软枣猕猴桃（Actinidia arguta）又称软枣子，属于猕猴桃科的藤本植物，成熟的软枣猕猴桃个体饱满、甘甜多汁、富含维生素、多酚等物质，具有很高的营养价值与药用价值[1]。目前，我国软枣猕猴桃仍以鲜食为主，由于软枣猕猴桃是典型的呼吸跃变型果实，成熟期集中，果体柔软、鲜果易腐烂，不易贮存，造成资源浪费[2]。将其加工成产品是解决软枣猕猴桃不易贮藏的主要方式，现有软枣猕猴桃产品有果汁、果酒、果脯等[3]。其中，软枣猕猴桃加工后的成果酒具有独特香气和营养，具有广阔的市场开发潜力和可观的经济效益，对丰富软枣猕猴桃产品种类、增加产品附加值具有十分重要的意义[4-5]。
果酒是以新鲜水果或果汁为原料，经发酵酿制而成的低度饮料酒[6]。果酒的酿造历史悠久，且富含各种营养物质，广受消费者喜爱[7]。目前，软枣猕猴桃果酒主要是全浆发酵，发酵菌种多采用果酒酵母[8]。酵母发酵特性直接影响果酒的口感、风味以及理化指标。目前，混菌发酵是果酒酿造工业中常用的方法，其利用不同微生物代谢提供丰富的代谢产物，赋予发酵酒独特的风味[9-10]。刘晓艳等[11]研究发现混菌发酵对柿子酒风味有明显改善。金海炎等[12]研究结果表明，混菌发酵猕猴桃果酒的抗氧化能力整体优于单菌发酵的猕猴桃果酒。许强等[13]在混菌发酵的桑葚酒中共检出28种主要挥发性成分，较单菌发酵的桑葚酒多6种挥发性成分，赋予了桑葚酒水果的香味，改善了桑葚酒的品质。但目前软枣猕猴桃果酒的研究较少，尚无针对软枣猕猴桃果酒酿造的专用酵母和酿造工艺，制约着软枣猕猴桃果酒的发展[8]。
本研究以软枣猕猴桃为原料，分别选用7种单菌酵母及其5种组合酵母酿造软枣猕猴桃果酒，对其平均每日降糖量、出酒率及软枣猕猴桃果酒的pH值、酒精度、还原糖、总酸、维生素C、总酯和甲醇含量进行测定，并进行感官评价，筛选适合于软枣猕猴桃果酒发酵的酵母菌，为软枣猕猴桃果酒规模化生产提供技术支持，进一步促进软枣猕猴桃产业的发展。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
1.1.1 材料与菌株
软枣猕猴桃：采于佳木斯大学农林实验实习基地；SY型安琪酵母、RW型安琪酵母：安琪酵母股份有限公司；L-au降酸酵母、帝伯仕酵母：烟台帝伯仕自酿机有限公司；71B降酸酵母、L13酵母、拉曼德酵母：拉曼德酵母公司。
1.1.2 试剂
果胶酶（酶活60 000U/g）：沧州夏盛酶生物技术有限公司；白砂糖：市售；葡萄糖、酒石酸钾钠：天津市北方天医化学试剂厂；3,5-二硝基水杨酸（3,5-dinitrosalicylic acid，DNS）：菱湖望菱试剂厂；氢氧化钠：天津市凯通化学试剂有限公司；苯酚、碱性品红：天津市瑞金特化学品有限公司。所用试剂均为国产分析纯。
1.2 仪器与设备
PHS-2C数显酸度计：杭州雷磁分析仪器厂；UV-8000紫外可见分光光度计：上海欣茂仪器有限公司；TD5A低速离心机：盐城市凯特试验仪器有限公司；WT-B分析天平：北京赛多利斯仪器有限公司；MP1002电子天平：烟台帝伯仕商贸有限公司；酒精计：沈阳市卫工玻璃计器厂；2W阿贝折光仪：上海光学仪器有限公司；DKDM调温型电热套：甄诚华鲁电热仪器有限公司；LRH培养箱：上海一恒科学仪器有限公司。
1.3 方法
1.3.1 软枣猕猴桃果酒加工工艺流程及操作要点
操作要点：
