乳酸菌（lactic acid bacteria，LAB）是一种普遍存在于自然界中的益生菌，其本身并非微生物分类学概念，而是对一类可发酵葡萄糖产生乳酸、无芽孢的革兰氏阳性细菌的总称[1]。乳酸菌被公认为是安全的微生物，具有增强机体免疫力、促进机体生长、降压降血脂、抗衰老等作用[2-6]。广泛应用于化工、制药、饲料等领域，其重要性不言而喻。胞外多糖（exopolysaccharides，EPS）是微生物分泌到细胞壁外的黏液多糖和荚膜多糖的总称[7]。研究表明，乳酸菌胞外多糖具有抗氧化、抗肿瘤、降低胆固醇等生物活性[8-11]。此外，乳酸菌胞外多糖有助于细菌形成生物被膜，可以帮助细菌抵御不良环境，如乳酸链球菌素、溶菌酶等，对抗生素、噬菌体和吞噬作用更具有抵抗力[12]。在食品生产中，乳酸菌胞外多糖可作为稳定剂、凝胶剂、乳化剂等，改善食物的流变性和感官特性[13-14]。乳酸菌产生胞外多糖的方式主要为天然菌种发酵，分离纯化过程繁琐，乳酸菌胞外多糖产量低[15]。此外，由于乳酸菌的种类及来源不同，其产生的EPS的结构和特性均有所差异[16]，限制了乳酸菌大规模工业化生产和应用，需要进一步进行工艺优化以实现有效和经济的规模化。
发酵动力学是研究发酵过程中微生物生长活动中菌体生长、底物消耗及产物形成之间关系内在规律的方法[17-18]。建立相应动力学方程的数学模型，从而达到认识发酵过程规律，优化发酵工艺，为提高发酵产量提供理论基础[19]。
本研究以胞外多糖为响应值，通过单因素试验和响应面法优化鼠李糖乳杆菌（Lactobacillus rhamnosus）R5产胞外多糖的发酵条件，并构建其产胞外多糖生长过程的动力学模型，为工业化生产乳酸菌胞外多糖提供前期的实验基础。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
1.1.1 菌株
鼠李糖乳杆菌（Lactobacillus rhamnosus）R5：分离自四川传统泡菜，降胆固醇能力＞30%，具有耐酸、耐胆盐能力，保存于本实验室。
1.1.2 培养基
MRS液体培养基[20]：蛋白胨10.0 g，牛肉粉10.0 g，酵母粉5.0 g，柠檬酸氢二胺2.0 g，葡萄糖20.0 g，乙酸钠5.0 g，磷酸氢二钾2.0 g，硫酸镁0.58 g，硫酸锰0.25 g，吐温80 1.0 mL，蒸馏水1 000 mL。MRS固体培养基：MRS液体培养基中添加琼脂20 g，121 ℃高压蒸汽灭菌20 min。
1.1.3 试剂
苯酚、葡萄糖、硫酸、氯仿、正丁醇（均为分析纯）：成都市科隆化学品有限公司。其他试剂均为国产分析纯。
1.2 仪器与设备
GI54DWS型立式自动蒸汽压力灭菌器：致微（厦门）仪器有限公司；SPX-150B-Z型生化培养箱：上海博迅实业有限公司医疗设备厂；HNY-200B恒温培养振荡器：天津市欧诺仪器仪表有限公司；WFJF200分光光度计：尤尼柯（上海）仪器有限公司。
1.3 方法
1.3.1 鼠李糖乳杆菌R5产胞外多糖发酵条件优化
（1）单因素试验
初始发酵条件：将鼠李糖乳杆菌R5划线接种于MRS固体培养基中，37 ℃活化培养24 h；挑取单菌落接种于MRS液体培养基中，37 ℃活化24 h；按2%（V/V）的接种量接种于MRS液体培养基，37 ℃培养24 h，在此条件下，EPS产量为678.01 mg/L。
在MRS液体培养基的基础上，采用不同氮源替换MRS液体培养基中的蛋白胨、牛肉粉和酵母粉，分别研究氮源种类（蛋白胨、牛肉粉、酵母粉、大豆蛋白胨、胰蛋白胨）（添加量3%）及最佳氮源添加量（1%、2%、3%、4%、5%、6%）、葡萄糖添加量（1%、2%、3%、4%、5%、6%）、接种量（1%、2%、3%、4%、5%、6%）、发酵时间（24 h、36 h、48 h、60 h、72 h）、发酵温度（23 ℃、30 ℃、37 ℃、44 ℃、51 ℃）对鼠李糖乳杆菌R5产EPS的影响。
（2）响应面试验
根据单因素试验，选取对鼠李糖乳杆菌R5产EPS影响显著的3个因素葡萄糖添加量（X1）、酵母粉添加量（X2）、接种量（X3）为考察因素，EPS产量（Y）为响应值，利用Design-Expert 8.0.6软件设计3因素3水平响应面试验[21]，试验因素与水平见表1。
