青梅（Prunus mume Sieb.et Zucc.）是我国传统的药食同源食品，其果肉中含有十分丰富的营养物质，如维生素、多种有机酸、多酚、矿物质和黄酮等[1-2]，具有杀菌、激素调节[3]、解毒、消除疲劳等功能[4]，是酿造果酒的良好原料。新鲜青梅入口酸涩不宜鲜食，通常需加工后食用，目前市面上常见的青梅加工产品为果脯和果酒等。桂花（Osmanthus fragrans（Thunb.）Lour.）又被称为岩桂、木樨或九里香，具有浓郁的芳香气息，富含糖类、蛋白质、有机酸、黄酮及多种矿物质元素[5-6]，综合营养价值极高。桂花中具有的广泛生物活性成分，具有抗氧化、神经保护[7]、抗糖尿病、抗癌、促进人体纤维细胞再生[8]等功效，对促进健康和预防疾病有积极作用。中医常用于健胃、驱寒、平肝，可治疗痰多咳嗽、食欲不振、闭经腹痛等疾病[9]。利用青梅桂花进行复合果酒的酿造，不仅有助于解决青梅鲜果易腐的经济损失难题，且可生产一款香气宜人，口感清爽的保健果酒，提高青梅的利用率。
在果酒的发酵过程中，水果中的营养成分能够得到极大程度的保留，并且生成各种醇类、酯类、有机酸等物质[10]。有研究表明，果酒中的维生素比水果中的维生素更容易被人体吸收，如果长期饮用适量的果酒能够起到抗衰老的作用，并且还能够预防动脉硬化、高血压以及心脑血管等疾病[11]。在我国，果酒的发展较为缓慢，随着生活水平的逐渐提高，营养保健意识的增强，果酒的药用价值逐渐得到重视，并以其独特的风味和色泽，走进大众视野，成为新的消费时尚。目前我国果酒品种单一，在中国酒业协会果露酒分会工作的推进下，我国目前完成了山楂酒、蓝莓酒、石榴酒等十个特色果酒的认定[12]，对青梅果酒的发酵工艺、澄清工艺等都有所研究，叶倩雯等[13]对青梅酒的发酵工艺进行了研究，刘兴艳等[14]研究了青梅甘蔗发酵酒的关键加工工艺，陈铭中等[15]对发酵青梅酒的澄清工艺进行了优化，王玉霞等[16]对青梅大枣果酒的最佳低温发酵工艺进行了探索，但对青梅复合果酒的发酵开发研究仍需不断的创新深入，尤其是弥补其品类不够丰富的现实需要。该研究以青梅和桂花为主要原料，进行新型青梅桂花复合果酒酿造开发，减弱青梅单独发酵酒香味不足的缺点，并对复合果酒挥发性风味成分进行分析，以期得到一款香气宜人、酒香清冽，口感上佳，风味独特的复合果酒。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
新鲜青梅、干桂花：市售。
葡萄糖、乙醇、硫酸铜、次甲基蓝、酒石酸钾钠、酚酞等（均为分析纯）：成都金山化学试剂有限公司；果胶酶、纤维素酶（均为食品级、30 000 U/g）：山东隆科特酶制剂有限公司；安琪果酒专用酵母SY：湖北安琪酵母股份有限公司。
1.2 仪器与设备
SP21-800恒温破壁料理机：浙江苏泊尔股份有限公司；BSP-250生化培养箱：上海博讯实业有限公司医疗设备厂；DK-98-Ⅱ电热恒温水浴锅：天津市泰斯特仪器有限公司；FE28-Standard酸度计：上海梅特勒-托利多仪器有限公司；GL224I-1SCN电子天平：北京赛多利斯科学仪器有限公司；SQ680气相色谱质谱联用仪（gas chromatograph-mass spectrometer，GC-MS）：美国PerkinElmer公司。
1.3 方法
1.3.1 青梅桂花酒发酵工艺流程及操作要点
操作要点：
（1）青梅的预处理：挑选新鲜无虫害、果实饱满圆润、成熟度较高、肉质硬的梅果，将其洗净并晾干水分备用。
（2）破碎打浆：将青梅去核，称取与青梅果肉质量等比例的蒸馏水，加入0.1 g/L的D-异抗坏血酸钠以护色，同时称取设计添加量的桂花，将各原料混合，随后再加入140 mg/L的焦亚硫酸钾，打浆得到青梅桂花汁。
（3）酶解处理：以青梅桂花汁体积计，加入80 mg/L的果胶酶和20 mg/L的纤维素酶在50 ℃条件下恒温水浴2 h进行酶解处理，酶解完成后，在90 ℃条件下恒温水浴10 min进行灭酶处理。
（4）酵母活化：配制2%的葡萄糖溶液，按照干酵母与葡萄糖溶液为1∶10（g∶mL）的料液比，将干酵母溶解于葡萄糖溶液中，随即置于37 ℃条件下恒温水浴30 min以活化酵母。
（5）成分调配：用8层纱布将灭酶后的青梅桂花汁过滤后，添加白砂糖调整其糖度，待糖完全融化后，再调节其酸度。
（6）发酵：加入活化后的酵母，轻轻摇匀后，将其放入恒温发酵箱中进行青梅桂花酒的发酵。
（7）陈酿、澄清：发酵完成后，过滤去掉果渣，获得清液。添加80 mg/L的焦亚硫酸钾抑菌，静置陈酿，过滤、灭菌后得到青梅桂花复合果酒成品。
1.3.2 青梅桂花酒发酵工艺优化单因素试验
