刺梨（Rosa roxburghii Tratt）又叫送春归、茨梨，是蔷薇科落叶灌木植物缫丝花的果实，药食两用，具有很高的营养价值和医用价值。据《本草纲目》、《中药大词典》中记载，刺梨有健胃消食、解毒消炎等作用，还有治疗腹胀腹泻的功效[1]。刺梨富含维生素C、维生素P、多酚、黄酮、超氧化物歧化酶（super oxide dismutase，SOD）、三萜类化合物、刺梨多糖、有机酸等功能性营养成分[2-3]，其中维生素C、维生素P、SOD 三种活性成分的含量位居各种水果前列，因此也有着“三王果”的美誉。这些丰富的活性物质使刺梨具有抗氧化和清除自由基[4]、调节糖脂代谢[5]、抑菌抗肿瘤[6]、抗辐射[7]等重要功能。随着国内外果蔬汁饮料逐渐向营养型的方向转变，刺梨产品逐渐成为研究热点之一[8]，如刺梨饮料、刺梨果酒、刺梨酸奶等[9]。
食用酵素最早起源于日本，近年来因富含SOD、多酚、黄酮、氨基酸、有机酸等生物活性成分而在食品和健康领域受到广泛关注[10-11]。目前，酵素生产多采用人工接种、液态发酵的方式[12]，人工接种发酵中常用的菌种主要为酵母菌、乳酸菌和醋酸菌。相关研究表明，先接种酵母菌后接种乳酸菌，分段发酵，效果更佳[13]。酵素具有抗氧化[14]、调节肠道菌群[15]、免疫调节[16]、抑菌消炎[17]、调节糖脂代谢[18]等多种作用。目前国内对酵素的研究开发尚处于初级阶段，且存在产品单一、生产过程中品质不稳定等问题，针对酵素存在的问题进行深入研究，对推动我国酵素行业的发展有重要意义。
刺梨产业作为贵州省脱贫攻坚特色主导产业之一，带动了当地的经济发展，解决了居民的就业问题，为打赢脱贫攻坚战起到了积极的促进作用。本研究以刺梨原汁为原料，采用酵母菌及乳酸菌混菌发酵制备刺梨原汁酵素，通过单因素试验及正交试验分别对其酵母菌发酵、乳酸菌发酵工艺进行优化，并对刺梨原汁酵素进行品质分析。旨在提高刺梨的利用率，丰富刺梨产品种类，增加刺梨加工企业的经济效益，对促进刺梨产业的可持续发展具有重要意义，同时还可为刺梨酵素的工业化生产提供理论依据和数据支持。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
1.1.1 原料与菌种
刺梨原汁：贵州省盘州市某刺梨加工企业提供；BV818、CECA、SY、RW活性干酵母：安琪酵母股份有限公司；植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）GDMCC1.191：广东省微生物菌种保藏中心。
1.1.2 试剂
SOD试剂盒：南京建成生物工程研究所；氯化钠（分析纯）：国药集团化学试剂有限公司；次甲基蓝（分析纯）：天津科密欧化学试剂有限公司；氯化钾、无水氯化钙（均为分析纯）：成都金山化学试剂有限公司；碳酸氢钠、葡萄糖、蔗糖（均为分析纯）：天津永大化学试剂有限公司；氢氧化钠、盐酸、硫酸（均为分析纯）：重庆市川东化工有限公司；γ-氨基丁酸、芦丁标准品（纯度均＞98%）：北京索莱宝科技有限公司。
1.1.3 培养基
MRS肉汤培养基：上海博微生物科技有限公司；营养琼脂（nutrient agar，NA）培养基：北京索莱宝生物科技有限公司。
1.2 仪器与设备
FA2004N精密电子天平：上海菁海仪器有限公司；HH-6数显恒温水浴锅：常州奥华仪器有限公司；SPX-250B生化培养箱：上海琅玕试验设备有限公司；YXQ-LS-5DS11压力蒸汽灭菌锅、SN-CJ-IF无菌操作台：上海博讯实业有限公司医疗设备厂；TG16-WS台式高速离心机：湖南湘仪试验室仪器开发有限公司；722S可见分光光度计：上海菁华科技仪器有限公司；SMART生物显微镜：重庆奥特光学仪器有限公司；Pegasus HRT 4D Plus全二维气相色谱-质谱联用仪：美国力可公司。
1.3 实验方法
1.3.1 刺梨原汁酵素制备工艺流程及操作要点[19]
刺梨原汁→调糖→菌株活化→酵母菌发酵→乳酸菌发酵→刺梨原汁酵素
操作要点：
调糖：在刺梨原汁中加入5%的白砂糖，并搅拌均匀。
酵母菌活化：取一定量的安琪酵母，加入适量的蒸馏水，于37 ℃的恒温水浴锅中活化30 min后待用。