软枣猕猴桃预处理：挑选无霉变、破损的软枣猕猴桃果实，清洗、控干、破碎打浆[14]。
果胶酶酶解：软枣猕猴桃匀浆与纯净水按1∶1（g∶g）混合均匀，加入果浆体积0.01%的果胶酶，50 ℃保温酶解2 h[15]。
调整糖度：于酶解后的果浆添加120 g/L蔗糖，调整糖度至170 g/L[16]。
酵母的活化：称取一定质量的干酵母加入10倍质量的5%蔗糖溶液，于35 ℃活化30 min。
接种、发酵：按果浆体积的0.03%接种酵母，于25 ℃发酵至恒质量。
离心、过滤：发酵结束后，发酵液经4 000 r/min离心10 min，使用100目的果酒专业过滤袋过滤。
陈酿：将过滤后的果酒进行低温（10 ℃）陈酿30 d，即得软枣猕猴桃果酒成品。
1.3.2 单菌及混菌发酵试验设计
单菌发酵：在方法1.3.1的基础上，于酶解后的软枣猕猴桃果浆中分别接入0.03%的SY型安琪酵母、RW型安琪酵母、L-au降酸酵母、71B降酸酵母、L13酵母、拉曼德酵母、帝伯仕酵母进行发酵。
混菌发酵：依据单菌发酵结果，选取单菌发酵效果较好的酵母均以1∶1的比例进行组合，添加量均为0.03%，组合方式见表1。
表1 混菌发酵酵母组合方式
Table 1 Combination mode of mixed-yeast fermentation
1.3.3 分析检测
pH值的测定：采用精密数显酸度计[17]；总酸的测定：采用酸碱滴定法[18]；酒精度的测定：采用酒精计法[19]；还原糖含量的测定：采用3,5-二硝基水杨酸法[20]；维生素C含量的测定：采用紫外分光光度法[21]；甲醇含量的测定：采用品红亚硫酸比色法[22]；总酯含量的测定：参考GB/T 10345—2022《白酒分析方法》中的指示剂法[23]。
平均每日降糖量的测定[24]：发酵过程中每隔24 h测定发酵瓶质量，计算每日CO2质量损失，每日质量损失之和为总CO2的释放量，计算平均每日降糖量，其计算公式如下：
出酒率的测定：测定发酵前果浆中的加水量，测定发酵结束的酒液质量，计算出酒率，其计算公式如下：
1.3.4 感官评价
组织10名从事相关专业的人士组成感官评价小组，男女人数等同，从澄清度、气味、滋味3个方面对软枣猕猴桃果酒进行感官评价[25-27]，满分为100分，软枣猕猴桃果酒感官评分标准见表2。
表2 软枣猕猴桃果酒感官评分标准
Table 2 Sensory evaluation standards of Actinidia arguta fruit wine
1.3.5 数据处理
使用SPSS 20.0软件进行统计分析，利用邓肯多重比较法（Duncan）对数据间进行差异显著性分析，P＜0.05表示差异显著。
2 结果与分析
2.1 单菌发酵对软枣猕猴桃果酒发酵的影响
2.1.1 单菌发酵对软枣猕猴桃果酒平均每日降糖量和出酒率的影响
7种酵母菌发酵软枣猕猴桃果酒均在第7天时发酵结束。单菌发酵对软枣猕猴桃果酒平均每日降糖量和出酒率的影响见图1。
图1 单菌发酵对软枣猕猴桃果酒平均每日降糖量和出酒率的影响
Fig.1 Effect of single-yeast fermentation on average daily hypoglycemic content and alcohol yield of Actinidia arguta fruit wine