表1 鼠李糖乳杆菌R5产胞外多糖发酵条件优化响应面试验因素与水平
Table 1 Factors and levels of response surface test for exopolysaccharide production by Lactobacillus rhamnosus R5
1.3.2 胞外多糖含量的测定
参考李仪琳[22]的方法提取胞外多糖，并做适当改进。取发酵液10 mL在4 ℃、8 000 r/min条件下离心10 min，取上清液，加入1/3体积的Sevag试剂（氯仿∶正丁醇=4∶1，V/V），振荡10 min后，4 000 r/min离心15 min，收集上层水相溶液，重复以上操作至两相之间无蛋白质层为止。随后加入3倍体积的冰冻无水乙醇，放置在4 ℃冰箱中冷藏。第2天取出，最终可以观测到多糖沉淀析出，再于4 ℃、6 000 r/min离心30 min，用等体积蒸馏水溶解沉淀，可得胞外多糖提取液，冷冻干燥得到胞外多糖。
采用苯酚-硫酸法测定总糖含量[23]，采用3,5-二硝基水杨酸比色法测定还原糖含量[24]，并计算胞外多糖含量，其计算公式如下：
EPS含量=总糖含量-还原糖含量
1.3.3 发酵动力学模型的构建
（1）生长动力学模型建立
利用Logistic方程描述鼠李糖乳杆菌R5在优化条件下的生长规律，其微分方程为（1）：
式中：dX/dt为菌体的生长速率，g/（L·h）；X为菌体质量浓度，g/L；t为发酵时间，h；μm为最大比生长速率，h-1；Xm为最大菌体质量浓度，g/L。
当t=0，X=X0时，对公式（1）进行积分，得到积分式为公式（2）：
式中：X0为初始菌质量浓度，g/L。
（2）产物合成动力学模型建立
采用Luedeking-Piret方程描述产物生成随时间变化过程，其微分方程为（3）：
式中：dP/dt为产物合成速率，g/（L·h）；P为产物的质量浓度，g/L；α为与菌体生长速率有关联的产物合成常数；β为与菌体浓度有关联的产物合成常数。
当t=0，P=0时，对公式（1）和（3）进行积分，得积分式为公式（4）：
（3）底物消耗动力学模型建立
选用Luedeking方程建立底物消耗动力学模型，其微分方程为（5）：
式中：dS/dt为底物消耗速率，g/（L·h）；S为葡萄糖质量浓度，g/L，Yx为菌体对底物的得率，g/g；Yp为产物对底物的得率，g/g；θ为菌体维持系数因子，h-1。
当t=0，S=S0，对公式（1）、（3）、（5）进行积分，得积分式为公式（6）：
1.3.4 模型验证试验
按照响应面试验的最优条件进行发酵，每隔2 h取样，测定EPS产量、OD600nm值、葡萄糖含量。
1.3.5 数据处理
采用Origin 8.0软件对数据进行处理，并进行模型参数非线性拟合和检验。
2 结果与分析
2.1 鼠李糖乳杆菌R5产胞外多糖发酵条件优化
2.1.1 单因素试验
鼠李糖乳杆菌R5产EPS发酵条件优化单因素试验结果见图1。由图1可知，5种氮源中，酵母粉对EPS产量影响最大，EPS产量达到最高，691.65 mg/L，其添加量为4%时，EPS产量达到最高，为834.30 mg/L。当葡萄糖添加量为4%时，EPS产量最高，为819.74 mg/L。当接种量为5%时，EPS产量最高，为971.28 mg/L。不同发酵时间对鼠李糖乳杆菌R5的EPS产量影响较小，当发酵时间为24 h，EPS产量最高，为675.13 mg/L。当培养温度为37 ℃时，EPS产量最高，为690.67 mg/L。综上，选择最佳氮源种类为酵母粉，酵母粉最佳添加量为4%，葡萄糖最佳添加量为4%，最佳接种量为5%，最佳发酵时间为24 h，最佳发酵温度为37 ℃。
图1 不同发酵条件对鼠李糖乳杆菌R5产胞外多糖的影响
Fig.1 Effect of different fermentation conditions on exopolysaccharide production by Lactobacillus rhamnosus R5