植物乳杆菌活化：取一管于EP管中甘油保藏的植物乳杆菌（以发酵物料的质量计）37 ℃活化后，接入100 mL灭菌后的MRS肉汤培养基中，于37 ℃恒温培养24 h后待用。
酵母菌、乳酸菌发酵：以选定的酵母菌株进行发酵，在发酵温度25 ℃、白砂糖添加量5%、酵母菌接种量0.2%条件下发酵24 h，酵母菌发酵结束后，在接种植物乳杆菌2.0%，发酵温度37 ℃条件下发酵24 h，即获得刺梨原汁酵素。
1.3.2 刺梨原汁酵素发酵工艺优化
（1）酵母菌发酵工艺优化单因素试验
采用单因素轮换法，分别考察酵母菌菌种（BV 818、CECA、SY、RW）、发酵时间（8 h、16 h、24 h、32 h、40 h）、发酵温度（21 ℃、23 ℃、25 ℃、27 ℃、29 ℃）、白砂糖添加量（3%、4%、5%、6%、7%）、酵母菌接种量（0.10%、0.15%、0.20%、0.25%、0.30%）对SOD活性和酵母菌活菌数的影响。
（2）酵母菌发酵工艺优化正交试验
在单因素试验的基础上，以发酵时间（A）、白砂糖添加量（B）、发酵温度（C）、酵母菌接种量（D）为影响因素，以SOD活性和酵母菌活菌数为评价指标，设计4因素3水平L9（34）正交试验，每组试验平行测定3次，正交试验因素与水平见表1。
表1 酵母菌发酵工艺优化正交试验因素与水平
Table 1 Factors and levels of orthogonal tests for yeast fermentation technology optimization
（3）乳酸菌发酵工艺优化单因素试验
以SOD活性和乳酸菌活菌数为评价指标，在发酵温度37 ℃、乳酸菌接种量2.0%、发酵时间24 h的条件下，固定其他因素条件，分别考察发酵时间（8 h、16 h、24 h、32 h、40 h）、乳酸菌接种量（1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%）、发酵温度（35 ℃、36 ℃、37 ℃、38 ℃、39 ℃）对SOD活性的影响。
（4）乳酸菌发酵工艺优化正交试验
在单因素试验的基础上，以发酵时间（A）、乳酸菌接种量（B）、发酵温度（C）为影响因素，以SOD活性和乳酸菌活菌数为评价指标，设计3因素3水平L9（33）正交试验，每组试验平行测定3次，正交试验因素与水平见表2。
表2 乳酸菌发酵工艺优化正交试验因素与水平
Table 2 Factors and levels of orthogonal tests for lactic acid bacteria fermentation technology optimization
1.3.3 分析检测
（1）理化及微生物指标
SOD活力：取发酵液于4 000 r/min离心10 min，取上清液稀释至适宜倍数，参照SOD试剂盒方法测定；酵母菌活菌数：采用血球计数法测定[20]；乳酸菌活菌数：参照GB 4789.35—2016《食品安全国家标准食品微生物学检验乳酸菌检验》[21]中的平板计数法测定；pH：采用pH计测定；多糖含量：参照文献[22]的方法测定；总黄酮、总多酚含量：参照文献[23]的方法测定；γ-氨基丁酸含量：参照文献[24]的方法测定；总酸含量：参照GB/T 12456—2021《食品安全国家标准食品中总酸的测定》[25]中pH计电位滴定法测定；有机酸含量：参照文献[26]的方法测定；游离氨基酸含量：采用氨基酸全自动分析仪测定。
（2）感官指标
感官评定组由具有食品专业知识背景的10名成员组成（男女各半），分别从色泽、香气、口感、形态4个方面进行评价[27-28]，满分100分，刺梨原汁酵素感官评价标准见表3。
表3 刺梨原汁酵素感官评价标准
Table 3 Sensory evaluation standards of Rosa roxburghii juice Jiaosu
1.3.4 数据处理
每组试验进行3次平行。数据分析采用Excel 2010、SPSS19.0进行，绘图采用Origin 2018。
2 结果与分析
2.1 刺梨原汁酵素发酵工艺优化
