黄皮（Clausena lansium）又名果子黄、黄弹子、黄皮果、黄皮子，主要生长在广东、广西、海南和福建，其中，郁南黄皮色泽鲜亮、果实硕大、无籽、肉质细嫩、酸甜可口[2]，尤以广东省云浮市郁南县种植面积最广[1]。无核黄皮不仅富含维生素、氨基酸、矿物质、多糖等[3-5]，还含有大量的香豆素类、黄酮类、黄皮酰胺类生物活性物质[6]，具有丰富的营养价值和较好的保健功能，是食用和药疗的佳品[7]，被誉为黄皮之王、果中之宝[8]。
果醋是一种风味独特的新型饮品或酸性调味品，含丰富的有机酸、维生素、氨基酸以及微量元素等营养物质。果醋兼具有水果和醋的大部分功能成分，具有缓解疲劳抗焦虑、促进肠道代谢、降低血脂和预防高血压和心脑血管疾病等保健作用[9-10]。果醋发酵根据发酵状态可分为全固态发酵法、全液态发酵法和前液后固发酵法[11]。果醋是通过两阶段发酵过程生产的，第一阶段是通过酵母将可发酵糖转化为乙醇，主要的微生物为酵母，第二阶段是通过醋酸菌氧化乙醇为乙酸[12]。发酵是生产果醋的关键过程，在此期间，许多挥发性化合物、多酚和有机酸等通过化学和微生物作用进行修饰[13]。果醋市场拥有较大的开发潜力，且市场前景较好值得深入研究提高其产品质量。由于其开发潜力，目前国内外众多学者对苹果[14]、葡萄[15]、多依果[16]、枸杞[17]、罗汉果[18]的果醋进行研究，研究内容集中在工艺条件优化，果醋的功能性成分和醋酸菌的筛选方面[19-20]。目前，关于黄皮果醋的研究报道较少，黄星源等[21]以无核黄皮为原料，采用酒精发酵与醋酸发酵同步进行的方式，制备保健功效好的“巴伦比”无核黄皮果醋。无核黄皮多以鲜果的形式销售，鲜果贮藏期短，冷藏易使果皮颜色褐变，造成腐烂浪费[22]。因此，对无核黄皮进行发酵，制备具有独特无核黄皮果香味的果醋，不仅对鲜果营养成分的保留及附加值的提高具有重要意义，还可以有效延长无核黄皮的产业链。
本研究以郁南无核黄皮为原料，以果酒专用酵母和醋酸菌为发酵菌种制备无核黄皮果醋，并以总酸含量和感官评分为评价指标，优选发酵方式（同步发酵、分步发酵）和醋酸菌（菌株A-2、A-3、A-5）菌种，并采用单因素试验和正交试验优化无核黄皮果醋醋酸发酵条件，以期提高无核黄皮的食用价值，为无核黄皮果醋的产业化提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
无核黄皮：市售；葡萄酒果酒专用酵母SY：安琪酵母股份有限公司；醋酸菌（Acetobacter pasteurianus）A-2、醋酸菌A-3、醋酸菌A-5：广东郁南巴伦比酒业有限公司；沪酿1.01：北京百欧博伟生物技术有限公司。
壳聚糖、果胶酶（30 000 U/g）、酵母膏：国药集团化学试剂有限公司；葡萄糖：天津市大茂化学试剂厂；偏重亚硫酸钾：天津市致远化学试剂厂；柠檬酸、碳酸氢钠、无水乙醇、氢氧化钠：天津市福晨化学试剂厂。以上试剂均为分析纯或生化试剂。
1.2 仪器与设备
HR1810榨汁机：珠海飞利浦家庭电器有限公司；pHS-3C pH测定仪：上海虹益仪器仪表有限公司；SW-CJ-ZFD超净工作台：苏州安泰空气技术有限公司；RHB80手持糖度仪：石家庄泰斯特仪器设备有限公司；HHB11-BS电热恒温培养箱：上海跃进医疗器械有限公司；LDZX-30FBS立式压力蒸汽灭菌锅：上海申安医疗器械厂。
1.3 方法
1.3.1 无核黄皮果醋的发酵工艺流程及操作要点
操作要点：
原料预处理：选取八分熟的新鲜无核黄皮，清洗干净后，去蒂[23]，按料液比1∶1（g∶mL）添加水，用打浆机将无核黄皮果肉打碎成浆状。
酶解：于无核黄皮浆液中加入0.3%果胶酶，在50 ℃下恒温水浴酶解1.5 h[24]，以分解原料中的果胶物质，添加120 mg/L的偏重亚硫酸钾。
成分调整：添加柠檬酸或碳酸氢钠调节初始pH值为4.0，调整无核黄皮果浆液初始糖度为16%。
巴氏杀菌、冷却：70 ℃下水浴30 min[25]，冷却至室温。
接种：向调整好成分的无核黄皮浆液中加入0.5 g/L葡萄酒果酒专用酵母SY，并接入一定量的醋酸菌，充分搅拌均匀后，用6层无菌纱布进行密封。
酒精、醋酸发酵：在无核黄皮浆液中接种0.5 g/L的葡萄酒果酒专用酵母SY和6%醋酸菌液，根据不同的发酵方式设置接种次序，同步发酵方式为30 ℃发酵12 d，分步发酵方式为先在22 ℃条件下发酵5 d，再调至32 ℃发酵7 d。
