骏枣（Zizyphus jujube Mill）是鼠李科（Rhamnaceae）植被枣树的成熟果实，富含膳食纤维、蛋白质、脂肪、碳水化合物等营养功能成分[1]，早在2500多年前被《神农本草》记载为药食同源果品，具有免疫调节、抗氧化、抗肿瘤等作用[2]。新疆骏枣凭借多方优势不断扩大种植，截至2021年，骏枣产量约占全国总产量的50%，成为我国骏枣的主产区，但新鲜骏枣保质期较短且易腐烂变质，目前骏枣加工以原枣加工和粗加工为主，精深加工产品占比较低而不具备竞争优势[3]。因此，充分利用骏枣种植资源优势，研究和开拓骏枣下游产品，利用新技术新方法研究开发具有保健功能的骏枣产品，并最大限度发挥其保健作用和延长贮藏期就显得极其重要。
酵母菌是一类利用碳水化合物发酵的兼性厌氧真菌，广泛存在于水果、蔬菜表皮，低醇饮料及葡萄酒等发酵制品中[4]。骏枣汁中富含糖类、维生素、多酚等多种天然营养物质及生物活性成分，是酵母菌发酵的理想基质[5]。已有研究表明，酵母菌发酵对果蔬汁的生物活性物质的含量和组成、功能性成分及风味等方面均有积极作用。利用梅山高活性干酵母发酵枸杞汁，使其具有更高的抗氧化超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性，通过降低细胞内胆固醇和甘油三酯水平，从而表现出较强的降糖降脂以及酒精性肝损伤的保护作用[4]。而德尔布有孢圆酵母（Torulaspora delbrueckii）发酵红枣酒精饮料促进了乙醇、甲酯、乙酯和异戊酯的产生，提高了香气的复杂性[6]。青梅汁经酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）发酵能增加产品中总酚的含量，降低皂苷含量，使抗氧化能力增强[7]。BARAK T H等[8]研究发现，枣浆具有显著的抗氧化活性，同时体外抗氧化活性实验表明，抗氧化酶能够抵御运动中产生的自由基，从而降低机体脂质过氧化水平，这说明骏枣果实具有抗氧化活性且具备抗疲劳能力。虽然对骏枣的研究较多，但关于骏枣汁抗氧化活性和生物活性化合物的报道却很少。为此，作为骏枣的深加工产物，评价骏枣汁抗氧化能力和生物活性成分就显得十分必要。
本研究以骏枣（干枣）为原料，选用市售应用较广泛的酿酒酵母（Saccharomycescerevisiae）BV818对骏枣汁进行发酵，研究酵母菌对骏枣汁发酵前后营养、风味及抗氧化能力的影响，以期为骏枣发酵汁工艺改良和品质提升提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
骏枣（干枣）：市售；酿酒酵母BV818：安琪酵母股份有限公司；柠檬酸（分析纯）、2-辛醇（1 000 μg/L）（色谱级）：上海麦克林生化科技有限公司；黄原胶、羧甲基纤维素钠（食品级）：淄博中轩生化有限公司；2,2'-联氮-双（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二铵盐（2,2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) diammonium salt，ABTS）、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；芦丁（纯度＞98%）、没食子酸（纯度＞98%）标品：成都普思生物科技股份有限公司。
1.2 仪器与设备
LC-DR-32B数显折射仪：上海力辰邦西仪器科技有限公司；pHS-3C型pH计：上海仪电科学仪器股份有限公司；T9S双光束紫外可见分光光度计：北京普析通用仪器有限责任公司；F50胶体磨：沈阳航天新光超微粉碎机械有限公司；GJJ高压均质机：上海诺尼轻工机械有限公司；e2695 高效液相色谱仪：美国Waters公司；WSC-S测色色差计：上海仪电物理光学仪器有限公司；顶空固相微萃取装置、DVB/CAR/PDMS萃取头（50/30 μm）：美国Supelco公司；8890-7000D气相色谱三重四级杆质谱联用仪（配有HP-INNOWax色谱柱（30m×250μm×0.25μm））：美国安捷伦科技有限公司。
1.3 方法
1.3.1 发酵骏枣汁的制备工艺流程及操作要点[9]
骏枣→去核清洗→打浆→调配→灭菌→接种酵母→控温发酵→添加稳定剂→均质灭菌→成品
操作要点：
原料预处理：挑选颗粒饱满，无虫害的成熟干制骏枣，去核后用清水漂洗干净。
打浆、调配：骏枣切块与去离子水按1∶4（g∶mL）比例打浆；用柠檬酸和去离子水调整骏枣原浆pH至4.0，白利度为11°Bx。