采用单因素轮换法，依次考察桂花添加量（1.6 g/kg、1.8 g/kg、2.0 g/kg、2.2 g/kg、2.4 g/kg）、酵母接种量（0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%）、初始糖含量（18%、20%、22%、24%、26%）、初始pH（3.0、3.5、4.0、4.5、5.0）、发酵温度（18 ℃、20 ℃、22 ℃、24 ℃、26 ℃）、发酵时间（3 d、4 d、5 d、6 d、7 d）对青梅桂花果酒理化指标及感官品评的影响。
1.3.3 青梅桂花酒发酵工艺优化响应面试验
以单因素试验的结果为依据，根据响应面Box-Behnken设计，选择对结果影响显著的因素桂花添加量（A）、初始糖含量（B）、初始pH值（C）和发酵温度（D）为自变量，以酒体感官评价和酒精度为响应值，进行响应面法优化发酵工艺。
1.3.4 分析与检测方法
酒精度的测定：参照GB 5009.225—2016《食品安全国家标准酒中乙醇浓度的测定》中的方法[17]；总糖、总酸以及二氧化硫的测定：分别参考GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》中酒精计法、直接滴定法、指示剂法以及直接碘量法[18]；pH的测定：参考GB 5009.237—2016《食品安全国家标准食品pH值的测定》[19]。
感官评分：青梅桂花酒的感官评分参考GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用的分析方法》[18]进行评价设计。选择10名经过专业训练的人员组成感官鉴评小组，从外观、香气、滋味和典型性4个方面对青梅桂花果酒进行评价并打分，满分100分，感官评分标准见表1。
表1 青梅桂花酒感官评分标准
Table 1 Sensory evaluation standards of greengage-Osmanthus fragrans wine
1.3.5 风味物质分析方法
挥发性风味物质采用GC-MS法测定。
色谱条件：DB-WAX石英毛细管柱，进样口温度为240℃，不分流，载气流速为1 mL/min，程序升温：45 ℃保持3 min，再以2 ℃/min升至220 ℃保持15 min。
质谱条件：电子电离（electron ionization，EI）源，电子能量70 eV，离子源温度为230 ℃，四级杆温度为150 ℃，扫描范围为20～450 m/z，溶剂延迟3 min。
1.3.6 数据分析
通过Origin 2021软件对数据进行处理，响应面试验运用Design-Expert11软件进行设计和分析。每组试验平行3次，结果以“平均值±标准差”表示。
2 结果与分析
2.1 青梅桂花酒发酵工艺优化单因素试验
2.1.1 桂花添加量对青梅桂花果酒的影响
桂花添加量对青梅桂花酒发酵的影响结果见图1。由图1可知，随着桂花添加量在1.6～2.4 g/kg范围内的增加，青梅桂花酒的酒精度和感官评分都呈现出先上升后下降的趋势。当桂花添加量为2.2 g/kg时，酒精度达到最大；当桂花添加量为2.0 g/kg时，感官得分最高。桂花作为青梅桂花果酒的主要原料之一，其添加量对青梅桂花果酒的品质有较大的影响。桂花添加量过少，不能突出果酒的典型性；添加量过多又会掩盖其果香味和酒香味，且过多的添加量可能会影响酵母的生长，从而影响酒精度。因此，选择桂花添加量为2.0 g/kg。
图1 桂花添加量对青梅桂花酒发酵品质的影响
Fig.1 Effect of Osmanthus fragrans addition on fermentation quality of greengage-Osmanthus fragrans wine
2.1.2 酵母接种量对青梅桂花果酒的影响
酵母接种量对青梅桂花酒发酵的影响见图2。由图2可知，随着酵母接种量在0.1%～0.5%范围内的增加，青梅桂花果酒的酒精度呈现先上升后下降的趋势，在酵母添加量为0.3%时酒精度最大；青梅桂花果酒的感官得分呈现下降、上升再下降的趋势，酵母添加量为0.3%时感官得分最高。适宜的酵母接种量对果酒的发酵有促进作用，但酵母接种量过多不仅对酒精的生成不利，还会使得果酒产生不愉快的滋味[20]。因此，选择酵母接种量为0.3%。
图2 酵母接种量对青梅桂花酒发酵品质的影响
Fig.2 Effect of yeast inoculum on fermentation quality of greengage-Osmanthus fragrans wine
2.1.3 初始糖含量对青梅桂花果酒的影响
