浓香型白酒是中国四大香型白酒之一，由于其发酵工艺的特殊性和风味特征的典型性而久负盛名[1]。酒醅是浓香型白酒酿造的物质载体[2]。所有酿造过程的生化反应、物质循环、能量转换、代谢产酒产香等，都是通过酒醅的固、液、气三相界面进行的，所以酒醅的质量与白酒的品质密切相关[3]。优质白酒为固态发酵，环境处于密闭状态，难以对酒醅发酵过程中的发酵状态进行实时准确监控，这是浓香型白酒过程监控的一个难点和盲点。而黄水是酒醅发酵的副产物，在酒醅发酵过程中，微生物分解代谢生成大量游离水，在发酵过程中逐渐下沉，并将酒醅中淀粉、还原糖、酵母自溶物以及微生物代谢生成的有机酸、单宁等代谢物和香味前体物质溶解，逐渐沉积至窖底生成棕褐色粘稠液体[4-5]。黄水富含醇、酸、醛、酯等呈香呈味物质，也含有大量有益微生物、糖类物质、含氮化合物以及少量单宁、色素等有机物[6]。所以黄水的成分变化与酒醅发酵的质量密切相关。在传统酿造过程中，可通过对黄水的色泽、悬头和味道进行感官评价，来判断上一轮酒醅的发酵情况，并为下一轮配料操作提供指导[7]。感官检验由于实用性强及经济、快速的特点被广泛应用，但该方法大多是检验人员通过自身经验和感觉来评价或判断产品的质量，仅能对酒醅发酵情况进行粗略评价，无法准确反映酒醅的理化和风味特征，存在一定局限性与主观性[8]。近年来，多数研究仍仅止于黄水有效物质提取、回收与利用，如程坤等[9]从浓香型白酒的黄水中分离出对乙醇具有耐受性的芽胞杆菌Bacillus aquiflavi 3H-10；刘海晴等[10]探索酿酒黄水对鱼类的保鲜作用，测定了酿酒黄水对两种致腐菌的最低抑菌浓度；张丹等[11]通过酯化生香制剂用于黄水窖外发酵生香效果，为黄水的利用提供了一定的方法；郭辉祥等[12]通过气相色谱对发酵期间多粮浓香型白酒窖内黄水成分的变化趋势进行研究。目前对于发酵过程中黄水理化指标与酒醅风味的关系等方面的研究仍不多见。
本研究通过对发酵过程中的黄水与酒醅进行实时取样，采用理化分析、气相色谱-质谱联用（gas chromatographymass spectrometer，GC-MS）和高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）相结合的方法，对发酵过程中黄水与酒醅的理化指标、挥发性风味物质含量以及7种不易挥发的有机酸含量进行测定。研究发酵过程中黄水的变化规律与酒醅发酵质量的关系，以期通过黄水的成分变化监控酒醅发酵状态，进而为白酒生产酿造过程提供理论指导，提高白酒生产质量。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
黄水、酒醅样品：泸州某白酒生产企业；酚酞、次甲基蓝、氢氧化钠、盐酸、五水硫酸铜、酒石酸钾钠、葡萄糖（均为分析纯）：成都市科隆化学品有限公司；甲醇、磷酸二氢钠、2-辛醇、乳酸、草酸、丙酮酸、酒石酸、柠檬酸、苹果酸、琥珀酸（均为色谱醇）：上海安谱璀世标准技术服务有限公司。
1.2 仪器与设备
S470-USP/EP多功能测试仪：梅特勒-托利多集团；GCMS-QP2020NX气相色谱-质谱联用（GC-MS）仪、LC-20A高效液相色谱（HPLC）仪：日本岛津有限公司；DF-101S集热式恒温加热磁力搅拌器：巩义市予华仪器有限责任公司；DHG-9245A电热鼓风干燥箱：上海一恒科学仪器有限公司；50/30 μm DVB/CAR/PDMS固相微萃取头：美国Supelco公司；HP-INNOWAX毛细管色谱柱（60 m×0.25 mm×0.25 μm）：美国安捷伦公司；Waters Atlantis T3色谱柱（5 μm，4.6 mm×250 mm）：美国Waters公司。
1.3 方法
1.3.1 黄水与酒醅取样方法
在酒醅入窖时，将直径3 cm的不锈钢管同步预埋在窖池底部，窖外端采用橡胶垫和钢夹密封。通过抽水泵分别于发酵6 d、12 d、18 d、25 d、32 d、39 d、46 d、53 d、60 d定时定点取样，每次取黄水500 mL。采用五点取样法，酒醅取样与黄水同时进行，每次取中层酒醅500 g。
1.3.2 黄水与酒醅理化指标检测
参照地方标准DB34/T 1728—2012《白酒固态发酵黄浆水中常规指标的分析方法》[13]对黄水的酸度、淀粉和还原糖含量进行测定。因在取样过程中黄水会混有酒醅和窖泥等固形物，会影响电导率的测定，故取40 mL黄水于50 mL离心管中12 000 r/min离心5 min后取上清液，并使用S470-USP/EP多功能测试仪测定黄水的pH和电导率。参照《泸型酒技艺大全》[14]对酒醅的pH、酸度、淀粉和还原糖含量等理化指标进行测定。
