酸乳发酵剂作为发酵乳制品的一种特定微生物，在发酵乳行业生产中占据着重要地位。工业生产中常用于制备发酵乳制品的乳酸菌主要包括乳杆菌属（Lactobacillus sp.）、双歧杆菌属（Bifidobacterium sp.）、链球菌属（Streptococcus sp.）、明串珠菌属（Leuconostoc sp.）[1]。德氏乳杆菌（Lactobacillus delbrueckii）属于乳杆菌属，其来源广泛，可从乳制品、发酵食品以及人的口腔、肠道及阴道分离得到[2]，具有降血压、降低胆固醇、抗肿瘤、抗氧化、抑菌、调整肠道菌群和抗癌等益生功能[3-5]。德氏乳杆菌作为酸乳发酵剂是工业中生产发酵乳制品最为重要的菌种，也是最具有经济价值的发酵乳酸菌之一，发酵时可将乳糖经过同型乳酸发酵转化为乳酸，同时将蛋白质降解成氨基酸及肽类物质，赋予乳制品独特的质地、风味及高的营养价值[6-7]。
近几年，国内学者从不同地区采集传统发酵乳制品，通过发酵特性研究从中筛选出多种发酵特性良好的乳酸菌种。王磊等[8]通过研究产酸和产黏性能，从分离于传统发酵乳制品中的10株德氏乳杆菌保加利亚亚种中筛选得到1株优势乳酸菌；万金敏[9]通过产酸和产胞外多糖能力等发酵特性研究，从西藏牦牛奶渣、奶疙瘩和奶皮中分离鉴定得到的113株乳酸菌中，筛选出7株发酵性能优良的乳酸菌；刘娜等[10]通过发酵特性研究，从分离自青海、云南等地区的酸牦牛奶、酸马奶、酸驼奶中的22株德氏乳杆菌保加利亚亚种中，筛选出7株优势乳酸菌；曾泽凤[7]通过研究发酵特性及其酸乳的感官特性，从分离自蒙古国、中国内蒙古自治区、四川省和甘肃省的自然发酵乳制品酸牛奶、酸马奶、酸牦牛奶、乳清和曲拉中的83株乳酸菌中，筛选出5株发酵特性优良的优势乳酸菌。目前，酸乳发酵剂丰富多样，市场竞争力和市场潜力较大，其发酵性能的好坏直接影响酸乳的产品质量。而我国在乳酸菌方面的研究工作中比较落后，与欧美国家存在很大差距，部分规模较大的乳制品加工公司均采用进口发酵剂，较少有自主生产的发酵剂[11]。因此，筛选适合酸乳发酵的优良菌株，可以为开发国内酸乳发酵剂提供丰富的资源。
西藏号称“世界第三极”，有着相对封闭的环境，昼夜温差大，海拔高且落差大，这种极端环境使益生菌成就了很好的特异性[12]。该地区的牦牛奶资源丰富，在自然条件下发酵的酸乳组织细腻、口感纯正、风味独特，贮藏较长时间还能保持其原有风味，说明这些传统发酵乳中的发酵剂菌种具有传代性能好、抗逆特性强、风味独特等特性[9]。因此，对西藏奶拉及牦牛奶中分离的德氏乳杆菌进行研究、开发及应用具有广阔的市场价值。本研究以德氏乳杆菌保加利亚亚种（Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus）6047为对照菌株，采用分离自西藏牧民自制奶拉及牦牛奶中的2株德氏乳杆菌发酵酸乳，通过考察酸乳的发酵时间及滴定酸度、脱水收缩性、黏度和游离氨基酸态氮含量等理化指标，筛选能用于乳制品发酵的具有优异发酵特性和自主知识产权的德氏乳杆菌[13-15]，以期用于工业化生产。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
1.1.1 菌株
德氏乳杆菌（Lactobacillus bulgaricus）Dangxiong LBⅢ（简称DB-3）、德氏乳杆菌乳亚种（Lactobacillus delbrueckii subsp.lactis）JIACHA LD-Ⅱ（简称JD-2）：由安琪生物科技有限公司青藏高原益生菌种业资源库保藏、提供，这2株菌分别从西藏当雄县牧民自制奶拉、西藏山南市加查县崔久乡牦牛奶中分离筛选获得；德氏乳杆菌保加利亚亚种（Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus）6047：中国普通微生物菌种保藏管理中心（china general microbial species conservation management center，CGMCC）。
1.1.2 试剂