2.1.1 酵母菌发酵工艺优化单因素试验结果
不同的酵母菌菌种对SOD活性和酵母菌活菌数的影响结果见图1。
图1 不同酵母菌种对刺梨原汁酵素超氧化歧化酶活性及酵母菌活菌数的影响
Fig.1 Effect of different yeast strains on superoxide dismutase activity and viable yeast counts of Rosa roxburghii juice Jiaosu
a：酵母BV818；b：酵母CECA；c：酵母SY；d：酵母RW。
由图1可知，不同的酵母菌菌种在相同的发酵条件下生长速度有所差异，SOD活性也有所不同。从整体来看，在发酵过程中，不同酵母菌所对应的SOD活性和酵母菌活菌数均随发酵时间的增加呈先上升后降低的趋势，其中SY菌种的SOD活性和酵母菌活菌数均优于其他菌种，RW菌种效果最差。在SY菌种发酵过程中，SOD活性在16 h时达到最大值6 995.45 U/mL，此时酵母菌活菌数为1.40×108CFU/mL；酵母菌活菌数在24 h时达到最大值1.49×108 CFU/mL，此时SOD活性为6 791.41 U/mL。综合考虑，确定以SY菌种进行发酵，发酵时间为24 h。
不同白砂糖添加量、发酵温度、酵母接种量、发酵温度对SOD活性和酵母菌活菌数的影响结果见图2。
由图2A可知，随着白砂糖添加量的增加，SOD活性和酵母菌活菌数均呈先上升后降低的趋势，在白砂糖添加量5%时最高，分别为6 771.27 U/mL，1.47×108 CFU/mL。白砂糖添加量过高或过低都可能严重影响微生物的生长和产物的合成[29]。因此，选择最适白砂糖添加量为5%。由图2B可知，随着发酵温度的升高，SOD活性和酵母菌活菌数均呈先上升后降低的趋势，在25 ℃时最高，分别为6 782.87 U/mL、1.46×108 CFU/mL。这可能是因为温度较低时，酵母菌代谢缓慢，导致发酵效率低；而较高的温度会抑制菌种酶的活性，从而抑制酵母菌的生长代谢[30]。因此，选择最适发酵温度为25 ℃。由图2C可知，随着接种量的升高，SOD活性和酵母菌活菌数均呈先上升后降低的趋势，在接种量为0.25%时最高，分别为7 039.86 U/g、1.49×108 CFU/mL。接种量过大时菌种生长代谢过快，使溶氧不足，不利于产物生产[31]，同时营养物质消耗过快，也不利于后续发酵的进行，因此，选择最适酵母菌接种量为0.25%。由图3D可知，随着时间的变化，酵母菌活菌数呈先上升后降低的趋势，SOD活性在16 h时达到最大值，为6 970.72 U/mL。因此，选择最适发酵时间为16 h。
图2 白砂糖添加量（A）、发酵温度（B）、酵母菌接种量（C）、发酵时间（D）对刺梨原汁酵素超氧化歧化酶活性和酵母菌活菌数的影响
Fig.2 Effect of sugar addition (A),fermentation temperature (B),yeast inoculum (C),and fermentation time (D) on superoxide dismutase activities and viable yeast counts of Rosa roxburghii juice Jiaosu
2.1.2 酵母菌发酵工艺优化正交试验结果
在单因素试验的基础上，以发酵时间（A）、白砂糖添加量（B）、发酵温度（C）、酵母菌接种量（D）为影响因素，以SOD活性和酵母菌活菌数为评价指标，设计4因素3水平L9（34）正交试验，酵母菌发酵工艺优化正交试验结果与分析见表4。
表4 酵母菌发酵工艺优化正交试验结果与分析
Table 4 Results and analysis of orthogonal tests for yeast fermentation technology optimization