2.1.2 响应面试验结果
根据单因素试验，固定发酵时间为24 h，发酵温度为37 ℃，选取对鼠李糖乳杆菌R5产EPS影响显著的3个因素葡萄糖添加量（X1）、酵母粉添加量（X2）、接种量（X3）为考察因素，以EPS产量（Y）为响应值，利用Design-Expert 8.0软件设计3因素3水平响应面试验[21]，试验设计及结果见表2，方差分析见表3。
表2 鼠李糖乳杆菌R5产胞外多糖发酵条件优化响应面试验设计及结果
Table 2 Design and results of response surface test for exopolysaccharide production by Lactobacillus rhamnosus R5
表3 回归模型方差分析结果
Table 3 Variance analysis of the regression model
注：“*”表示对结果影响显著（P＜0.05）；“**”表示对结果影响极显著（P＜0.01）。下同。
通过Design-Expert 8.0.6软件对表2中数据进行多元回归拟合分析，得到二次回归拟合方程：Y=-2 965+515.8X1+1 049.0X2+388X3-96.78X12-143.92X22-60.21X32+18.75X1X2+40.76X1X3+8.10X2X3。
由表3可知，该模型P=0.000 3＜0.01，极显著，而失拟项P=0.534 9＞0.05，不显著，说明模型拟合度好。根据F值大小可以看出，3个因素对EPS产量的影响次序为：葡萄糖添加量＞接种量＞酵母粉添加量。模型决定系数R2=0.988 1，表明模型的相关性很好，调整决定系数R2Adj=0.966 6，表明此模型能解释96.66%响应值变化，变异系数（coefficient of variation，CV）表示试验的精确度，其值越大，试验结果的可靠性越低。CV=1.75%，较低，说明模型精确度高，可用此模型对鼠李糖乳杆菌R5的EPS产量进行预测。
通过响应面优化得到最优发酵条件为：葡萄糖添加量4.09%、酵母粉添加量4.05%、接种量4.89%。在该优化条件下，EPS产量的理论值为1 184.31 mg/L，为便于实际操作，将最优条件修正为葡萄糖添加量4%、酵母粉添加量4%、接种量5%，在此条件下进行验证试验，得到EPS产量为1 138.31 mg/L，是优化前（678.01 mg/L）的1.68倍，与预测值基本一致，可见该模型能较好地预测鼠李糖乳杆菌R5产EPS的情况。孔德卉等[25]也做了类似的研究，当接种量为3.5%，培养温度为39 ℃，乳糖质量浓度为45 g/L时，植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）胞外多糖的产量能够达到1 498.91 μg/mL，是优化前（1 012.6 μg/mL）的1.48倍，提高了48%；刘燕[26]研究发现，在培养温度为39 ℃，培养时间14.2 h，初始pH值6.9条件下，德式乳杆菌保加利亚亚种（Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus）的EPS产量提高17.8%；胡盼盼[27]研究发现，当发酵温度为37 ℃、发酵时间为12.8 h、初始pH值为7.7、菌体浓度为108 CFU/m L时，副干酪乳杆菌副干酪亚种（Lactobacillus paracasei subsp. paracasei）M5L的胞外多糖产量达到最高，为167.2 mg/mL，是优化前（128.3 mg/mL）的1.3倍。与这些研究结果相比，本研究EPS产量处于一个较高水平。
2.2 鼠李糖乳杆菌R5的发酵动力学模型建立及验证
2.2.1 模型参数求解及模型建立
采用Origin8.0软件对鼠李糖乳杆菌R5产EPS的动力学方程（2）、（4）、（6）式进行非线性拟合，所得动力学参数，结果见表4。
表4 发酵动力学模型参数
Table 4 Parameters of fermentation kinetic models