全脂乳粉：阿拉尔新农乳业有限责任公司；脱脂乳粉：德国Bio Froxx公司；酵母粉（生化试剂）：安琪生物科技有限公司；三氯乙酸、氢氧化钠（均为分析纯）：上海麦克林生化科技有限公司；邻苯二甲醛、β-巯基乙醇、十二烷基磺酸钠、L-苯丙氨酸、四硼酸钠（均为分析纯）：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；氯化钠、酚酞、甲醇、蔗糖（均为分析纯）：国药集团化学试剂有限公司。其他试剂均为国产分析纯。
1.1.3 培养基
MRS液体培养基、MRS固体培养基：广东环凯微生物科技有限公司。
脱脂乳培养基[7]：脱脂乳粉10%，酵母粉0.1%，115 ℃高压蒸汽灭菌15 min。
全脂乳培养基[16]：全脂乳粉11.5%，蔗糖6.5%，加入70 ℃左右的蒸馏水中，高压均质（一段20 MPa，二段4 MPa），105 ℃高压蒸汽灭菌8 min。
1.2 仪器与设备
ZQLY-180V型电热恒温培养箱：上海知楚仪器有限公司；SQ510C高压蒸汽灭菌锅：重庆雅马拓科技有限公司；H1850R高速台式冷冻离心机：湖南湘仪实验室仪器开发有限公司；JN-miniHC超高压纳米均质机：广州聚能纳米生物科技股份有限公司；MX-F固定式混匀仪：大龙兴创实验仪器股份公司；PHS-3E pH计：上海仪电科学仪器股份有限公司；Brook Field DV3-T黏度仪：美国Brook Field公司；UV-1800紫外可见分光光度计：上海岛韩实业有限公司。
1.3 方法
1.3.1 菌株活化培养及发酵剂的制备
以德氏乳杆菌保加利亚亚种6047为对照，将保藏的2株供试菌株以4%（V/V）的接种量分别接种于MRS液体培养基中，37 ℃条件下培养24 h，连续活化3代。将1 mL发酵液在8 000 r/min条件下离心10 min，弃上清液，收集菌体，采用1 mL无菌磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）（浓度0.1 mol/L，pH 6.8）重悬菌体，4 ℃冷藏备用。再用无菌生理盐水将0.1 mL菌悬液梯度稀释106倍，涂布于MRS固体培养基，在37 ℃条件下培养24 h，计算活菌数[7]。以2%的接种量将PBS重悬菌液接种至脱脂乳培养基中，即为发酵剂（活菌数为1×107 CFU/g）。
1.3.2 酸乳的制备
以2%的接种量将发酵剂接种至全脂乳培养基中，装液量为220 mL/500 mL，42 ℃条件下培养。当pH值达到4.5时，停止发酵，记录发酵所需时间，在冰水中迅速冷却该发酵乳，4 ℃冰箱中冷藏21 d备用，用于各理化指标的测定。
1.3.3 酸乳理化指标的测定
在发酵结束、4 ℃冷藏期（后熟24 h、冷藏7 d、14 d、21 d）分别检测酸乳的pH值、滴定酸度、脱水收缩性、黏度和游离氨基酸态氮含量。
pH值的测定：在25 ℃条件下，采用pH计测定酸乳的pH值，平行测定3次；滴定酸度的测定[17]：采用酸碱滴定法；脱水收缩性的测定：参考文献[10]的方法；黏度的测定：参考文献[18]的方法；游离氨基酸态氮含量的测定：参考文献[19]的方法。
1.3.4 数据处理与分析
采用Excel 2016处理数据，结果用“平均值±标准差”表示；采用Prism 9软件绘图及差异显著性分析。
2 结果与分析
2.1 不同德氏乳杆菌发酵酸乳发酵时间的测定结果
评价发酵剂品质好坏的一个重要指标即酸乳发酵剂的发酵时间，发酵时间过长可能使酸乳感染其他微生物的几率增加[20]。
由图1可知，3株德氏乳杆菌菌株发酵酸乳的时间均＜24 h，均符合商业化生产需求（＜16 h）[7，19]。其中，菌株DB-3和JD-2的发酵时间极显著短于对照菌株6047（P＜0.01），且菌株DB-3的发酵时间最短，为8.44 h。综上，菌株DB-3的发酵时间最短。
图1 不同德氏乳杆菌发酵时间的测定结果
Fig.1 Determination results of fermentation time of different strains of Lactobacillus delbrueckii
“**”表示与对照菌株6047相比差异极显著（P＜0.01）。