过滤：发酵完成后，用滤布将果渣分离出来，然后添加质量分数为0.5%的壳聚糖[26]，处理1 h，再用滤布过滤。
巴氏杀菌：70 ℃下水浴30 min，冷却至室温。
澄清：在室温下静置澄清，取上清液即得无核黄皮果醋成品。
1.3.2 醋酸菌及醋酸发酵方式的确定
无核黄皮果醋酒精发酵采用葡萄酒果酒专用酵母SY，醋酸发酵采用自筛菌株A-2、A-3、A-5及商品化菌株沪酿1.01，发酵方式采用同步发酵和分步发酵。
同步发酵：在方法1.3.1的基础上，以无核黄皮为原料，将葡萄酒果酒专用酵母SY（0.5 g/L）和自筛醋酸菌菌种（6%，V/V）同时加入浆液中发酵（30 ℃发酵12 d），以酒精发酵和醋酸发酵同步进行的方式酿造无核黄皮果醋。
分步发酵：在方法1.3.1的基础上，以无核黄皮为原料，先将葡萄酒果酒专用酵母SY（0.5 g/L）加入浆液中进行酒精发酵（22 ℃发酵5 d），再将自筛醋酸菌菌种（6%，V/V）接种于酒精发酵后的浆液中进行醋酸发酵（32 ℃发酵7 d），酿造无核黄皮果醋。以无核黄皮果醋的酒精度、总酸含量和感官评分为考察指标确定其最佳发酵方式及醋酸菌菌种。
1.3.3 无核黄皮果醋醋酸发酵条件优化
（1）单因素试验
固定基本发酵条件为：无核黄皮浆液初始糖度为16%，再用柠檬酸或碳酸氢钠调节初始pH值为4.0，在无核黄皮浆液中接种0.5 g/L的葡萄酒果酒专用酵母SY和6%醋酸菌液，混合均匀，在22 ℃条件下发酵5 d，再调至32 ℃发酵7 d。分别考察初始pH值（3.0、3.5、4.0、4.5、5.0）、醋酸发酵温度（26 ℃、29 ℃、32 ℃、35 ℃、38 ℃）、醋酸菌接种量（2%、4%、6%、8%、10%）、醋酸发酵时间（3 d、5 d、7 d、9 d、11 d），以总酸含量和感官评分为评价指标，确定最适的醋酸发酵条件。
（2）正交试验
在单因素试验结果的基础上，以感官评分和总酸含量为评价指标，以初始pH值（A）、醋酸发酵温度（B）、醋酸菌接种量（C）和醋酸发酵时间（D）为影响因素，采用4因素3水平的正交试验设计优化无核黄皮果醋醋酸发酵条件，正交试验设计因素与水平见表1。
表1 醋酸发酵条件优化正交试验因素与水平
Table 1 Factors and levels of orthogonal test for acetic acid fermentation conditions optimization
1.3.4 无核黄皮果醋的感官评价
参照GB/T 30884—2014《苹果醋饮料》中感官评分要求[27]，选定10人作为感官鉴定小组，对无核黄皮果醋进行品评打分，根据无核黄皮果醋的外观、色泽、气味、口感进行感官评分，总分100分，无核黄皮果醋的感官评价标准见表2。
表2 无核黄皮果醋感官评价标准
Table 2 Sensory evaluation standards of seedless wampee fruit vinegar
1.3.5 理化指标的测定
初始糖度：采用手持糖度计测定；初始pH值：采用pH计测定；酒精度：参照国标GB 5009.225—2016《食品安全国家标准酒中乙醇浓度的测定》的蒸馏（酒精计）法测定[28]；总酸含量：参照国标GB 12456—2021《食品安全国家标准食品中总酸的测定》的酸碱指示剂法测定[29]；菌落总数：参照GB 4789.2—2016《食品安全国家标准食品微生物学检验菌落总数测定》的平板计数法测定[30]；大肠菌群：参照GB 4789.3—2016《食品安全国家标准食品微生物学检验大肠菌群计数》测定[31]；致病菌：参照GB 29921—2021《食品安全国家标准预包装食品中致病菌限量》测定[32]。
1.3.6 数据处理
采用Excel 2021对实验数据进行计算，所有数据重复3次。由Origin 2019软件进行绘图，正交试验数据使用SPSS 22.0进行数据分析。
2 结果与分析
2.1 醋酸菌及醋酸发酵方式的确定