同一指标不同小写字母表示差异显著（P＜0.05）。下同。
平均每日降糖量可反映酵母发酵能力的强弱[28]，由图1可知，平均每日降糖量由高到低排序的酵母菌为：SY型安琪酵母（4.52 g/d）＞L-au降酸酵母（4.46 g/d）＞L13酵母（4.42 g/d）＞帝伯仕酵母（4.32 g/d）＞拉曼德酵母（4.25 g/d）＞RW型安琪酵母（4.23 g/d）＞71B降酸酵母（4.01 g/d）；71B降酸酵母的平均每日降糖量最低，SY型安琪酵母平均每日降糖量最高。由此可知，SY型安琪酵母发酵性能最好。
由图1亦可知，出酒率由高到低排序的酵母菌为：L13酵母（54.20%）＞L-au降酸酵母（53.75%）＞帝伯仕酵母（50.30%）＞SY型安琪酵母（49.65%）＞RW型安琪酵母（49.60%）＞拉曼德酵母（49.5%）＞71B降酸酵母（42.12%）；L13酵母出酒率最高，71B酵母出酒率最低。由此可知，L13酵母发酵软枣猕猴桃果酒的出酒率最高。
2.1.2 单菌发酵对软枣猕猴桃果酒pH值、酒精度、总酸与还原糖含量的影响
对单菌发酵的软枣猕猴桃果酒pH值、酒精度、总酸与还原糖含量进行测定，结果见表3。
表3 单菌发酵对软枣猕猴桃果酒pH值、酒精度、总酸与还原糖含量的影响
Table 3 Effect of single-yeast fermentation on pH,alcohol content,total acid and reducing sugar contents of Actinidia arguta fruit wine
由表3可知，7种酵母发酵的软枣猕猴桃果酒酒精度由高到低排序酵母菌为：SY型安琪酵母（9.6%vol）＞RW型安琪酵母=L13酵母（9.2%vol）＞L-au降酸酵母（8.8%vol）＞71B降酸酵母（8.3%vol）＞拉曼德酵母（8.0%vol）＞帝伯仕酵母（7.7%vol）；SY型安琪酵母发酵软枣猕猴桃果酒酒精度最高，与其平均每日降糖量最高相吻合，说明SY型安琪酵母发酵力最高。林波等[29]采用安琪葡萄酒酵母对蔗汁进行发酵酿酒，酒精得率高，与本试验研究结果一致。李昌宝等[30]研究发现，不同酵母酿制的果酒酒精度存在较大差异，与本研究结果一致。因此，7种酵母中SY型安琪酵母发酵软枣猕猴桃果酒发酵性能最好。
pH值反映的是果酒的酸碱度，是溶液中已电离的氢离子浓度的负对数；总酸指的是果酒中已电离和未电离的氢离子浓度之和[31]。由表3可知，添加拉曼德酵母发酵的软枣猕猴桃果酒pH值（3.54）高于其他6种酵母发酵的软枣猕猴桃果酒，说明其中已电离的氢离子浓度最低；7种酵母单菌发酵的软枣猕猴桃果酒的总酸含量范围为8.58～10.35 g/L，帝伯仕酵母和SY型安琪酵母发酵软枣猕猴桃果酒总酸含量相对较高，与其pH值相对较低相吻合，说明帝伯仕酵母和SY型安琪酵母发酵果酒中已电离和未电离氢离子浓度均较高。因此，帝伯仕酵母、SY型安琪酵母单独发酵的软枣猕猴桃果酒具有较高的总酸含量和较低的pH值。
7种酵母发酵的软枣猕猴桃果酒还原糖含量由高到低排序的酵母菌为：拉曼德酵母（5.13 g/L）＞帝伯仕酵母（4.80 g/L）＞RW型安琪酵母（4.48 g/L）＞L13酵母（4.40 g/L）＞SY型安琪酵母（4.21 g/L）＞71B降酸酵母（3.96 g/L）＞L-au降酸酵母（3.80 g/L）；L-au降酸酵母发酵软枣猕猴桃果酒还原糖含量最低，说明L-au降酸酵母对糖利用率更好，发酵更彻底。因此，7种酵母中L-au降酸酵母发酵软枣猕猴桃果酒最彻底。