将所得模型参数值代入（2）、（4）、（6）式，得到菌体生长、产物合成和底物消耗动力学模型分别为公式（7）、（8）、（9）。
2.2.2 模型验证
为确定实验拟合模型的可靠性，对模型的预测值和试验值进行比对，结果见表5。
表5 鼠李糖乳杆菌R5发酵动力学模型预测值与试验值比较结果
Table 5 Comparison results of predicted values and experimental values of Lactobacillus rhamnosus R5 fermentation kinetics model
由表5可知，模型的预测值与试验值相对误差均＜15%，说明预测值与试验值相近。采用Origin 8.0软件对鼠李糖乳杆菌R5产EPS的发酵动力学模型实验值及理论值分别进行拟合分析，结果见图2。由图2可知，模型拟合曲线的相关系数分别为0.992 5、0.998 9和0.998 8，均＞0.98，表明模型的拟合效果良好，能够较好地反映实际的发酵过程。
图2 鼠李糖乳杆菌R5产胞外多糖的细胞生长（a）、产物合成（b）、底物消耗（c）动力学模型实验值及理论值的拟合曲线
Fig.2 Fitting curves of cell growth (a),product synthesis (b),substrate consumption (c) for predicted values and experimental values of kinetics model of exopolysaccharide produced by Lactobacillus rhamnosus R5
3 结论
通过单因素试验和响应面试验优化得到鼠李糖乳杆菌R5产EPS的最佳培养条件：葡萄糖添加量4%、酵母粉添加量4%、接种量5%、发酵温度37 ℃、发酵时间24 h，在此优化条件下，EPS产量为1 138.31 mg/L，是优化前（678.01 mg/L）的1.68倍。通过建立发酵动力学模型，可以实时监控发酵过程中菌体生长、产物合成、底物消耗的变化规律。模型拟合结果表明，模型的相关系数均＞0.98，拟合情况良好，预测值与试验值相近，相对误差均＜15%，模型能很好地反映发酵过程规律，表明可通过构建发酵动力学模型对鼠李糖乳杆菌R5产EPS情况进行预测和描述，为其后序的工业生产应用提供基础理论支持。
[1]周航，王薇薇，王丽，等.饲用乳酸菌制剂的开发利用研究进展[J].动物营养学报，2019，31（5）：2012-2021.
[2]JANG S Y,HEO J,PARK M R,et al.Genome characteristics of Lactobacillus fermentum strain JDFM216 for application as probiotic bacteria[J].J Microbiol Biotechnol,2017,27(7):1266-1271.
[3]孙钰薇，张诗瑶，刘志佳，等.发酵食品中乳酸菌的健康功效研究进展[J].食品与发酵业，2021，47（23）：280-287.
[4]TIAN F W,CHH F F,WANG G,et al.Lactobacillus rhamnosus CCFM1107 treatment ameliorates alcohol-induced liver injury in a mouse model of chronic alcohol feeding[J].J Microbiol,2015,53:856-863.
[5]李权威，张开屏，赵艳红，等.风干羊肉中乳酸菌的体内外抗氧化特性[J].微生物学通报，2020，47（12）：4094-4104.
[6]吴映梅，徐龙泉，王瑶佳，等.薏苡仁乳酸菌发酵工艺优化及活性成分变化分析[J].食品研究与开发，2022，43（17）：127-133.
[7]王明哲，杨颖，唐伟敏，等.戊糖乳杆菌YY112产胞外多糖的发酵工艺条件优化[J].浙江农业学报，2020，32（2）：327-336.