不同醋酸菌及发酵方式对无核黄皮果醋品质的影响见表3。由表3可知，4株醋酸菌的同步发酵方式所得无核黄皮果醋的剩余酒精度均低于分步发酵方式，总酸含量均高于分步发酵方式。采用同步发酵方式的实验组中，发酵液面很早就出现了菌膜，可能是醋酸菌可以更早地开始繁殖和代谢，从而消耗发酵液中的酒精，提高无核黄皮果醋的发酵速度和酸度[33]，在糖含量高的无核黄皮浆液中，醋酸菌可以将乙醇和糖类同时作为底物进行生长繁殖[34]，所以提高了其发酵速度。在感官评分方面，采用同步发酵方式所得无核黄皮果醋的感官评分基本优于分步发酵方式，自筛菌株A-2分步发酵的无核黄皮果醋感官评分稍高于同步发酵的果醋。同种发酵方式下，自筛菌株A-5发酵所得无核黄皮果醋的总酸含量和感官评分均达到最高值，分别为56.5 g/L和82.4分，沪酿1.01次之，自筛菌株A-3、A-2发酵所得无核黄皮果醋品质较差。
表3 不同醋酸菌及发酵方式对无核黄皮果醋品质的影响
Table 3 Effect of different acetic acid bacteria and fermentation methods on the quality of seedless wampee fruit vinegar
综上所述，同步发酵方式在产酸和感官评分方面均优于分步发酵方式，自筛菌株A-5优于沪酿1.01、自筛菌株A-3和A-2，故在后续实验中选用醋酸菌A-5及同步发酵方式。
2.2 无核黄皮果醋的醋酸发酵条件优化单因素试验
2.2.1 初始pH值的确定
由图1可知，当初始pH值＜4.0时，其总酸含量随初始pH值的升高而增大；当初始pH值为4.0时，总酸含量达到最高值，为72.48 g/L；当初始pH值＞4.0之后，总酸含量也随之下降。这可能是因为pH较高或较低，醋酸菌的活力会受到限制，醋酸菌对乙醇的转化作用也随之减弱，不利于醋酸发酵[35]。当初始pH值＜4.5时，感官评分逐渐增加；当初始pH值为4.5时，无核黄皮果醋感官评分最高，为70分；当初始pH值＞4.5之后，感官评分逐渐下降。其原因可能是，无核黄皮果醋在酸度较高的情况下会降低无核黄皮果醋的整体风味，无核黄皮果味淡，有涩感。综合考虑，无核黄皮果醋的最适初始pH值为4.5。
图1 初始pH值对无核黄皮果醋品质的影响
Fig.1 Effect of initial pH on the quality of seedless wampee vinegar
2.2.2 醋酸发酵温度的确定
由图2可知，醋酸发酵温度对无核黄皮果醋的总酸含量和感官评分影响较大，且影响趋势相似。当醋酸发酵温度在26～32 ℃范围内增加时，无核黄皮果醋的总酸含量和感官评分随之增加；当醋酸发酵温度为32 ℃时，无核黄皮果醋的总酸含量和感官评分达到最大值，分别为67 g/L和71.6分；当醋酸发酵温度＞32 ℃之后，无核黄皮果醋的总酸含量和感官评分明显下降。这可能是因为醋酸发酵温度提高，醋酸菌的活性下降，加速醋酸菌衰老，从而降低其产酸能力[36]，并影响无核黄皮果醋的口感。综合考虑，无核黄皮果醋的最适醋酸发酵温度为32 ℃。
图2 醋酸发酵温度对无核黄皮果醋品质的影响
Fig.2 Effect of acetic acid fermentation temperature on the quality of seedless wampee fruit vinegar
2.2.3 醋酸菌接种量的确定
由图3可知，醋酸菌接种量对无核黄皮果醋总酸含量和感官评分的影响趋势相似。当醋酸菌接种量在2%～8%范围内增加时，无核黄皮果醋的总酸含量和感官评分随之增加；醋酸菌接种量为8%时，无核黄皮果醋的总酸含量和感官评分分别达到最大值，分别为70.48 g/L和73.2分；当醋酸菌接种量＞8%之后，无核黄皮果醋的总酸含量和感官评分稍有下降。这可能是因为醋酸菌接种量较少时，发酵液中菌体量不足，故而发酵速度较慢；但醋酸菌接种量过大，不仅将酒精作为碳源，还会以甘油、甘露醇等多元醇作为碳源，发酵液中的营养物质会供应不足，会继续把醋酸氧化成二氧化碳和水，还会氧化乙醇之外的其他醇类和糖类生成相应的酸、酮等物质，同时会导致代谢杂质增多，容易产生过早老化和自溶现象[37]。而接种量过高时，发酵液中菌种增加需要消耗大量的营养物质，醋酸菌繁殖过快使得发酵后期发酵液中醋酸菌活力降低，因此总酸含量降低，并影响无核黄皮果醋的口感。综合考虑，无核黄皮果醋的最适醋酸菌接种量为8%。
图3 醋酸菌接种量对无核黄皮果醋品质的影响