灭菌、冷却：68 ℃巴氏杀菌30 min后冷却至室温（25 ℃）备用。
接种酵母：接种1.0%（V/V）活化好的酵母菌至灭菌冷却至室温的骏枣浆中。
控温发酵：28 ℃恒温培养箱中发酵，每隔2 h测定残糖量变化，当发酵液中残糖量下降1°Bx时终止发酵[9]。
添加稳定剂：发酵结束的饮料中加入0.12%（V/V）黄原胶和0.09%（V/V）羧甲基纤维素钠，用胶体磨和均质机研磨后得到骏枣发酵汁。
灭菌装瓶：105 ℃杀菌20 min，分段冷却，于-80 ℃冰箱保存待测。将未接种酵母菌的骏枣汁置于相同条件下作为对照。
1.3.2 理化指标测定
可溶性固形物含量：使用数显折射仪测定；酒精度：参照GB 5009.225—2016《酒中乙醇浓度的测定》中的酒精计法[10]；pH值：采用pH计测定；总酸含量：参照GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》中的直接滴定法测定[11]；有机酸（乳酸、苹果酸、酒石酸和柠檬酸）含量：采用高效液相色谱法进行测定[12]；颜色参数：使用WSC-S测色色差计进行测定（L*值表示明度，a*值表示红度，b*值表示黄度）。总酚含量：使用福林-酚比色法测定[13]；总黄酮含量：采用亚硝酸钠-硝酸铝显色法测定[14]。
1.3.3 抗氧化活性的测定
总抗氧化能力：使用铁离子还原能力（ferric-reducing antioxidant power，FRAP）法；DPPH自由基清除能力：参考SARASWAT I等[15]的方法测定，ABTS+自由基清除能力：参考WOUDYLO A等[16]的方法测定。
1.3.4 挥发性化合物测定方法
样品前处理：移取5 mL样品，加入1 g NaCl于50 ℃平衡20 min，萃取30 min，将萃取头于250 ℃的条件下解吸5 min。
气相色谱条件[17]：起始温度40 ℃保持2 min，然后以3 ℃/min升至85 ℃，再以1 ℃/min升至105 ℃，然后以3 ℃/min升至180 ℃，保持3 min，最后以10 ℃/min升至230 ℃，保持5 min。载气为高纯氦气（He），压力7.069 9 psi，不分流，溶剂延迟3 min。
质谱条件：电子电离（electron ionization，EI）源，电子能量70 eV；离子源温度230 ℃；质量扫描范围30～350 m/z。
定性定量方法：对总离子流色谱图中各峰经质谱系统检索及美国国家标准技术研究所（national institute of standards and technology，NIST）数据库比对，综合保留时间、保留指数及标准谱图等参数进行定性，用峰面积归一法计算定性物质相对含量。
以相对气味活度值（relative odor activity values，ROAV）为指标，测定发酵前后特征香气化合物。若某化合物ROAV≥1，表明其对样品风味有贡献，为骏枣汁中关键风味化合物，其中ROAV=挥发性化合物相对含量/气味阈值[18]。
1.3.5 数据分析
运用SPSS 26.0、SMICA 14进行数据相关性计算与分析，P＜0.05表明差异显著。采用Origin 2022软件绘图。挥发性风味物质结果应用仪器自带LAV软件进行定性分析。对照组和实验组实验重复3次，最终结果取平均值。
2 结果与分析
2.1 骏枣汁发酵前后主要理化指标分析
为了评估酵母菌的发酵性能，对骏枣汁发酵前后主要理化指标进行分析，结果见表1。
表1 骏枣汁发酵前后主要理化指标变化
Table 1 Changes of main physicochemical indexes of Junzao juice before and after fermentation
注：同行不同小写字母表示差异显著（P＜0.05）。下同。
由表1可知，可溶性固形物含量由发酵前的14.00°Bx下降至发酵后的13.00°Bx，根据理论值，每1.7°Bx可溶性固形物经发酵后产生1%vol酒精，由于可溶性物中不只含有糖，发酵最终酒精度可能低于理论值[9]，在本研究中，发酵骏枣汁酒精度为0.40%vol。
发酵液的pH值和可滴定酸度作为保质期的评价指标，对发酵产品的风味品质起着至关重要的作用[19]。酒精饮料中的可滴定酸水平也被认为与酚类化合物聚合产生的棕色沉积物有关[20]。因此，其含量可以在一定程度上反映饮料的品质。在本研究中，可滴定酸含量从发酵前的1.70 g/L上升至发酵后的2.10 g/L，pH从3.90下降至3.70，说明随着酵母菌增殖不断消耗饮料中的碳源导致枣汁中糖含量下降，酵母菌利用发酵液中的乙酸生成乙酸钠，其次消耗氨基酸的羧基导致羟基相对较多，造成可滴定酸含量上升[21]。