2.2 不同德氏乳杆菌发酵酸乳pH值及滴定酸度的测定结果
后酸化能力是评定发酵乳发酵剂品质的另一项重要指标[21]。不同德氏乳杆菌菌株发酵酸乳在发酵终点及4 ℃冷藏期pH值及滴定酸度的变化见图2。
图2 4 ℃冷藏期不同德氏乳杆菌发酵酸乳pH值（a）及滴定酸度（b）的变化
Fig.2 Changes of pH (a) and titrated acidity (b) of yoghurt fermented with different strains of Lactobacillus delbrueckii during refrigeration at 4 ℃
酸乳4 ℃冷藏期品质发生变化就是由酸乳后酸化导致的，德氏乳杆菌有较好的产酸能力，是导致酸乳后酸化的主要菌种，后酸化会使产品出现过重的酸味，产品质量下降，缩短货架期[22-24]。因此，需筛选后酸化能力弱的菌株。由图2可知，在4 ℃冷藏期间，3株德氏乳杆菌发酵酸乳的pH值均逐渐下降，滴定酸度均逐渐升高。菌株DB-3、JD-2和6047发酵酸乳冷藏21 d后，pH值分别降至4.06、3.76、3.63；滴定酸度从发酵结束到冷藏21 d分别升高16.73°T、38.86°T、45.23°T。其中对照菌株6047发酵酸乳的pH值及滴定酸度值变化较大，后酸化现象严重，其次为菌株JD-2，而菌株DB-3的pH值与滴定酸度的变化相对较小，后酸化能力弱。综上，菌株DB-3后酸化能力较弱，符合优良乳酸菌发酵剂所具有的特点[7，16]。
2.3 不同德氏乳杆菌发酵酸乳脱水收缩性的测定结果
乳清析出程度反映了持水能力的大小，持水能力的大小又通过酸乳的脱水收缩性来体现，脱水收缩性越小，酸乳持水力越好，组织状态越稳定[25]。不同德氏乳杆菌发酵酸乳在发酵终点及4 ℃冷藏期脱水收缩性的变化见图3。
图3 4 ℃冷藏期不同德氏乳杆菌发酵酸乳脱水收缩性的变化
Fig.3 Changes of dehydrating contractility of yoghurt fermented with different strains of Lactobacillus delbrueckii during refrigeration at 4 ℃
由图3可知，在4 ℃冷藏期间，3株德氏乳杆菌菌株发酵酸乳的脱水收缩性差异较大，但均呈升高趋势。其中，菌株DB-3发酵酸乳的脱水收缩性最小，持水性能最好，从发酵结束到冷藏期间脱水收缩性维持在32.43%～35.81%之间；其次为菌株JD-2发酵酸乳，脱水收缩性为37.71%～44.08%；而对照菌株6047发酵酸乳的持水性能最差，在4 ℃冷藏条件下，后熟24 h后脱水收缩性达40.3%，冷藏21 d后，脱水收缩性达54.78%。在特定的时间范围内，酸乳脱水收缩性愈小，说明酸乳凝胶失去的乳清愈少[26]，因此，在4 ℃冷藏期间，菌株DB-3发酵酸乳能维持组织状态良好的稳定性。
2.4 不同德氏乳杆菌发酵酸乳黏度的测定结果
黏度是酸乳一项重要的物理性质。新鲜的牛乳经过一定时间的发酵可由原来的液态转变成黏稠状即酸奶的质地，这是由于鲜牛乳中的酪蛋白沉淀转化成凝胶状，形成了许多较大体积的凝乳微粒[27]。另外，德氏乳杆菌产生的胞外多糖是异质性多糖，其相对分子质量比较高，由很多半乳糖单体及葡萄糖单体以1∶1的比例聚合而成，可以使酸乳呈现浓厚质地及高黏特性[28]，使酸乳黏度的大小受到一定的影响[7]，从而减少酸乳产生乳清析出、凝胶断裂等质量问题，使酸乳呈现更好的状态[29-30]。其次，影响菌株产黏特性还有很多其他因素，如培养温度、培养基条件和酸度等。发酵条件相同时，应选择不仅产黏特性好且能够改善酸乳组织状态的菌株，但实际工业生产中，黏度过大会影响生产效率。因此，可选择酸乳黏度适中的菌株作为发酵剂[16]。不同德氏乳杆菌发酵酸乳在发酵终点及4 ℃冷藏期黏度的变化见图4。
图4 4 ℃冷藏期不同德氏乳杆菌发酵酸乳黏度的变化
Fig.4 Changes in viscosity of yoghurt fermented with different strains of Lactobacillus delbrueckii during refrigeration at 4 ℃