1.3.3 黄水与酒醅挥发性风味物质的测定
黄水和酒醅样品的前处理：准确吸取5 mL黄水样品和10 μL 2-辛醇内标溶液（0.822 mg/mL）加入20 mL顶空瓶中（预先加入5 g NaCl）；或准确称取1.0 g酒醅样品于20 mL顶空瓶中，加入1颗磁力搅拌转子，加入5 mL饱和NaCl溶液和10 μL 2-辛醇内标溶液（0.822 mg/mL）。将黄水和酒醅的处理样品分别置于恒温加热磁力搅拌器中，60 ℃预平衡5 min，然后插入50/30 μm DVB/CAR/PDMS固相微萃取头，在60 ℃水浴中萃取45 min后于气相色谱-质谱联用仪进样分析。
气相色谱条件：HP-INNOWAX毛细管色谱柱（60 m×0.25 mm×0.25 μm）；进样口温度250 ℃，不分流进样；载气为高纯度氦气（He），流速1.0 mL/min；程序升温：初始温度40 ℃保持5 min，以4 ℃/min升温至100 ℃后以6 ℃/min升温至230 ℃，保持10 min。
质谱条件：电子电离（electron ionization，EI）源，电子能量70 eV；离子源温度230 ℃，扫描模式为全扫描，扫描范围40～450 amu。根据保留时间进行定性；采用内标法进行定量。
1.3.4 黄水与酒醅中不易挥发有机酸含量的测定
黄水与酒醅样品的预处理：准确吸取20mL黄水于50mL离心管备用。取5 g酒醅于50 mL离心管中，加入20 mL超纯水，超声浸提1 h。将备用黄水样品与浸提酒醅样品分别于12 000 r/min离心5 min；离心后分别吸取1 mL上清液加入106 g/L亚铁氰化钾和300 g/L硫酸锌各200 μL去蛋白，通过涡旋混匀器充分涡旋混匀，12 000 r/min离心3 min；再用0.22 μm滤膜过滤后于高效液相色谱进样分析[15]。
高效液相色谱条件：Waters Atlantis T3色谱柱（5 μm，4.6 mm×250 mm）；柱温30 ℃；流动相20 mmol/L NaH2PO4，用磷酸调节其pH值为2.7；进样体积10 μL；检测器波长210 nm[16-17]。
有机酸定量方法：按0.1 g/L草酸、1 g/L酒石酸、0.85 g/L丙酮酸、1 g/L苹果酸、0.558 g/L乳酸、1 g/L柠檬酸、1.05 g/L琥珀酸配制有机酸标准混合液。将有机酸混合标准溶液和超纯水按1∶0（标准溶液∶超纯水）、1∶2、1∶4、1∶8、1∶16稀释成5个不同浓度梯度，稀释好的混合标准溶液按浓度从高到低顺序于液相色谱分析，绘制各有机酸的峰面积-质量浓度曲线，计算7种有机酸的线性回归方程和相关系数见表1。
表1 7种不易挥发有机酸的线性回归方程参数
Table 1 Parameters of linear regression equation of 7 non-volatile organic acids
2 结果与分析
2.1 黄水、酒醅的理化指标变化分析
2.1.1 黄水与酒醅的淀粉、还原糖、总酸含量及pH值的变化分析
浓香型白酒发酵过程中黄水和酒醅淀粉、还原糖、总酸含量及pH值的变化见图1。
图1 浓香型白酒发酵过程中黄水与酒醅的淀粉（A）、还原糖（B）、总酸（C）含量及pH值（D）的变化
Fig.1 Changes of starch (A),reducing sugar (B),total acid (C)content and pH (D) of Huangshui and Jiupei of strongflavor Baijiu during fermentation process
由图1A可知，黄水淀粉含量在6～60 d发酵过程中由66.2 g/L下降至20.2 g/L，酒醅淀粉含量在0～60 d发酵过程中由18.49%持续下降至10.46%。由图1B可知，黄水还原糖含量在6～60 d由24.04 g/L持续下降至3.29 g/L，酒醅还原糖含量于0～12 d由0.83 mg/g上升至1.07 mg/g后于12～60 d持续下降至0.14 mg/g。由图1C可知，黄水和酒醅总酸含量在6～60 d发酵过程中分别由3.81 g/L、2.07 mg/g上升至5.27 g/L、3.71 mg/g。由图1D可知，黄水与酒醅的pH值在6～60 d发酵过程中分别由3.73、3.88下降至3.64、3.71。结果表明，浓香型白酒整个发酵过程中黄水和酒醅基质的差异导致两相体系中淀粉和还原糖含量呈现不同的变化规律，6～25 d黄水中淀粉和还原糖含量下降速率高于酒醅，而两者的总酸含量和pH值却基本呈现相同变化趋势。在6～25 d酒醅发酵过程中，微生物代谢活跃产生大量的游离水使黄水总量不断增加，可能是导致黄水中淀粉和还原糖含量下降速率高于酒醅的原因。