[8]GHANY K,ELHAFEZ E A,HAMOUDA R A,et al.Evaluation of antioxidant and antitumor activities of Lactobacillus acidophilus bacteria isolated from Egyptian infants[J].Int J Pharmacol,2014,10(5):282-288.
[9]RANI R P,ANANDHARAJ M,RAVINDRAN A D.Characterization of a novel exopolysaccharide produced by Lactobacillus gasseri FR4 and demonstration of its in vitro biological properties[J].Int J Biol Macromol,2018,109:772-783.
[10]SUNGUR T,ASLIM B,KARAASIAN C,et al.Impact of exopolysaccharides(EPSs)of Lactobacillus gasseri strains isolated from human vagina on cervical tumor cells(HeLa)[J].Anaerobe,2017,47:137-144.
[11]LI F S,HU X,QIN L Y,et al.Characterization and protective effect against ultraviolet radiation of a novel exopolysaccharide from Bacillus marcorestinctum QDR3-1[J].Int J Biol Macromol,2022,221: 1373-1383.
[12]DILNA S V,SURYA H K,ASWATHY R G,et al.Characterization of an exopolysaccharide with potential health-benefit properties from a probiotic Lactobacillus plantarum RJF 4[J].LWT-Food Sci Technol,2015,64(2):1179-1186.
[13]ZHU W J,WANG Y Z,YAN F,et al.Physical and chemical properties,percutaneous absorption-promoting effects of exopolysaccharide produced by Bacillus atrophaeus WYZ strain[J].Carbohyd Polym,2018,192:52-60.
[14]王烁，姜静，杜仁鹏，等.乳酸菌胞外多糖的生物合成、特性和应用[J].生物技术，2022，32（3）：394-401.
[15]DABA G M,ELNAHAS M O,ELKHATEEB W A.Contributions of exopolysaccharides from lactic acid bacteria as biotechnological tools in food,pharmaceutical,and medical applications[J].Int J Biol Macromol,2021,173:79-89.
[16]DANIEL A,ERICA R,FRESNO J M,et al.Study of exopolysaccharides from lactic acid bacteria and their industrial applications: a review[J].Int J Food Sci Technol,2021,57(1):16-26.
[17]后立琼.苗族酸汤中乳酸菌的分离鉴定及发酵动力学模型研究[D].成都：四川农业大学，2012.
[18]欧红艳，赵良忠，刘婷，等.豆清饮料发酵及贮藏过程中品质变化及动力学研究[J].大豆科学，2021，40（4）：528-538.
[19]王园园，王康，金令凯，等.阿维拉霉素发酵工艺优化及动力学模型建立[J].高校化学工程学报，2019，33（5）：1156-1163.
[20]雷霜江，吕青遥，王文杰，等.屎肠球菌R40产胆盐水解酶发酵动力学及底物特异性分析[J].中国酿造，2021，40（11）：144-148.
[21]JAFARI F,MOVAGHARNEJAD K,SADEGHI E.Infrared drying effects on the quality of eggplant slices and process optimization using response surface methodology[J].Food Chem,2020,333:127423.
[22]李仪琳.乳酸菌胞外多糖制备与结构鉴定及应用研究[D].西安：陕西科技大学，2019.
[23]陶静，凌飞跃，张博，等.乳酸乳球菌胞外多糖提取纯化工艺研究[J].中国食品添加剂，2019，30（10）：100-104.
[24]李志霞，聂继云，闫震，等.响应面法对3,5-二硝基水杨酸比色法测定水果中还原糖含量条件的优化[J].分析测试学报，2016，35（10）：1283-1288.
[25]孔德卉，蒋家璇.高产胞外多糖能力的乳酸菌筛选及其培养条件的优化[J].兰州文理学院学报，2020，34（3）：53-59.
[26]刘燕.高产胞外多糖乳酸菌的筛选及培养基优化方法的研究[D].郑州：河南农业大学，2009.
[27]胡盼盼.乳酸菌胞外多糖发酵条件优化及抗肿瘤活性的研究[J].中国酿造，2020，39（8）：187-192.