有机酸分析表明，发酵前骏枣汁中有机酸以柠檬酸、酒石酸和苹果酸为主，苹果酸和乳酸含量在发酵后显著增加（P＜0.05），分别增加至226.00 mg/L和373.51 mg/L。发酵前骏枣汁中柠檬酸含量显著高于其他有机酸（P＜0.05），发酵后降至697.44 mg/L，这是由于其被分解成双乙酰、乳酸和乙酸等[22]，同时酒石酸含量的下降归因于酒石酸被降解，或转化为酒石酸氢钾沉淀[23]。此外，发酵前几乎不含乳酸，但经酵母菌发酵后含量达到373.51 mg/L。
发酵前后L*值、a*值和b*值均存在显著差异（P＜0.05），发酵前L*值和b*值显著高于发酵后，即发酵前骏枣汁相较于发酵后的骏枣汁呈现出较亮的黄色，而发酵后a*值显著偏高（P＜0.05），这说明枣汁经发酵后颜色偏红，这可能是因为打浆处理对骏枣的破碎程度较高，骏枣自身的色素经发酵后充分浸提到饮料中，改变了饮料的色泽。同时，发酵骏枣汁的色度值高间接说明其中花色苷的含量亦较高[24]，与发酵前相比，发酵后的骏枣汁可能具有相对较高的保健功能。
总酚（total phenol，TP）和总黄酮（total flavonoids，TF）的含量与总抗氧化能力和潜在的健康益处有关[25]。该研究结果表明，发酵骏枣汁中总酚（27.18 mg GAE/L）和总黄酮（7.90 mg RE/L）含量均显著高于未发酵骏枣汁（P＜0.05），这可能是由于酵母菌菌株的水解酶将复杂的酚类化合物水解成更简单的形式[26]，使骏枣汁总抗氧化能力显著提升（P＜0.05）。
2.2 骏枣汁发酵前后抗氧化能力分析
骏枣汁发酵前后抗氧化性变化见表2。由表2可知，发酵骏枣汁（6.82 mmol/L）FRAP显著高于（P＜0.05）发酵前（5.69 mmol/L），发酵可显著增强骏枣汁抗氧化能力。发酵骏枣汁具备最强的DPPH清除能力（80.30%）与ABTS自由基清除能力（92.32%），发酵骏枣汁ABTS+、DPPH自由基清除力分别比骏枣汁提高12.00%和15.50%，此外，DPPH自由基清除能力和FRAP还原力与总酚和类黄酮含量变化趋势相似，这可能是由于酵母菌发酵过程中通过水解作用使产品游离酚含量增加，导致产品抗氧化能力提升[27]。赵光远等[28]考察发酵过程中红枣汁抗氧化性能的变化，实验结果也证明红枣汁经发酵后提高了抗氧化能力，与本研究结论一致。
表2 骏枣汁发酵前后抗氧化性变化
Table 2 Changes of antioxidant activity of Junzao juice before and after fermentation
2.3 骏枣汁发酵前后挥发性化合物分析
骏枣汁发酵前后挥发性化合物含量的变化见表3。由表3可知，在发酵前后骏枣汁中共鉴定和定量了66种挥发性化合物（发酵前35种，发酵后49种），包括11种醇类、13种酸类、24种酯类、7种酮类、5种醛类和6种其他类化合物。发酵前后挥发性风味物质种类和含量差异较大且发酵后挥发性化合物总含量显著增加（P＜0.05）。
表3 骏枣汁发酵前后挥发性化合物含量变化
Table 3 Changes of volatile compounds content in Junzao juice before and after fermentation
续表
注：“ND”表示未检出。
酯类是主要的挥发性化合物之一，是提供理想花香和果香的关键物质[29]。从数量上看，酯是发酵骏枣汁中最丰富的挥发性化合物，且总酯类物质含量最高。其中，发现2种优势酯（辛酸乙酯和癸酸乙酯）的相对含量在发酵骏枣汁中较高，与辛酸和癸酸的含量一致，他们恰好是发酵骏枣汁中的优势酸。
随着发酵的进行，醇和酮类物质含量升高，醛类物质含量降低。醇、酮和醛类物质在骏枣汁和发酵骏枣汁中的相对含量分别为31.49%、1.52%、1.02%和38.32%、2.38%、0.28%。酮类物质能与酯类物质相互作用，协同促进发酵饮料中风味物质的醇厚感与多样性[30]。值得注意的是，发酵骏枣汁中新产生了3-羟基-2-丁酮（1.64%）和β-大马士酮（0.43%）两种酮类物质。因此，发酵骏枣汁在保留特征风味物质的同时，还产生了独特的风味物质，使产品总体风味更加浓厚和馥郁。
为了探究发酵前后挥发性风味化合物的差异，进一步对ROAV进行计算，结果见表4。由表4可知，发酵前骏枣汁中共有1种ROAV≥1的物质为苯甲酸乙酯（ROAV=3.29），发酵后骏枣汁中共有3种ROAV≥1的挥发性化合物，分别为辛酸乙酯（ROAV=24.78）、癸酸乙酯（ROAV=19.16）和月桂酸乙酯（ROAV=4.29）。
