辣木（Moringa oleifera Lam.）又称鼓槌树（Drumstick tree），原产于印度北部，现在我国湖南省及海南省等地有大量种植[1]。辣木被列为我国药食两用的植物，并于2012年被我国卫生部批准认定为新资源食品是具有发展前景的新资源植物[2]。辣木叶在一些国家被广泛用作基本食物，含有丰富的营养物质如蛋白质、纤维素、维生素、矿物质等，其含有的抗营养成分较少，能有效地抵抗营养不良[3]。目前，市面上的辣木加工制品有粮食替代品、养生食材、保健品、日用品、化妆品原料、饲料添加剂、生物农药、废水处理剂等[4-5]，还鲜见辣木饮料。
乳酸菌发酵是最简单、有效保持和提高果蔬风味、营养、品质、保质期的加工方式[6]。乳酸菌发酵饮料是风味独特，集口感、营养于一体。乳酸菌发酵果蔬汁不含有过敏原，胆固醇含量低，并且含有丰富的益生元，具有很高的营养价值[7]，因此受到越来越多的关注。CICHON′SKA P等[8]用乳酸菌和丙酸杆菌（Propioni bacterium）发酵米基饮料，结果表明，两种菌有助于生产以大米为基础的酸奶型牛奶替代品。徐勇士等[9]利用酵母菌和乳酸菌二步发酵生产甘蔗原汁乳酸发酵型饮料，使饮料中总酚和总黄酮含量分别提高了15.35%和39.70%。目前，我国的辣木系列饮料中，大多为辣木茶、乳和复合饮料，周艳等[10]将辣木叶粉接种嗜酸乳杆菌（Lactobacillus acidophilus）、酵母菌、罗伊氏乳杆菌（Lactobacillus reuteri）发酵后加入核桃浆制成辣木高钙核桃乳。
本研究以辣木为原料，以植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）为发酵菌种，制备辣木叶发酵饮料，并测定其理化指标和微生物指标，并进行感官评价，以期为辣木产品的开发利用提供新思路，促进相关产业的发展，为辣木饮料规模化生产奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
1.1.1 材料与菌株
辣木（Moringa oleifera Lam.）叶：云南省德宏傣族景颇族自治州；白砂糖、魔芋胶（食品级）、木糖醇：市售；植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）：中国工业微生物菌种保藏管理中心。
1.1.2 试剂
考马斯亮蓝G250、谷氨酸、三氯乙酸、Gly-Gly-Tyr-Arg四肽标准品（纯度≥98%）、茚三酮、氯化亚锡（均为分析纯）：上海源叶生物科技有限公司；硫酸、磷酸（均为分析纯）：重庆川东化工（集团）有限公司；牛血清白蛋白（纯度＞98%）：上海伯奥生物科技有限公司；柠檬酸（分析纯）：阿拉丁试剂（上海）有限公司。
1.2 仪器与设备
TDZ5-WS多管架自动平衡离心机：上海卢湘仪离心机仪器有限公司；JM-B6102电子天平：余姚市纪铭称重校验设备有限公司；LRH-250 生化培养箱、HWS24电热恒温水浴锅：上海一恒科学仪器有限公司；SX500高压灭菌锅：上海安亭科学仪器厂；A360紫外可见分光光度计：翱艺仪器（上海）有限公司。
1.3 方法
1.3.1 辣木叶发酵饮料的加工工艺流程及操作要点
辣木叶→洗净、护色→榨汁→过滤→成分调整、均质→灭菌→冷却→接种→发酵→密封→成品→4 ℃冷藏
操作要点[11]：
辣木叶汁的制备：挑选新鲜、叶绿的辣木鲜叶清洗干净后置于沸水中10 s，然后置入4 ℃水中冷却护色，沥干水分，于料液比为1∶5（g∶mL）条件下加入水破碎打浆，用800目滤网过滤得到辣木叶汁。
成分调整、均质：向辣木叶汁中添加15%的木糖醇、1%魔芋胶和3%柠檬酸，于高压均质机（17 MPa）均质10 min[12]。
灭菌：将均质后的料液置于105 ℃条件下灭菌15 min[13]，冷却待用。
接种、发酵：在无菌环境下，菌种在30 ℃条件下培养72 h进行活化[14]，将活化后的植物乳杆菌按1%接种量（V/V）接种至灭菌后的料液中，30 ℃恒温下发酵72 h后封口膜密封后得到辣木叶发酵饮料成品[15]，于4 ℃冷藏。
1.3.2 辣木叶发酵饮料发酵条件优化单因素试验
以辣木叶发酵饮料的感官评分和蛋白质含量作为评价指标，辣木叶与水的料液比（1∶3、1∶4、1∶5、1∶6、1∶7（g∶mL））、植物乳杆菌接种量（0.50%、0.75%、1.00%、1.25%、1.50%）、木糖醇添加量（5%、10%、15%、20%、25%），考察不同因素对辣木叶发酵饮料品质的影响。
1.3.3 辣木叶发酵饮料发酵条件优化响应面试验
以单因素试验结果为基础，对辣木叶与水的料液比（A）、植物乳杆菌接种量（B）、木糖醇添加量（C）为自变量，以感官评分（Y）为响应值，利用Design-ExpertV8.0.6软件中的Box-Behnken试验进行3因素3水平的响应面试验，Box-Behnken试验设计因素与水平见表1。