Fig.3 Effect of acetic acid bacteria inoculum on the quality of seedless wampee fruit vinegar
2.2.4 醋酸发酵时间的确定
由图4可知，醋酸发酵时间对无核黄皮果醋总酸含量和感官评分的影响较大，且影响趋势相似。醋酸发酵时间在3～7 d范围内增加时，无核黄皮果醋的总酸含量和感官评分都明显提高；醋酸发酵时间＞7 d之后，无核黄皮果醋的总酸含量和感官评分基本保持稳定。综合考虑，无核黄皮果醋的最佳醋酸发酵时间为7 d。
图4 醋酸发酵时间对无核黄皮果醋品质的影响
Fig.4 Effect of acetic acid fermentation time on the quality of seedless wampee fruit vinegar
2.3 无核黄皮果醋的醋酸发酵条件优化正交试验
根据单因素试验结果，以感官评分和总酸含量为评价指标，以初始pH值（A）、醋酸发酵温度（B）、醋酸菌接种量（C）和醋酸发酵时间（D）为影响因素，采用4因素3水平的正交试验设计优化无核黄皮果醋醋酸发酵条件，正交试验结果与分析见表4，以总酸含量为评价指标的方差分析见表5，以感官评分为评价指标的方差分析见表6。
表4 无核黄皮果醋醋酸发酵工艺优化正交试验结果与分析
Table 4 Results and analysis of orthogonal tests for acetic acid fermentation conditions optimization of seedless wampee fruit vinegar
表5 以总酸含量为评价指标正交试验结果的方差分析
Table 5 Variance analysis of orthogonal tests results with total acid content as evaluation index
注：“*”表示对结果影响显著（P＜0.05），“**”表示对结果影响极显著（P＜0.01）。下同。
表6 以感官评分为评价指标的正交试验结果方差分析
Table 6 Variance analysis of orthogonal tests results with sensory score as evaluation index
由表4可知，以总酸含量为评价指标，极差分析结果表明，4种因素对总酸含量影响的主次顺序为A（初始pH值）＞C（醋酸菌接种量）＞B（醋酸发酵温度）＞D（醋酸发酵时间），无核黄皮果醋的最佳发酵工艺条件为A2B3C3D2。
以感官评分为评价指标，极差分析结果表明，4种因素对感官评分影响的主次顺序为A（初始pH值）＞B（醋酸发酵温度）＞D（醋酸发酵时间）＞C（醋酸菌接种量），无核黄皮果醋的最佳发酵工艺条件为A2B2C3D2。
综合考虑，醋酸发酵工艺条件最佳组合为A2B2C3D2，即无核黄皮果醋的最优发酵条件为：初始pH值4.5，醋酸发酵温度32 ℃，醋酸菌液接种量8%，醋酸发酵时间7 d，在此优化条件下，进行3次平行验证试验，得出无核黄皮果醋感官评分为88.2分，总酸含量为72.04 g/L。
由表5及表6可知，4个因素对总酸含量影响均极显著（P＜0.01），初始pH值及醋酸菌接种量对感官评分影响显著（P＜0.05），醋酸发酵时间和醋酸发酵温度均不显著（P＞0.05）。
2.4 无核黄皮果醋的品质分析
无核黄皮果醋醋体呈金黄色、澄清透明，无核黄皮果香饱满浓郁，酸度协调适口，稍有涩感，风味独特，其感官评分为88分，总酸含量为72 g/L。菌落总数为34 CFU/mL，大肠菌群未检出，致病菌未检出。品质指标符合NY/T 2987—2016《绿色食品果醋饮料》的要求。
3 结论
本研究以无核黄皮为主要原料酿造无核黄皮果醋，确定酿造无核黄皮果醋的醋酸菌为醋酸菌A-5，醋酸发酵方式同步发酵。正交试验结果表明，无核黄皮果醋的最佳醋酸发酵工艺条件为初始pH值4.5、醋酸发酵温度32℃、醋酸菌接种量8%、醋酸发酵时间7 d。在此优化条件下，总酸含量及感官评分分别为72 g/L、88分。无核黄皮果醋酸度协调适口，无核黄皮果香饱满浓郁，稍有涩感。该研究可为无核黄皮的深加工提供科学依据。
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