初始糖含量对青梅桂花酒发酵的影响见图3。由图3可知，随着初始糖含量在18%～26%范围内的增加，青梅桂花果酒的酒精度和感官得分都呈现先上升后下降的趋势，且都在初始糖含量为24%时达到最大值。作为乙醇的来源，初始糖含量的多少对果酒酒精度的高低有直接影响[21]，且一定量的糖度对青梅原料低糖高酸的特性有优化弥补作用，但糖含量过高又会影响酵母的活性，不利于乙醇的生成。因此，选择初始糖含量为24%。
图3 初始糖含量对青梅桂花酒发酵品质的影响
Fig.3 Effect of initial sugar contents on fermentation quality of greengage-Osmanthus fragrans wine
2.1.4 初始pH值对青梅桂花果酒的影响
初始pH值对青梅桂花酒发酵的影响见图4。由图4可知，随着初始pH值在3.0～5.0范围内的增加，青梅桂花果酒的酒精度和感官得分都呈现先上升后下降的趋势，且在初始pH值为4.5时酒精度最高，在初始pH值为3.5时感官评分最高。适宜的微酸性环境有利于酵母的生长，pH值太低不仅会影响果酒的发酵，还对其口感有较大影响；pH值过高会导致果酒色泽的变化，影响其品质[22]。因此，选择初始pH值为4.0。
图4 初始pH值对青梅桂花酒发酵品质的影响
Fig.4 Effect of initial pH on fermentation quality of greengage-Osmanthus fragrans wine
2.1.5 发酵温度对青梅桂花果酒的影响
发酵温度对青梅桂花酒发酵的影响见图5。由图5可知，随着发酵温度在18～26 ℃的升高，青梅桂花果酒的酒精度和感官得分都呈现先上升后下降的趋势，且在发酵温度为24 ℃时酒精度最大，在发酵温度为22 ℃时感官评分最高。在低温环境下发酵会使青梅桂花酒的花香和果香更加浓郁，但对酵母的生长有一定抑制作用；高温虽然能加快酵母的生长速率，但会使酵母自溶，降低细胞存活率[23]。因此，选择发酵温度为22 ℃。
图5 发酵温度对青梅桂花酒发酵品质的影响
Fig.5 Effect of fermentation temperature on fermentation quality of greengage-Osmanthus fragrans wine
2.1.6 发酵时间对青梅桂花果酒的影响
发酵时间对青梅桂花酒发酵的影响见图6。由图6可知，随着发酵时间在3～7 d范围内的增加，青梅桂花果酒的酒精度和感官得分都呈现先上升后下降的趋势，且在发酵时间为6 d时酒精度最高，在发酵时间为5 d时感官评分最高。发酵时间太短酒体酒精度不够，风味不明显；发酵时间过长会使得果酒总酸含量升高，影响口感协调性[24]。因此，选择发酵时间为5 d。
图6 发酵时间对青梅桂花酒发酵品质的影响
Fig.6 Effect of fermentation time on fermentation quality of greengage-Osmanthus fragrans wine
2.2 青梅桂花酒发酵工艺优化响应面试验
根据单因素试验结果，进而选择桂花添加量、初始糖含量、初始pH值、发酵温度进行响应面试验，以此得出最佳的发酵工艺条件，试验设计及其结果见表2，方差分析结果见表3。
表3 回归模型方差分析
Table 3 Variance analysis of regression model
续表
注：“**”表示对结果影响极显著，P＜0.01；“*”表示对结果影响显著，0.01＜P＜0.05。
通过响应面软件对表2的结果进行分析，得到桂花添加量（A）、初始糖含量（B）、初始pH值（C）和发酵温度（D）4个自变量对青梅桂花酒酒精度（Y1）和感官评分（Y2）的回归方程分别为：
表2 青梅桂花酒发酵工艺优化响应面设计与结果
Table 2 Design and results of response surface experiments for fermentation conditions optimization of greengage-Osmanthus fragrans wine
对于酒精度和感官评分这两个响应值，回归模型皆为极显著（P＜0.000 1）；且失拟项P（酒精度）=0.209 5和P（感官评分）=0.051 8，可以得出失拟项不显著，说明该回归方程拟合度好。
由决定系数
，校正决定系数为
=0.867 6可知，此模型中的86.76%青梅桂花酒的酒精度变化来自于自变量A、B、C、D。通过F值和P值得到影响酒精度的各因素顺序为初始pH值（C）＞初始糖含量（B）＞桂花添加量（A）＞发酵温度（D）。
