡度趋势陡峭，等高线趋于椭圆形，表明这四组交互作用对酒精度影响较大，这与方差分析结果一致。
2.4 验证试验
利用软件Design-Expert 11.0对回归方程进行计算，得到刺梨酒最佳发酵工艺条件为：初始糖度22.378°Bx，酵母菌添加量610 mg/L，发酵温度26.382 ℃，初始pH值为3.55。在此条件下通过方程求解得到刺梨酒酒精度预测值为10.562%vol。因实际操作存在局限，故将最佳发酵工艺条件调修正为初始糖度22°Bx、酵母菌添加量610 mg/L、发酵温度26 ℃、初始pH 值为3.6。在此优化条件下进行3次平行验证试验，得到刺梨酒酒精度实际值为10.35%vol。实际值和预测值拟合度高，具有实际意义。
3 结论
本研究采用单因素试验及响应面试验，优化刺梨汁白兰地原料酒的发酵工艺条件，确定了刺梨汁白兰地原料酒最佳发酵条件为：初始糖度为22°Bx、酵母菌添加量610mg/L、发酵温度26 ℃、初始pH值为3.6。在该优化条件下，得到刺梨酒酒精度为10.35%vol。刺梨原料酒经过蒸馏、调配后得到酒精度为43%vol的刺梨白兰地。
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