高脂血症（hyperlipidemia）是指血浆中总胆固醇（total cholesterol，TC）升高、三酰甘油（triacylglycerol，TG）升高或者两者同时升高引起的血脂代谢异常疾病，其类型可分为原发性和继发性两类，前者与遗传缺陷有关，后者与代谢性紊乱疾病、饮食习惯、生活方式等多种因素有关[1]。近年来，随着我国经济社会的快速发展和综合国力的提高，人们的生活质量和消费水平也不断地提高，膳食结构也随之发生了显著变化[2]。主要表现为：谷物类食品的摄入量逐年降低，导致碳水化合物摄入量的减少；动物性食物的摄入量逐年上涨，导致脂肪摄入量的增加[3]。据调查显示，我国血脂异常患病率已高达41.9%，并出现低龄化现象，青少年人群数量呈上升趋势[4]。更重要的是，高脂血症属于慢性疾病，早期无明显的临床症状，在长期影响身体健康的情况下，会诱发动脉粥样硬化、冠心病、肝硬化等多种疾病[5]。高血脂患者长期使用降血脂药物带来各种不良反应，因此，饮食调整已成为目前的研究热点。
随着生活方式的改变，饮酒在日常生活中也越来越普遍，对健康的影响备受关注。茗酿养生酒是泸州老窖的一款草本花果类养生酒，其选用野生乔木古茶树鲜叶，再辅以精选龙眼肉、枸杞子进行酿造，增加了酒中的草本活性成分，具有一定的养生保健功效。有研究发现，相比于白酒，部分养生酒具有降低血脂水平的效果[6]，然而其功能成分的作用机制尚不清楚，因此，明晰养生酒功能成分的配伍作用，可为后续开发降低高血脂的酒品提供数据支持[7-8]。
本研究基于液相色谱-质谱联用（liquid chromatographymass spectrometry，LC-MS）法和网络药理学的研究方法初步选取茗酿养生酒中的功能活性成分集合，并分析其作用靶点的生物过程和信号通路，以此初步明晰选取的功能成分影响高脂血症的作用机制，同时为后续的动物实验提供参考依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
1.1.1 样品
茗酿（508）养生酒：泸州老窖养生酒业有限责任公司。
1.1.2 化学试剂
乙腈、甲醇（均为色谱纯）：德国Merck公司；甲酸、乙酸铵（均为分析纯）：上海安谱实验科技股份有限公司。其他试剂均为国产分析纯。
1.2 仪器与设备
UltiMate 3000超高压液相色谱（ultra-high pressure liquid chromatography，UHPLC）仪：美国赛默飞世尔科技公司；5600 QTOF高分辨质谱仪：美国AB SCIEX公司；ACQUITY UPLC HSS T3色谱柱（1.8 μm，2.1 mm×100 mm）：美国Waters公司。
1.3 方法
1.3.1 茗酿养生酒中活性成分的检测
样品前处理：取500 μL样品，真空抽干，加入100 μL体积分数为75%的甲醇水溶液涡旋60 s，使用0.2 μm有机滤膜过滤后，采用LC-MS检测。
LC条件：ACQUITY UPLC HSS T3色谱柱（1.8 μm，2.1 mm×100 mm）；流动相的正离子模式为0.1%甲酸-水（A）和0.1%甲酸-乙腈（B），负离子模式为水（2 mmol/L乙酸铵）（A）和乙腈（B）；柱温箱温度为40 ℃；上样量为3 μL。梯度洗脱程序为：0～1.5 min，95%A；2.5～14 min，90%A；12～22 min，60%A；22～25 min，5%A；25～30 min，95%A。
MS条件：采用电喷雾离子（electron spray ionization，ESI）源，正、负离子模式进行检测；雾化气压60 psi，气帘气压35 psi，辅助气压60 psi，温度650 ℃，喷雾电压5 000 V（正离子模式）或-4 000 V（负离子模式）。
定性分析：将所得到的数据使用AnalysisBaseFileCon verter进行格式转换得到abf文件，而后使用MSDIAL（ver 4.24）将abf文件进行峰寻找和峰对齐等数据处理，并基于一级与二级图谱搜索自主整合Metlin、MoNA、HMDB和MassBank的数据库，扣除空白后，获得鉴定结果。
1.3.2 基于网络药理学方法获取茗酿活性成分和作用靶点
通过中医药系统药理学数据库和分析平台（traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP）[9]、中医药综合数据库（traditional Chinese medicines integrated database，TCMID）检索茗酿养生酒中添加的茶叶、枸杞、龙眼肉3种成分对应的化学成分，并根据LC-MS法的检测结果，初步选定20～30种具有确证功能的活性成分。使用TCMSP、TCMID获取活性成分的作用靶点，并使用Uniprot数据库[10]将获得的作用靶点名称转换为通用的Gene name。对于TCMSP和TCMID中未查阅到的活性成分作用靶点，使用Pubchem数据库下载这些活性成分的SDF文件，再将其上传到Swiss Target Prediction数据库[11]，预测活性成分的作用靶点（Probability＞0.1），即获得茗酿养生酒活性成分的作用靶点。