2.1.3 单菌发酵对软枣猕猴桃果酒甲醇、维生素C和总酯含量的影响
对单菌发酵软枣猕猴桃果酒的甲醇、维生素C和总酯含量进行测定，结果见图2。
图2 单菌酵母发酵对软枣猕猴桃果酒的甲醇、维生素C及总酯含量的影响
Fig.2 Effect of single-yeast fermentation on methanol,vitamin C and total ester contents of Actinidia arguta fruit wine
由图2可知，7种酵母发酵的软枣猕猴桃果酒甲醇含量由高到低排序酵母菌为：帝伯仕酵母（149.44 mg/L）＞SY型安琪酵母（139.01 mg/L）＞RW型安琪酵母（136.25 mg/L）＞拉曼德酵母（135.33 mg/L）＞71B降酸酵母（129.96 mg/L）＞L13酵母（125.21 mg/L）＞L-au降酸酵母（121.83 mg/L）；在GB/T 15037—2006《葡萄酒》中要求果酒的甲醇含量≤400 mg/L，7种酵母发酵软枣猕猴桃果酒中的甲醇含量均低于此标准限量要求。白琳[32]采用相同的测定方法测定软枣猕猴桃果酒中甲醇含量，测定结果与本试验结果基本一致。因此，7种酵母中L-au降酸酵母的甲醇产量最少。7种酵母发酵的软枣猕猴桃果酒维生素C含量由高到低排序酵母菌为：RW型安琪酵母（338.03 mg/L）＞SY型安琪酵母（312.30 mg/L）＞L13酵母（311.76 mg/L）＞L-au降酸酵母（298.05 mg/L）＞帝伯仕酵母（277.08 mg/L）＞71B降酸酵母（275.45 mg/L）＞拉曼德酵母（267.03 mg/L）；添加不同酵母发酵软枣猕猴桃果酒维生素C含量差值较大，说明不同酵母发酵软枣猕猴桃果酒对维生素C的保留率不同。因此，7种酵母中RW酵母发酵软枣猕猴桃果酒对维生素C的保留率最高。
酯类物质可赋予果酒香味，总酯含量高低对酒体品质有影响，7种酵母发酵的软枣猕猴桃果酒总酯含量由高到低排序酵母菌为：L-au降酸酵母=71B降酸酵母（410.00mg/L）＞拉曼德酵母=帝伯仕酵母（270.00 mg/L）＞SY型安琪酵母（250.00 mg/L）＞RW型安琪酵母（210.00 mg/L）＞L13酵母（140.00 mg/L）；L-au降酸酵母和71B降酸酵母发酵酒样中总酯含量最高，且与其他酵母相比差异显著（P＜0.05），因此，7种酵母中L-au降酸酵母和71B降酸酵母产酯能力较强。
2.1.4 单菌发酵对软枣猕猴桃果酒感官评价的影响
对7种酵母菌发酵的软枣猕猴桃果酒进行感官品评，7种酵母菌发酵软枣猕猴桃果酒的感官评价得分由高到低排序酵母菌为：帝伯仕酵母（92分）＞拉曼德酵母（89分）＞L13酵母（86分）＞L-au降酸酵母（82分）＞SY型安琪酵母（79分）＞RW型安琪酵母（76分）＞71B降酸酵母（75分）；由帝伯仕酵母发酵的软枣猕猴桃果酒品质协调、香气浓郁、口感醇厚，感官评价得分最高，为92分。因此，7种酵母中帝伯仕酵母发酵软枣猕猴桃果酒感官评价最好。而71B降酸酵母发酵软枣猕猴桃果酒感官评价最低。因此，选择其他6种酵母组合进行后续试验。
2.2 混菌发酵对软枣猕猴桃果酒发酵的影响