表1 发酵条件优化响应面试验设计因素与水平
Table 1 Factors and levels of response surface experiments for fermentation conditions optimization
表2 辣木叶发酵饮料的感官评价标准
Table 2 Sensory evaluation standards of fermented beverage from Moringa oleifolia leaves
1.3.4 理化指标与微生物指标检测
总酸的测定：参考GB 12456—2021《食品安全国家标准食品中总酸的测定》[16]；pH值的测定：采用pH计；可溶性固形物的测定：参考GB/T 12143—2008《饮料通用分析方法》[17]；总糖的测定：参考苯酚-硫酸法[18]；脂肪的测定：参考GB 5009.6—2016《食品安全国家标准食品中脂肪的测定》[19]；蛋白质的测定：参考GB 5009.5—2016《食品安全国家标准食品中蛋白质的测定》[20]；可溶性固形物含量的测定：参考QB/T 5341—2018《格瓦斯发酵饮料》[21]；菌落总数的测定：GB 4789.2—2022《食品安全国家标准食品微生物学检验菌落总数测定》[22]；大肠杆菌的测定：GB 4789.3—2016《食品安全国家标准食品微生物学检验大肠菌群计数》[23]。
1.3.5 感官评价
参照文献[24-26]中辣木饮品的感官评价方法制定辣木叶发酵饮料的感官评价标准，由10名食品专业人员组建感官评价小组，从色泽、滋味与气味、口感及组织形态4个方面对辣木叶发酵饮料进行感官评价，满分为100分，感官评分取平均值。
1.3.6 数据处理
采用Origin 8.0软件以及Design-Expert8.0.6软件处理数据及绘图。
2 结果与分析
2.1 发酵条件优化单因素试验结果
2.1.1 辣木叶与水料液比的确定
由图1可知，辣木叶与水的料液比为1∶3、1∶4、1∶5（g∶mL）时，辣木叶发酵饮料的感官评分与蛋白质含量均呈上升趋势；当辣木叶与水的料液比为1∶5（g∶mL）时，感官评分与蛋白质含量均达到最大值，分别为93.9分、36.53 mg/mL；当辣木叶与水的料液比为1∶6、1∶7（g∶mL）时，感官评分与蛋白质含量均呈下降趋势。其原因可能是水分含量低时，辣木叶独有的苦涩味较大影响口感，导致感官评分较低，营养物质无法完全浸出，导致蛋白质含量较低，水分含量高时，饮料的味道变淡，影响口感[12]。因此，确定最佳辣木叶与水的料液比为1∶5（g∶mL）。
图1 料液比对辣木叶发酵饮料感官评分和蛋白质含量的影响
Fig.1 Effect of solid and liquid ratio on sensory score and protein contents of fermented beverage from Moringa oleifolia leaves
2.1.2 植物乳杆菌接种量的确定
由图2可知，随着接种量在0.50%～1.00%范围内的增加，辣木叶发酵饮料的感官评分和蛋白质含量呈增加趋势；当接种量为1.00%时，感官评分和蛋白质含量达到最高值，分别为93.2分、35.87 mg/mL；当接种量＞1.00%时，感官评分和蛋白质含量逐渐下降。其原因可能是，菌种量较少，发酵的速率较慢，而菌种量较高时，营养成分不足，导致部分菌种不能生长，且发酵产生的酸类化合物，影响产品口感和品质[27-28]。因此，确定植物乳杆菌最佳接种量为1.00%。
图2 接种量对辣木叶发酵饮料感官评分和蛋白质含量的影响
Fig.2 Effect of inoculum on sensory score and protein contents of fermented beverage from Moringa oleifolia leaves
2.1.3 木糖醇添加量的确定
由图3可知，随着木糖醇含量在5%～15%范围内的增加，蛋白质含量感官评分和蛋白质含量逐渐增加；当木糖醇添加量为15%时，感官评分和蛋白质含量逐渐达到最大值，分别为92.9分、34.99 mg/mL；当木糖醇添加量＞15%时，感官评分和蛋白质含量逐渐下降。因此，确定木糖醇添加量为15%。
图3 木糖醇添加量对辣木叶发酵饮料感官评分和蛋白质含量的影响
Fig.3 Effect of xylitol addition on sensory score and protein contents of fermented beverage from Moringa oleifolia leaves
2.2 发酵条件优化响应面试验结果与分析
根据单因素试验结果，以料液比（A）、植物乳杆菌接种量（B）及木糖醇添加量（C）为自变量，感官评分（Y）为响应值，设计3因素3水平的响应面试验，响应面试验设计及结果见表3。