2.1.2 黄水的电导率变化分析
采用S470-USP/EP多功能测试仪对发酵过程不同时间点黄水的电导率进行测定分析，结果见图2。
图2 浓香型白酒发酵过程中黄水电导率变化
Fig.2 Electric conductivity changes of Huangshui of strong-flavor Baijiu during fermentation process
由图2可知，随着发酵时间的延长，黄水中电导率第6天由8052.72μS/cm持续上升，在53～60d稳定在8572.67μS/cm左右变化。由于溶液的电导率高低相依于其内含溶质盐的浓度，或其他会分解为电解质的化学杂质，溶液中的离子成分越丰富、电导率越高[18]。如在乙酸和乙醇的酯化过程中，电导率与乙酸解离产生的氢离子和乙酸根阴离子量具有显著的线性相关关系[19]。而黄水含有丰富的离子化合物，不同的离子化合物在水溶液中分别具有各自独特的解离规律，相互作用形成一个整体的离子溶液体系。在发酵过程中伴随着黄水中化合物的不断产生和消耗，其离子溶液体系成分在不断变化，电导率也与之呈现一定的变化规律。
2.2 黄水、酒醅挥发性风味物质的相关性分析
2.2.1 黄水和酒醅挥发性风味物质的种类分析
浓香型白酒的酿造微生物以酒醅、窖泥和黄水为载体参与白酒发酵过程中的糖化、产酒以及生香过程，进而影响酒的品质[20]。黄水、酒醅和窖泥基质成分不同，其微生物分布和风味物质种类和含量也具有一定的差异[21]。采用气相色谱-质谱联用仪对发酵60 d黄水和酒醅的挥发性风味物质进行测定分析，结果见图3。
图3 浓香型白酒发酵过程中黄水与酒醅的挥发性风味物质种类比较
Fig.3 Comparison of the volatile flavor compound types in Huangshui and Jiupei of strong-flavor Baijiu during fermentation process
由图3 可知，在发酵60 d黄水和酒醅中分别检测出47种和69种挥发性风味物质，其中，黄水和酒醅中的酯类挥发性风味物质分别有18种和32种，醇类和酸类风味物质数量相同，为10种；醛类和酮类挥发性风味物质数量无明显差异。大部分酯类都难溶于水，易溶于乙醇等有机溶剂，在黄水中的酯类伴随着醇类等有机溶剂的溶入而带来，但含量较少，低于气相色谱-质谱联用仪的检测限，可能是黄水和酒醅在酯类化合物数量上具有差异的原因。
2.2.2 黄水和酒醅挥发性风味物质的层次聚类分析
层次聚类分析（hierarchical clustering analysis，HCA）是基于簇间的相似度在不同层次上分析数据，从而形成树型的聚类结构[22]。将黄水和酒醅中34种相同的挥发性风味物质数据归一化处理后，通过离差平方和层次聚类法进行聚类分析，结果见图4。
图4 浓香型白酒发酵过程中黄水和酒醅挥发性风味物质的层次聚类分析结果
Fig.4 Hierarchical cluster analysis results of volatile flavor compounds in Huangshui and Jiupei of strong-flavor Baijiu during fermentation process
由图4 可知，黄水和酒醅风味物质大量积累的时间段可分为6～18 d、25～46 d、53～60 d三个时间段。8种风味化合物在黄水和酒醅中含量变化趋势基本相似，其中异丁醇和异戊醇2种醇类化合物含量于53～60 d大量积累，异戊酸含量于25～46 d 大量积累，乙酸乙酯、丁酸乙酯、戊酸乙酯、己酸乙酯和癸酸乙酯5种酯类化合物含量于53～60 d大量积累。因此，通过分析其在黄水中的含量变化可以反映出酒醅发酵质量。
2.2.3 黄水与酒醅中7种不易挥发有机酸含量分析
在浓香型白酒中有机酸是形成白酒风味的主要成分，也是生成酯类的重要前体，其含量仅次于挥发性酯类[23]。黄水、酒醅中7种不易挥发有机酸含量分析见表2。