表4 骏枣汁发酵前后主要挥发性风味化合物的相对气味活度值
Table 4 Relative odor activity values of main volatile flavor compounds in Junzao juice before and after fermentation
为了进一步研究发酵前后挥发性化合物的变化，以挥发性化合物相对含量为指标，利用偏最小二乘-判别分析（orthogonal partial least squares-discriminant analysis，OPLSDA）对以上数据进行分析，结果见图1。由图1可知，发酵前后挥发性化合物被明显区分开，大部分挥发性物质与发酵骏枣汁聚集在一起，这与其较高的挥发性物质含量相一致。值得一提的是，发酵骏枣汁与大部分挥发性物质位于图的左侧，并解释了75%和100%的交叉验证方差，表明他们显著正相关（P＜0.05），说明酵母菌发酵可以显著增加骏枣汁挥发性化合物浓度以及丰富挥发性物质种类。
图1 基于挥发性风味化合物骏枣汁与发酵骏枣汁偏最小二乘-判别分析结果
Fig.1 Orthogonal partial least squares-discriminant analysis results of jujube juice and fermented jujube juice based on volatile flavor compounds
3 讨论
骏枣汁中有机酸对风味的平衡有着重要的影响，其通过影响pH值从而为最终产品带来粗糙的口感[31]。在本研究中发酵骏枣汁的总有机酸含量低于骏枣汁，说明骏枣汁经酵母菌发酵后口感更佳。柠檬酸是三羧酸循环的中间产物，在发酵过程中含量降低可能是由于酵母菌将其转化为乙醇、琥珀酸和乳酸等物质[32]。与柠檬酸相比，乳酸口感柔和，且具有防腐保鲜功效，本研究中经酵母菌发酵后乳酸含量增加，进一步说明酵母菌发酵后使得骏枣汁口感变得顺滑和柔和[33]。
发酵果蔬汁中挥发性香气化合物的含量和组成是评价果蔬汁品质的重要依据，许多研究表明，酵母菌发酵可以增加果汁中挥发性香气化合物的含量和种类。GUO J等[34]用Torulaspora delbrueckii发酵红枣汁后挥发性物质的总量较发酵前增加，促进了乙醇、甲酯、乙酯和异戊酯的产生。在本研究中，酵母菌发酵增加了骏枣汁挥发性香气化合物的种类以及醇类、酯类和酮类物质的含量。其中，3-羟基-2-丁酮和β-大马士酮是酵母菌发酵后新增加的香气化合物。3-羟基-2-丁酮能够赋予产品奶香味、焦糖味、果味等甜型香气[30]，经发酵后该物质相对含量增加，对骏枣汁特殊风味的形成具有一定的促进作用。β-大马士酮具有独特的玫瑰花香气，对产品特殊风味形成也具有较大的贡献[35]。
在检测到的醇类物质中，异戊醇和苯乙醇是主要的成分，这些已确定的由糖类或氨基酸分解代谢直接产生的醇类物质是理想香气产生的原因[36]，因此，发酵骏枣汁中较高含量的苯乙醇将有利于骏枣汁中柑橘类风味的产生。此外，具有苹果白兰地香气的异戊醇在发酵骏枣汁中高于未发酵的骏枣汁，这将加强发酵骏枣汁中的水果味和醇香。
在本研究中还检测到少量的醛、酮和酚类化合物，需要指出的是，醛类物质是重要的品种香气化合物，具体而言，苯甲醛被认为是枣中典型香气贡献最大的香气化合物[35]。本研究中发酵骏枣汁中醛类物质的含量低于骏枣汁，表明经酵母菌发酵后不利于骏枣汁原料香气物质的保持。
4 结论
本研究理化指标分析表明，利用酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）BV818发酵使产品抗氧化能力增强，发酵后总酚和总黄酮含量分别提高11.71%和12.06%，ABTS+、DPPH自由基清除率分别提高12.00%和15.50%，FRAP提高1.13 mmol/L；发酵改变其有机酸的组成和含量，发酵后乳酸含量增加，使得骏枣汁口感变得顺滑和柔和；发酵后骏枣汁中醇类、酯类和酮类物质含量升高，且新产生了3-羟基-2-丁酮和β-大马士酮两种挥发性物质，赋予花果香等令人愉悦的风味，这为开发风味馥郁与营养俱佳的低醇酒精发酵饮料提供了理论支撑。但本研究仍有一定的局限性，有关发酵骏枣汁产品稳定性以及口感调配等在今后的工作中仍需进一步研究。
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