表3 发酵饮料发酵条件优化响应面试验设计及结果
Table 3 Design and results of response surface tests for fermentation conditions optimization of fermented beverage
采用Design-Expert 8.0.6软件对表4的试验数据进行多元回归拟合，得到感官评分（Y）对自变量的二次多项式回归模型方程为：
表4 回归模型方差分析
Table 4 Variance analysis of regression model
由表4可知，模型极显著（P＜0.000 1），失拟项不显著（P值=0.635 4＞0.05），模型的决定系数R2=0.976 5，调整决定系数R2Adj=0.946 3，表明模型可以解释97.65%的感官评分变化，模型拟合度良好，试验误差小，可以用该模型进行试验预测。由P值可知，一次项B、C、二次项A2、B2和C2、交互项BC极显著（P＜0.01），其他项不显著（P＞0.01）。由F值可知，各因素影响对感官评分影响的主次顺序为接种量（B）＞木糖醇添加量（C）＞料液比（A）。
各因素间交互作用对辣木叶发酵饮料感官评分影响的响应面和等高线见图4。
图4 各因素间交互作用对辣木叶发酵饮料感官评分影响的响应曲面和等高线
Fig.4 Response surface plots and contour lines of effects of interaction between various factors on sensory score of fermented beverage from Moringa oleifolia leaves
两个因素交互作用的显著性与响应面面的陡峭程度有关，坡面越陡，说明两个因素交互作用对响应值的影响越显著[29]。由图4可知，植物乳杆菌接种量（B）与木糖醇添加量（C）的响应面较陡，交互作用显著，这与方差分析结果一致。
2.3 模型验证试验
通过Design Expert 8.0.6软件分析得到最佳的发酵工艺条件为辣木叶和水的料液比1.0∶4.8（g∶mL）、植物乳杆菌接种量0.94%、木糖醇添加量16.43%，在此优化发酵条件下，辣木叶发酵饮料的感官评分预测值为89.36分。考虑实际操作可行性，将发酵工艺条件修正为：辣木叶和水的料液比1∶5（g∶mL）、接种量1%、木糖醇添加量16.5%。在此发酵工艺条件下进行3次重复验证试验，得到辣木叶发酵饮料的感官评分实际值为89.16分。该模型预测值与实际值的误差在合理范围之内，表明该工艺条件具有可行性。
2.4 理化指标与微生物指标的检测结果与分析
辣木叶发酵饮料的理化指标与微生物指标的检测结果见表5。
表5 辣木发酵饮料理化指标与微生物指标的检测结果
Table 5 Determination results of physicochemical and microbiological indexes of fermented beverage from Moringa oleifolia leaves
由表5可知，辣木叶发酵饮料理化指标中蛋白质含量较高（4.32 g/100 g），辣木叶发酵饮料中的大肠杆菌数和菌落总数均符合GB 7101—2022《食品安全国家标准饮料》[30]。
3 结论
通过单因素试验及响应面法获得辣木叶发酵饮料的最佳发酵工艺条件为辣木叶和水的料液比1∶5（g∶mL）、植物乳杆菌接种量1%、木糖醇添加量16.5%、发酵温度30 ℃、发酵时间72 h，在此优化工艺条件下，辣木叶发酵饮料的感官评分为89.16分。其可溶性固形物含量为（26.84±0.12）%、总糖含量为（16.35±0.20）g/100 g、pH值3.68±0.18、蛋白质含量为（4.32±0.08）g/100 g、脂肪含量为（1.96±0.16）g/100 g，其微生物指标符合相关的国家标准要求。本研究结果可为辣木发酵饮料工厂化、规模化生产奠定基础，在辣木饮料内在质量评价及资源开发利用方面有重要价值。
[1]HORWATH M,BENIN V,et al.Theoretical investigation of a reported antibiotic from the miracle tree Moringa oleifera[J].Comput Theor Chem,2011,965(1):196-201.
[2]王丽虹，刘阳，姜圆圆，等.辣木叶中有效成分提取及生理功能研究进展[J].食品科技，2020，45（6）：267-271.
[3]沙子珺，唐仕欢，李志勇，等.基于文本挖掘与分子对接技术的辣木叶功能定位研究[J].中国中药杂志，2020，45（2）：331-340.