由图4可知，在发酵终点、后熟24 h后，菌株DB-3发酵酸乳的黏度分别达到943 mPa·s、1 054 mPa·s，明显高于菌株JD-2（537 mPa·s、640 mPa·s）和6047（498 mPa·s、543 mPa·s）；在4 ℃冷藏7 d后，菌株DB-3和JD-2发酵酸乳的黏度均呈上升趋势，冷藏21 d后，黏度分别达1 522 mPa·s和897 mPa·s，而对照菌株6047发酵酸乳在冷藏7 d后黏度值开始出现小幅度下降，分析原因可能是由于该德氏乳杆菌产酸性能强，导致酪蛋白等电点的偏离，改变了酸乳凝乳结构，引起乳清析出，最终使酸乳黏度降低[31]。综上，菌株DB-3发酵酸乳具有较好的产黏特性，能使酸乳呈现较好的组织状态。
2.5 不同德氏乳杆菌发酵酸乳游离氨基酸态氮含量的测定结果
不同德氏乳杆菌发酵酸乳在发酵终点及4 ℃冷藏期游离氨基酸态氮含量的变化见图5。
图5 4 ℃冷藏期不同德氏乳杆菌发酵酸乳游离氨基酸态氮含量的变化
Fig.5 Changes of free amino acid nitrogen contents of yoghurt fermented with different strains of Lactobacillus delbrueckii during refrigeration at 4 ℃
乳酸菌具有一定的蛋白水解能力，也能够降解蛋白质形成一些小分子的短肽类和氨基酸物质，改善发酵乳制品的质地以及风味[32]。研究发现，德氏乳杆菌能代谢分泌蛋白水解酶以及肽酶，可以降解酸乳中以胶体形式存在的具有复杂四级结构的酪蛋白颗粒，使其成为结构较简单的氨基酸或者小肽类，利于人体的吸收和利用；另外发酵乳蛋白较高程度的水解还可增加酸乳的营养价值，因此，发酵乳制品中乳酸菌的蛋白水解能力尤为重要[19]。但蛋白质如果过度的水解也会致使酸乳的黏度有所下降，甚至还会影响到成品的风味和口感[33]。因此，应选择蛋白质水解能力适度的菌株，一般选择酸乳4 ℃冷藏期间游离氨基酸态氮含量变化量为5～10 mmol/L为宜[7]。
由图5可知，3株菌株在发酵结束时，菌株DB-3发酵酸乳的游离氨基酸态氮含量为5.27 mmol/L，明显高于菌株JD-2发酵酸乳（4.14 mmol/L）及对照菌株6047发酵酸乳（3.47 mmol/L）。在4 ℃冷藏期间，3株菌株发酵酸乳的游离氨基酸态氮含量均呈上升趋势，冷藏21 d后，菌株DB-3、JD-2发酵酸乳中游离氨基酸态氮含量分别达到6.24 mmol/L和5.25 mmol/L，远高于对照菌株6047发酵酸乳（4.99 mmol/L）。因此，确定菌株DB-3为优良菌株。
3 结论
本研究以德氏乳杆菌保加利亚亚种6047为对照菌株，利用分离自西藏牧民自制奶拉及牦牛奶中的2株德氏乳杆菌（Lactobacillus delbrueckii）DB-3和JD-2发酵制备酸乳，通过测定酸乳的发酵时间以及在4 ℃后熟24 h及冷藏7 d、14 d、21 d时pH值、滴定酸度、黏度、脱水收缩性及游离氨基酸态氮含量等理化特性，最终筛选出1株发酵特性优良的德氏乳杆菌DB-3。菌株DB-3发酵酸乳时间短仅需8.44 h，符合工业化生产需求；4 ℃冷藏期间滴定酸度变化量小，仅为16.73°T，后酸化能力较弱，酸乳品质有保障；冷藏21 d后脱水收缩性仅为35.81%，酸乳持水能力强，能保持良好的组织状态；酸乳黏度较好，发酵结束及冷藏21 d时，黏度值在943～1 522 mPa·s之间平稳上升，保持酸乳呈现良好的组织状态稳定性；酸乳质地、风味俱佳，4 ℃冷藏21 d后游离氨基酸态氮含量达6.24 mmol/L，是1株发酵特性优良的高原益生菌。由于分离的样品来源于生态环境恶劣的西藏高原地区，其乳酸菌种经过上千年的自然淘汰生存下来，有着传代性和抗逆性强的优点，以期能将该优势菌株应用于工业化生产中。
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