2.2.1 混菌发酵对软枣猕猴桃果酒平均每日降糖量和出酒率的影响
5种组合酵母均在发酵第5天时达到发酵终点，其平均每日降糖量及出酒率见图3。
图3 混菌发酵对软枣猕猴桃果酒平均每日降糖量及出酒率的影响
Fig.3 Effect of mixed-yeast fermentation on average daily hypoglycemic capacity and alcohol yields of Actinidia arguta fruit wine
由图3可知，5种组合酵母发酵软枣猕猴桃果酒平均每日降糖量由高到低排序的酵母组合为：组合3（6.38 g/d）＞组合2（6.35 g/d）＞组合5（6.28 g/d）＞组合1（6.22 g/d）＞组合4（6.20 g/d）；酵母组合3的平均每日降糖量最大。与单菌发酵相比，混菌发酵果酒的平均每日降糖量均高于单菌发酵，说明混菌发酵速度比单菌发酵速度快。因此，5种组合中酵母组合3发酵速度最快。
5种组合酵母发酵软枣猕猴桃果酒出酒率由高到低排序的酵母组合为：组合4（52.00%）＞组合5（51.80%）＞组合3（51.50%）＞组合1（50.70%）＞组合2（48.95%），酵母组合4的出酒率最高。5种组合酵母混菌发酵软枣猕猴桃果酒的出酒率差异不显著（P＞0.05）。与单菌发酵相比，混菌发酵和单菌发酵出酒率相差不大。因此，5种组合中酵母组合4发酵软枣猕猴桃果酒的出酒率最高。
2.2.2 混菌发酵对软枣猕猴桃果酒pH值、酒精度、总酸与还原糖含量的影响
对5种组合酵母发酵软枣猕猴桃果酒pH值、酒精度、总酸与还原糖含量进行测定，结果见表4。
表4 混菌发酵对软枣猕猴桃果酒pH值、酒精度、总酸与还原糖含量的影响
Table 4 Effect of mixed-yeast fermentation on pH,alcohol content,total acid and reducing sugar contents of Actinidia arguta fruit wine
由表4可知，5种组合酵母发酵软枣猕猴桃果酒酒精度由高到低排序的酵母组合为：组合1（8.6%vol）＞组合5（8.0%vol）＞组合2=组合3（7.5%vol）＞组合4（7.1%vol）；酵母组合1的酒精度最高，对原料的转化率最好。相比于单菌发酵，混菌发酵酒精得率略低于单菌发酵。因此，5种组合中酵母组合1发酵软枣猕猴桃果酒酒精得率最高。
5种组合酵母混菌发酵软枣猕猴桃果酒的pH值、总酸含量差异不显著（P＞0.05），不同酵母组合混菌发酵的软枣猕猴桃果酒的pH值为3.37～3.39，总酸含量范围为6.01～6.44 g/L。混菌发酵软枣猕猴桃果酒的pH值和总酸含量均低于单菌发酵，说明混菌发酵后软枣猕猴桃果酒中已电离的氢离子浓度较高，但未电离的氢离子浓度较低。因此，组合酵母发酵软枣猕猴桃果酒可以降低总酸含量，有利于改善软枣猕猴桃果酒口感。
5种组合酵母发酵软枣猕猴桃果酒的还原糖含量由高到低排序的酵母组合为：组合5（1.40 g/L）＞组合1（1.30 g/L）＞组合2（1.18 g/L）＞组合3=组合4（1.07 g/L）；酵母组合4的还原糖含量最低，对糖利用率最好。与单菌发酵相比，混菌发酵软枣猕猴桃果酒的还原糖含量均低于单菌发酵，说明混菌发酵对糖的利用率高，发酵更彻底。因此，5种组合中组合4发酵软枣猕猴桃果酒最彻底。