，可以得出此模型中的92.47%青梅桂花酒的酒精度变化来自于自变量A、B、C、D。通过F值和P值得到影响感官评分的各因素顺序为初始糖含量（B）＞桂花添加量（A）＞发酵温度（D）＞初始pH值（C）。
各因素交互作用对酒精度和感官评分影响的响应面图及等高线见图7。由图7可知，随着初始糖含量和初始pH值共同增加，酒精度的变化最为明显，其交互作用对青梅桂花酒的酒精度的影响显著（P＜0.05）。桂花添加量和初始pH值交互作用对青梅桂花酒的感官评分的响应曲面呈凸形，等高线呈椭圆形，说明二者交互作用极显著（P＜0.01）[25-26]，与方差分析结果一致。
图7 各因素交互作用对酒精度和感官评分影响的响应曲面和等高线
Fig.7 Response surface plots and contour lines of effects of interaction between factors on alcohol content and sensory evaluation of the greengage-Osmanthus fragrans wine
根据Design-Expert 11软件的分析结果，得到青梅桂花酒理论预测的最佳工艺条件为：桂花添加量2.03 g/kg，初始糖含量23.82%，初始pH值4.10，发酵温度22 ℃，最终产品的酒精度为10.9%vol、感官评分为85.1分。
2.3 最佳工艺验证试验
考虑到实际操作条件，将最佳工艺条件调整为桂花添加量2 g/kg，初始糖含量24%，初始pH值4.10，发酵温度22 ℃，其他因素不变，在该条件下进行3次平行试验，最终测得青梅桂花酒的酒精度和感官评分分别为10.8%vol和83.9分，与预测值相近。因此经验证试验表明优化方案具有可行性。
2.4 青梅桂花酒质量指标结果
2.4.1 理化指标检测结果
以最优工艺发酵生产的青梅桂花酒理化指标的检测结果见表4。由表4可知，青梅桂花酒的理化指标符合NY/T 1508—2017《绿色食品 果酒》与QB/T 5476—2020《果酒通用技术要求》的标准要求。
表4 青梅桂花酒理化指标检测结果
Table 4 Determination results of physicochemical indexes of greengage-Osmanthus fragrans wine
2.4.2 青梅桂花酒风味成分分析
在最佳发酵工艺条件下制备青梅桂花果酒，对其挥发性香气成分进行GC-MS分析测定，结果见表5。
表5 青梅桂花酒香气成分检测结果
Table 5 Determination results of the flavor components of greengage-Osmanthus fragrans wine
由表5可知，共检出37种香气成分，占峰面积的76.85%。其中醇类占比32.71%、酯类占比25.59%、醚类占比2.01%、酮类占比1.96%、酸类占比0.50%、醛类占比0.31%、烃类占比5.42%、其他占比8.35%。大部分酯类都可以赋予酒体愉悦的香气[27]，能够使得青梅桂花果酒果香和花香浓郁、酒香醇厚、香气协调，在这37中香气成分中，酯类共有11种，数量最多，其中相对含量较高的有辛酸乙酯7.15%、乙酸戊酯6.65%、己酸乙酯4.31%、乙酸异戊酯3.88%、3-甲基戊酸乙酯1.87%。醇类物质是促使果酒香甜的重要物质[28]，青梅桂花果酒的香气成分中醇类物质共有5种，其相对含量为32.71%，占比最多；在这5种醇类物质中，异戊醇的含量最高，为29.25%，含量较多的还有3-甲基-1-戊醇1.51%及4-甲基-2-庚醇1.14%。酸类、醛类和酮类对果酒的香味也有重要影响，但就本研究的香味物质检测结果来看，青梅桂花果酒中的这些类别香气成分相对含量普遍较低。
3 结论
该研究制备了青梅桂花果酒，并通过响应面法确定了青梅桂花果酒的最佳发酵工艺条件：桂花添加量2 g/kg，初始糖含量24%，初始pH值4.10，发酵温度22 ℃。在此优化条件下，酒精度和感官评分分别为10.8%vol和83.9分；共检出37种香气成分，主要为醇类32.71%、酯类25.59%、醚类2.01%、酮类1.96%、酸类0.50%、醛类0.31%；且理化指标均符合果酒类相关标准。青梅桂花果酒澄清、透明、有光泽，具有协调悦人的香气，酒味浓郁无异味，有独特的风格，具有一定的工业化应用开发价值。后续将在产品品质的稳定性和营养风味价值上作进一步深入研究。
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