1.3.3 高脂血症疾病靶点的获取
以Hyperlipidemia或Hyperlipoproteinemia为关键词，通过OMIM数据库、Drugbank数据库、GeneCards数据库（筛选条件为Relevance score＞1）、Therapeutic Target Database数据库[12]检索高脂血症的疾病靶点，并使用Uniprot数据库统一将疾病靶点名称转换为Gene name，以此获得高脂血症疾病的相关基因靶点。使用Venny2.1在线绘图软件，获取茗酿养生酒活性成分作用靶点和高脂血症疾病靶点的交集靶点。
1.3.4 茗酿养生酒活性成分-交集靶点-疾病网络图的构建
使用Cytoscape_v3.7.1软件，构建“茗酿活性成分-交集靶点-疾病”网络图。将茗酿养生酒中的活性成分与高脂血症疾病的交集靶点导入Cytoscape中，将活性成分、交集靶点和高脂血症三者的关系进行可视化分析。并使用Network Analysis分析工具计算各活性成分的节点连接度（Degree），以分析各活性成分作用于高脂血症的靶点数目。
1.3.5 蛋白质互作网络的构建
使用STRING数据库，将获得的交集靶点输入到Multiple Proteins by Names/Identifiers中，将物种组织（Orgnisim）设置为人源（Homo sapiens），设置最低相互作用评分（minimum required interaction score）为0.7，隐藏游离节点，进行拓扑学分析。
1.3.6 GO和KEGG通路富集分析
将茗酿养生酒活性成分作用靶点与高脂血症疾病靶点的交集靶点导入Metascape在线分析网站[13]，设置物种为人（Homo sapiens），获取基因本体论（gene ontology，GO）注释和京都基因和基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）通路富集分析结果。GO注释分为三大类，分别是：生物学过程（biological process，BP）、细胞学组分（cellular components，CC）和分子生物学功能（molecular function，MF）。根据P值大小排序，将GO注释中每类排名前3的条目，以及KEGG通路分析中排名前15的通路，利用微生信在线分析网站进行气泡图可视化绘制和分析。
2 结果与分析
2.1 茗酿养生酒活性成分LC-MS分析结果及作用靶点筛选
采用LC-MS法从茗酿养生酒中共检测出144种物质。通过TCMSP数据库、TCMID数据库筛选，选定其中的21种活性成分进行网络药理学机制研究，具体成分见表1。
表1 茗酿养生酒活性成分分析结果
Table 1 Analysis results of active components of Mingniang health liquor
注：CY1～CY8代表来源于茶叶的活性成分；GQ1～GQ4代表来源于枸杞的活性成分；LY1～LY6代表来源于龙眼肉的活性成分；A1～A2代表茶叶和枸杞共有的成分；B1代表茶叶和龙眼肉共有的成分；N/A代表未检索到该成分的MOL ID。
由表1可知，选定的21种活性成分涉及酯类、核苷类、糖苷类、维生素类、酚酸类、黄酮类和脂肪酸类等化合物，其中，11种活性成分来自茶叶，6种活性成分来自枸杞，7种活性成分来自龙眼肉，槲皮素和棕榈酸为茶叶和枸杞共有的成分，蔗糖为茶叶和龙眼肉共有的成分。
通过TCMSP数据库和Swiss Target Prediction数据库共获得茶叶中11种活性成分对应的356个作用靶点，枸杞中6种活性成分对应的162个作用靶点，龙眼肉中7种活性成分对应的254个作用靶点。将茶叶、枸杞和龙眼肉3种成分的作用靶点进行汇总，并删除重复项后，共得到547个茗酿养生酒中有效的作用靶点。
2.2 高脂血症疾病靶点及其与活性成分作用靶点的交集靶点的获取
使用OMIM数据库、Drugbank数据库、GeneCards数据库（筛选条件为Relevance score＞1）和Therapeutic Target Database数据库进行检索，共获得高脂血症的疾病靶点477个。使用Venny2.1在线绘图软件，输入检索得到的茗酿养生酒活性成分作用靶点和高脂血症疾病靶点，从而获取茗酿养生酒活性成分作用靶点和高脂血症疾病靶点的交集靶点，并绘制韦恩图，结果见图1。由图1可知，茗酿养生酒活性成分作用靶点和高脂血症疾病靶点共有92个交集靶点。
图1 茗酿养生酒活性成分作用靶点和高脂血症疾病靶点的韦恩图
Fig.1 Venn diagram of action target of active ingredients in Mingniang health liquor and the hyperlipidemia target