[4]阎树屏，战铁铮，陈建康.辣木的发展现状及前景[A].中国科学技术协会、云南省人民政府.第十六届中国科协年会——分11森林培育技术创新与特色资源产业发展学术研讨会论文集[C].中国科学技术协会、云南省人民政府：中国科学技术协会学会学术部，2014：362-365.
[5]刘凤霞，王苗苗，赵有为，等.辣木中功能性成分提取及产品开发的研究进展[J].食品科学，2015，36（19）：5.
[6]FILANNINO P,AZZI L,CAVOSKI I,et al.Exploitation of the healthpromoting and sensory properties of organic pomegranate(Punica granatum L.)juice through lactic acid fermentation[J].Int J Food Microbiol,2013,163(2):184-192.
[7]王玥，杨明美，李梦丽，等.柿子乳酸菌发酵饮料的加工工艺研究[J].中国食品学报，2020，20（7）：118-125.
[8]CICHON′ SKA P,ZI BICKA A,ZIARNO M.Properties of rice-based beverages fermented with lactic acid bacteria and Propioni bacterium[J].Molecules,2022,27(8):2558.
[9]徐勇士，魏勃，魏甜甜，等.甘蔗原汁乳酸发酵饮料的工艺[J].食品工业，2021，42（5）：186-191.
[10]周艳，赵存朝，史崇颖，等.辣木高钙核桃乳制备工艺[J].食品与发酵工业，2019，45（21）：173-179.
[11]田洋，宋爽，朱艳丽，等.含有辣木叶的饮料及其加工方法和应用：CN106261420A[P].2017-01-04.
[12]盛洁，田欢，刘原野，等.响应面法优化红枣益生菌发酵饮料工艺[J].中国酿造，2021，40（2）：203-209.
[13]张锐，于天颖，陈玉成，等.微波-热水法制备枣汁饮料工艺研究[J].北方园艺，2013（3）：3.
[14]白长胜，孟维珊，李进，等.自然界中大豆秸秆发酵用优良乳酸菌的分离筛选[J].现代畜牧科技，2020（10）：8-11.
[15]李文杰，谭明璐，奚楚瑜，等.发酵对辣木饮料中营养成分的变化研究[J].热带农业科学，2022，42（11）：90-94.
[16]中华人民共和国国家卫生健康委员会，国家市场监督管理总局.GB 12456—2021食品安全国家标准食品中总酸的测定[S].北京：中国标准出版社，2021.
[17]中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局，中国国家标准化管理委员会.GB/T 12143—2008饮料通用分析方法[S].北京：中国标准出版社，2008.
[18]刘春宇，朱振元，孙会轻，等.蛹虫草、山楂提取物固体饮料制备工艺研究[J].食品研究与开发，2018，39（24）：77-82.
[19]中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会，国家食品药品监督管理总局.GB 5009.6—2016食品安全国家标准食品中脂肪的测定[S].北京：中国标准出版社，2016.
[20]中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会，国家食品药品监督管理总局.GB 5009.5—2016食品安全国家标准食品中蛋白质的测定[S].北京：中国标准出版社，2016.
[21]中华人民共和国工业和信息化部.QB/T 5341—2018格瓦斯发酵饮料[S].北京：中国标准出版社，2018.
[22]中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会，国家食品药品监督管理总局.GB 4789.2—2022食品安全国家标准食品微生物学检验菌落总数测定[S].北京：中国标准出版社，2022.
[23]中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会，国家食品药品监督管理总局.GB 4789.3—2016食品安全国家标准食品微生物学检验大肠菌群计数[S].北京：中国标准出版社，2016.
[24]杨洋，高航，白琳，等.辣木乳饮料制作工艺研究[J].中国奶牛，2015（Z3）：41-44.
[25]邢军梅，李志忠，任海伟，等.基于模糊数学感官评价法的辣木保健饮料研制[J].粮油加工（电子版），2015（7）：58-60，64.
[26]熊瑶.辣木叶蛋白质提取及其饮品研制[D].福州：福建农林大学，2012.
[27]钱籽霖.乳酸菌发酵拐枣汁工艺优化及抗氧化活性评价[D].重庆：西南大学，2019.
[28]LI C,REN Y,JIANG S,et al.Effects of dietary supplementation of four strains of lactic acid bacteria on growth,immune-related response and genes expression of the juvenile sea cucumber Apostichopus japonicus Selenka[J].Fish Shellfish Immunol,2018,74:69-75.
[29]李翔，邓杰，徐宏，等.响应面法优化羊肚菌红枣复合营养粉的加工工艺[J].食品研究与开发，2019，49（17）：58-63.
[30]中华人民共和国国家卫生健康委员会，国家市场监督管理总局.GB 7101—2022食品安全国家标准饮料[S].北京：中国标准出版社，2022.