表2 浓香型白酒发酵过程中黄水及酒醅中7种不易挥发有机酸含量
Table 2 Contents of 7 non-volatile organic acids in Huangshui and Jiupei of strong-flavor Baijiu during fermentation process
由表2 可知，随着发酵进行，7种不易挥发的有机酸总量在黄水中呈现持续增加的变化趋势，由170.80 g/L持续上升至228.93 g/L；而在酒醅中呈现先上升后下降趋势，由18.78 mg/g迅速上升至31.77 mg/g，再持续下降至28.69 mg/g。而其这可能是随着发酵进行，酒醅中产生的有机酸逐渐集到黄水中。
黄水中7种不易挥发的有机酸含量以乳酸为主，酒石酸次之，其中乳酸和酒石酸在6～60 d发酵过程持续增加，60 d时分别为219.94 g/L、2.85 g/L；而酒醅中7种不易挥发的有机酸含量以乳酸为主，柠檬酸次之，其他有机酸含量较少，其中乳酸含量呈现先上升后略微下降的趋势，在发酵60 d时为27.09 mg/g，柠檬酸含量在发酵过程中持续上升，在发酵60 d时为1.01 mg/g。因此，可以用黄水中含量最多的乳酸来反映酒醅发酵质量。
2.3 黄水理化指标与酒醅风味物质的关系
为探究黄水的理化指标与酒醅风味物质的具体变化关系，将黄水的理化指标和酒醅风味物质含量的时间序列数据进行中心标准化后进行冗余分析[24-25]，结果见图5。
图5 浓香型白酒发酵过程中黄水理化指标与酒醅风味物质的冗余分析结果
Fig.5 Redundancy analysis results of physiochemical indexes of Huangshui and flavor compound of Jiupei of strong-flavor Baijiu during fermentation process
由图5 可知，黄水中淀粉和还原糖含量以及电导率和pH值与酒醅风味物质变化之间具有密切的联系；在酒醅醇类风味物质变化中，黄水的淀粉和还原糖含量以及pH值与酒醅的乙醇含量呈正相关；在酒醅酸类风味物质变化中，黄水的淀粉和还原糖含量以及pH值与醋酸和乳酸的含量呈负相关，与丁酸、己酸、不挥发性酸类及其他酸类的含量呈正相关性；在酯类变化中，黄水的淀粉和还原糖含量以及pH值与乙酸乙酯、丁酸乙酯的含量呈正相关，与己酸乙酯以及其他酯类的含量呈负相关；黄水的淀粉和还原糖含量以及pH值与酚类和醛类物质的含量呈负相关性。电导率在酒醅风味物质的相关关系上与淀粉和还原糖含量以及pH值相反。因此，黄水的pH值、电导率、淀粉和还原糖含量的变化一定程度上可以用来预测酒醅风味物质的变化趋势。
3 结论
本研究通过理化分析、气相色谱-质谱联用和液相色谱相结合对发酵过程中的黄水与酒醅的理化指标、挥发性风味物质、7种不易挥发的有机酸进行相关性分析，揭示了黄水与酒醅的理化指标和风味之间的相关关系。
在黄水风味与酒醅风味之间的关系中，通过离差平方和层次聚类分析法筛选出的8种挥发性的风味化合物，异丁醇、异戊醇、异戊酸、乙酸乙酯、丁酸乙酯、戊酸乙酯、己酸乙酯和癸酸乙酯的含量在黄水和酒醅中变化趋势基本相同，可以通过分析其在黄水中的含量变化反映酒醅发酵产生的挥发性风味物质的含量变化；7种不易挥发的有机酸其总量在酒醅中呈现先上升后下降趋势，而在黄水中总量呈持续上升趋势，但乳酸是黄水中不易挥发的有机酸的主要成分，其含量占比与酒醅中乳酸含量占比基本相同，可以通过黄水中乳酸含量评估酒醅中不易挥发的有机酸含量变化。
在黄水理化指标与酒醅风味的关系中，黄水的pH值、电导率、淀粉和还原糖含量与酒醅的风味之间具有密切联系；由于溶液电导率与离子体密度及速率呈现随离子浓度增大而增大的上升趋势。黄水电导率受酒醅中有机酸含量变化的影响而随黄水中风味化合物种类数量和含量的增加而增加；酒醅的pH值、淀粉和还原糖含量等理化指标会影响发酵过程中酒醅微生物和微生物多样性，从而影响微生物代谢产生的风味；黄水的pH值、电导率、淀粉和还原糖含量等理化指标一定程度上可以预测酒醅风味成分的变化趋势，进而评估酒醅发酵质量。
综上，通过黄水的理化指标和风味成分来评判酒醅发酵质量，对指导实际生产具有重要意义。
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