2.3 茗酿养生酒活性成分-交集靶点-疾病网络图的构建
利用Cytoscape_v3.7.1软件绘制“茗酿养生酒活性成分-交集靶点-疾病”网络图，结果见图2。图中蓝色圆圈代表茗酿养生酒活性成分作用靶点和高脂血症疾病靶点的92个交集靶点。
图2 活性成分-交集靶点-疾病网络图
Fig.2 Active ingredient-intersection target-disease network diagram
由图2可知，除2-羟苯基苯甲酸甲酯（CY1）、咖啡因（CY3）、苹果酸（GQ1）、皂苷（GQ2）、脯氨酸（GQ4）和邻苯二甲酸二（2-乙基己基）酯（LY6）没有对应的交集靶点外，其余活性成分均和高脂血症存在交集靶点。以节点连接度（Degree）设置节点（Nodes）面积大小并进行排序，得到茗酿养生酒中各活性成分对应的交集靶点数目，结果见图3。
图3 茗酿养生酒各活性成分对应的交集靶点数目
Fig.3 Number of intersection targets corresponding to active ingredient in Mingniang health liquor
由图3可知，靶点数目排名前三位的活性成分分别为槲皮素（A1）、亚油酸（CY5）、腺苷（LY3），这些活性成分可能是茗酿养生酒影响高脂血症的重要化合物。研究表明，槲皮素可以通过抑制活性氧族（reactive oxygenspecies，ROS）和硫氧还蛋白相互作用通路来减少脂滴的大小和数量，以此减轻肝脏的脂质积累[14]；ZENG H M等[15]研究发现，槲皮素可通过降低脂滴包被蛋白2（perilipin 2，PLIN2）水平，激活单磷酸腺苷活化的蛋白激酶（AMP-activated protein kinase，AMPK）活性，增加肝脏人微管相关蛋白轻链3 II（human microtubule-associatedproteinlightchain3II，LC3II）和PLIN2的共定位来缓解长期过量酒精喂养小鼠引起的肝脏脂肪变性，其作用机制可能与槲皮素对脂肪吞噬过程的调节作用相关。亚油酸是最早被发现的人体必需多不饱和脂肪酸，其具有预防炎症、癌症、免疫调节等多种功能[16]；还可以通过降低血浆中甘油三酯、低密度脂蛋白、极低密度脂蛋白和胆固醇的含量来维持血脂代谢平衡以及预防动脉粥样硬化[17]。除此之外，靶点数目排名第五的表没食子儿茶素没食子酸酯可以降低血清总胆固醇、甘油三酯及高密度脂蛋白胆固醇（high density lipoprotein cholesterol，HDL-C）的水平来实现脂代谢调节作用，达到降血脂的目的[18]。
2.4 蛋白互作网络的构建
利用STRING数据库将92个交集靶点绘制成蛋白质互作（protein protein interaction，PPI）网络图，结果见图4。由图4可知，该网络图共有79个节点和351条边，平均节点度值（Degree）为7.65，表明共有79个靶点可发生蛋白质相互作用。通过度值（Degree）大小对79个靶点进行排序，度值越大，则图中的节点越大、橙色越深。以结合分数（Combined score）来预测蛋白间的功能关联，连线越粗、橙色越深，则蛋白间的关联程度越大。由图4可知，度值大小排在前五位的靶点分别为肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF）、白介素-6（interleukin-6，IL-6）、血管内皮生长因子A（vascular endothelial growth factor A，VEGFA）、C反应蛋白（C-reactiveprotein，CRP）和纤维连接蛋白（fibronectin 1，FN1），说明这五个靶点是茗酿养生酒中活性成分影响高脂血症的关键靶点。TNF和IL-6都是重要的炎症因子，而高脂血症能进一步发展为与炎症免疫反应密切相关的动脉粥样硬化（atherosclerosis，AS）、冠状动脉性心脏病和高脂血症性急性胰腺炎等疾病[19]。刘睿等[20]研究发现，泽明降脂方在治疗高脂血症大鼠时，不仅能有效调节血脂代谢平衡，还能降低TNF-α和IL-6等炎症趋化因子的表达水平，以此减轻氧化应激反应，对高脂血症诱发的冠状动脉性心脏病具有良好的预防作用。VEGFA是一种促血管生成蛋白，能够诱导内皮细胞的增殖、促进一氧化氮的合成而引起血管扩张、促进细胞迁移，抑制细胞凋亡等[21]；研究表明，VEGFA还可与VEGFB相互调节脂肪组织表型、细胞分化、基因表达以及新陈代谢过程[22]。CRP是一种非特异的炎症标志物，一项对14 719名女性的8年随访调查发现，其表达水平的增高会增加代谢综合征和心血管疾病的预后风险和发病率[23]。FN1是一种糖蛋白，其在细胞黏附、细胞迁移、宿主防御等方面都发挥着重要作用，能够影响伤口愈合、凝血和胚胎发生等过程[24]。FN1基因可在多种肿瘤中过表达，其外A结构域是实体瘤和转移瘤的血管标记物[25]。