2.2.3 混菌发酵对软枣猕猴桃果酒甲醇、维生素C和总酯含量的影响
对5种组合酵母发酵软枣猕猴桃果酒的甲醇、维生素C和总酯含量进行测定，结果见图4。
图4 混菌发酵对软枣猕猴桃果酒甲醇、维生素C及总酯含量的影响
Fig.4 Effect of mixed-yeast fermentation on methanol,vitamin C and total ester contents of Actinidia arguta fruit wine
由图4可知，5种组合酵母发酵的软枣猕猴桃果酒中甲醇含量差异不显著（P＞0.05）。5种组合酵母发酵软枣猕猴桃果酒甲醇含量由高到低排列酵母组合为：组合5（174.98mg/L）＞组合1（168.46mg/L）＞组合3（154.33mg/L）＞组合4（149.98 mg/L）＞组合2（136.94 mg/L）；各组合酵母产甲醇能力虽有区别，但差异不大。相比于单菌发酵，混菌发酵软枣猕猴桃果酒的甲醇含量略高于单菌发酵。因此，5种组合酵母中组合2产甲醇量最低。
5种组合酵母发酵软枣猕猴桃果酒维生素C含量由高到低排序酵母组合为：组合5（287.71 mg/L）＞组合4（285.98mg/L）＞组合2（273.16mg/L）＞组合1（270.46mg/L）＞组合3（264.53 mg/L）；酵母组合5的维生素C含量最高。相比于单菌发酵，混菌发酵软枣猕猴桃果酒的维生素C含量略低于单菌发酵，说明单菌发酵的维生素C保留率更好。因此，5种组合酵母中组合5发酵软枣猕猴桃果酒对维生素C的保留率最高。
5种组合酵母发酵软枣猕猴桃果酒总酯含量由高到低排序的酵母组合为：组合1=组合2=组合5（675.90 mg/L）＞组合4（398.9 mg/L）＞组合3（285.9 mg/L）；酵母组合1、组合2和组合5的总酯含量最高。5种组合酵母发酵软枣猕猴桃果酒中总酯含量均高于单菌发酵，说明相比于单菌发酵，混菌发酵有助于提高酒的风味。因此，5种组合酵母中组合1、组合2和组合5产酯能力较强。
2.2.4 混菌发酵对软枣猕猴桃果酒感官评价的影响
对5种组合酵母发酵软枣猕猴桃果酒进行感官品评，5种组合酵母发酵软枣猕猴桃果酒感官评价得分由高到低排序的酵母组合为：组合5（95分）＞组合4（90分）＞组合3（88分）＞组合2（85分）＞组合1（82分），由组合5发酵的软枣猕猴桃果酒品质好、香气浓郁、口感醇厚，澄清度高，酒体呈淡黄色，感官评价总分最高。因此，5种组合中酵母组合5发酵软枣猕猴桃果酒感官评价最好。
综合考虑，在5种组合酵母中，组合5即拉曼德酵母和帝伯仕酵母（1∶1）发酵软枣猕猴桃果酒品质最优。
3 结论
以软枣猕猴桃为原料，分别采用7种单菌酵母及5种组合酵母酿造软枣猕猴桃果酒，结果表明，与单菌发酵相比，组合酵母发酵软枣猕猴桃果酒有助于提升果酒品质，其平均每日降糖量及出酒率均较高。其中，拉曼德酵母和帝伯仕酵母（1∶1）发酵的软枣猕猴桃果酒品质最佳，其平均每日降糖量为6.38 g/d，酒精度为8.0%vol，还原糖含量为1.4g/L，维生素C含量为287.72mg/L，总酯含量为675.90mg/L，感官评分为95分。本研究可以为软枣猕猴桃果酒发酵发酵剂的使用提供理论依据。
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