图4 茗酿养生酒活性成分影响高脂血症靶点的蛋白互作网络图
Fig.4 Protein-protein interaction network diagram of active ingredient in Mingniang health liquor affecting hyperlipidemia targets
2.5 GO富集分析和KEGG通路富集分析
将92个交集靶点上传至Metascape中进行GO富集分析和KEGG通路富集分析。GO富集结果显示，92个交集靶点基因共涉及977条生物学过程（BP）、34条细胞学组分（CC）和89条分子生物学功能（MF）。根据P值由小到大分别筛选BP、CC、MF中排名前三的相关条目绘制气泡图，结果见图5。由图5a可知，生物学过程（BP）主要涉及对细菌的响应过程（response to bacterium）、对脂多糖的响应过程（response to lipopolysaccharide）和对细菌来源分子的响应过程（responsetomoleculeofbacterialorigin）等；细胞学组分（CC）主要涉及细胞的顶端部分（apical part of cell）、真核生物细胞膜中的膜筏（membrane raft）和膜微域（membrane microdomain）组分等，膜微域通常又被称为脂筏，是细胞膜上富含胆固醇和鞘磷脂的特定亚域；分子生物学功能（MF）主要包括氧化还原酶活性（oxidoreductase activity）、脂质结合（lipid binding）和核受体活性等。研究表明，脂多糖可以作用于宿主细胞细胞膜表面上的Toll样受体（Toll-like receptors，TLR），进一步地激活相应的核因子κB（nuclear factor kappa-B，NF-κB）蛋白和丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）信号通路，引起IL-1、IL-6、TNF-α等炎症因子的释放，从而导致炎症反应[26]，这和茗酿养生酒中的活性成分影响高脂血症的关键靶点相对应。
图5 茗酿养生酒活性成分影响高脂血症靶点GO富集（a）及KEGG通路富集（b）分析气泡图
Fig.5 Analysis bubble chart of GO enrichment (a) and KEGG pathway enrichment (b) of active ingredient in Mingniang health liquor affecting hyperlipidemia targets
KEGG富集分析结果显示，92个交集靶点基因共涉及120条信号通路，同样根据P值由小到大排序，选择排名前15的信号通路绘制气泡图，结果见图5。由图5b可知，主要包括糖尿病并发症中的晚期糖基化终产物（advanced gly cosylationend products，AGE）-糖基化终末产物受体（receptor of AGEs，RAGE）信号通路、脂质和动脉粥样硬化（lipid and atherosclerosis）和过氧化物酶体增殖物激活受体（per oxisome proliferators-activated receptors，PPAR）信号通路等。有研究发现，AGE-RAGE信号通路多参与炎症介导的代谢类疾病，已被确认为诱发糖尿病肾病的重要致病机制[27]。另外，高膳食的AGEs喂养还会导致小鼠脂肪组织炎症和糖脂代谢紊乱[28]。KEGG富集分析结果中排名第二的脂质和动脉粥样硬化进一步确证了茗酿养生酒活性成分对高脂血症存在的影响。PPARs是由脂肪酸及其衍生物激活的核激素受体，主要包括PPARα、PPARβ/δ和PPARγ 3种表型。其中，PPARα可以调节肝脏和骨骼肌脂质代谢基因的表达，并降低血浆中甘油三酯、低密度脂蛋白胆固醇的含量，达到调节脂代谢紊乱的目的[29]；PPARβ/δ能够促进脂质氧化，减少肝脏中脂质的沉积，还能促进脂肪组织中M1型巨噬细胞向M2型的转化来减少炎症；PPARγ则能促进脂肪细胞的分化，促进血糖的吸收，调节脂糖代谢平衡[30]。
3 结论
本研究基于LC-MS法和网络药理学的研究方法，初步选定了来自泸州老窖茗酿养生酒中的21种活性成分，研究其与高血脂相关的作用靶点和信号通路之间的相互关系。初步证实茗酿养生酒中的槲皮素、亚油酸和绿原酸等多种成分配伍可以作用于TNF、IL-6和VEGFA等关键靶点，并涉及对脂多糖的响应过程、真核生物细胞膜中的膜筏和膜微域组分、脂质结合等基因功能，再通过糖尿病并发症中的AGE-RAGE、Lipid and atherosclerosis和PPAR等信号通路来影响高脂血症，初步揭示了泸州老窖茗酿养生酒中的功能成分影响高脂血症具有多成分-多靶点-多途径的作用特点，为进一步通过动物模型研究茗酿养生酒对高脂血症的确切影响奠定了理论基础。
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