由表4可知，4个因素对SOD活性影响的主次因素顺序为D＞A＞B＞C，即酵母菌接种量＞发酵时间＞白砂糖添加量＞发酵温度，最优酵母菌发酵工艺组合为A2B2C3D3，即酵母菌接种量0.30%，发酵时间16 h，糖添加量5%，发酵温度27 ℃。在此优化条件下进行3次平行验证试验，SOD活性为（7 294.41±63.98）U/mL，酵母菌活菌数为（1.46±0.04）×108 CFU/mL；对酵母菌活菌数影响的主次因素为D＞B＞C＞A，即酵母菌接种量＞白砂糖添加量＞发酵温度＞发酵时间，最优酵母菌发酵工艺组合为A2B3C1D2，即酵母菌接种量0.25%，白砂糖添加量6%，发酵温度23 ℃，发酵时间16 h。在此优化条件下进行3次平行验证试验，SOD活性为（7 181.03±25.68）U/mL，酵母菌活菌数为（1.50±0.05）×108 CFU/mL。综合考虑，确定最适酵母菌发酵工艺条件为酵母菌接种量0.30%，发酵时间16 h，白砂糖添加量5%，发酵温度27 ℃。
2.1.3 乳酸菌发酵工艺优化单因素试验结果
乳酸菌发酵时间、接种量、发酵温度对SOD活性和乳酸菌活菌数的影响结果见图3。
由图3A可知，SOD活性和乳酸菌活菌数均随发酵时间的延长呈现上升后下降的趋势，在发酵时间24 h时达到最大值，分别为7 430.98 U/mL、1.51×108 CFU/mL。可能是随着发酵时间的延长，营养物质不断消耗，菌体处于衰亡期，导致乳酸菌活菌数降低，同时乳酸菌产酸量也在不断增加，从而抑制了SOD活性[32]。因此，选择最适发酵时间为24 h。由图3B可知，SOD和乳酸菌活菌数均随乳酸菌接种量的增加呈现上升后下降的趋势，在接种量2.0%达到最大值时，分别为7 479.56 U/mL、1.49×108 CFU/mL。因此，选择最适接种量为2.0%。由图3C可知，SOD活性和乳酸菌活菌数随发酵温度的增加呈现增加后降低的趋势，在36 ℃时达到最大值，分别为7 268.87 U/mL，1.55×108 CFU/mL。发酵温度升高，微生物代谢加快，改变了气体传递速率及溶解度，降低发酵液溶氧量，影响微生物正常生长代谢[33]。因此，选择最适发酵温度为36 ℃。
图3 发酵时间（A）、乳酸菌接种量（B）、发酵温度（C）对刺梨原汁酵素超氧化歧化酶活性和乳酸菌活菌数的影响
Fig.3 Effect of fermentation time (A),lactic acid bacteria inoculum(B),fermentation temperature (C) on superoxide dismutase activities and viable lactic acid bacteria counts of Rosa roxburghii juice Jiaosu
2.1.4 乳酸菌发酵工艺优化正交试验结果
在单因素试验的基础上，以发酵时间（A）、乳酸菌接种量（B）、发酵温度（C）为影响因素，以SOD活性为评价指标，设计3因素3水平L9（33）正交试验，乳酸菌发酵工艺优化正交试验结果与分析见表5。
表5 乳酸菌发酵工艺优化正交试验结果及分析
Table 5 Results and analysis of orthogonal tests for lactic acid bacteria fermentation technology optimization
由表5可知，3个因素对SOD活性影响的主次因素为A＞C＞B，即发酵时间＞发酵温度＞乳酸菌接种量，最优乳酸菌发酵工艺组合为A3B3C2，即发酵时间32 h，发酵温度36 ℃，乳酸菌接种量2.5%。在此优化条件下进行3次平行验证试验，SOD活性为（7 709.89±66.72）U/mL，乳酸菌活菌数为（1.50±0.11）×108 CFU/mL。综合考虑，确定最适乳酸菌发酵工艺条件为发酵时间32 h，发酵温度36 ℃，乳酸菌接种量2.5%。
2.2 刺梨原汁酵素品质分析
2.2.1 理化指标
刺梨原汁及刺梨原汁酵素理化指标检测结果见表6。
表6 刺梨原汁及刺梨原汁酵素理化指标检测结果
Table 6 Determination results of physiochemical indexes of Rosa roxburghii juice Jiaosu
注：YZ1代表刺梨原汁，YZ2代表刺梨原汁酵素。
由表6可知，经发酵后，各理化指标均发生了一定变化，除多糖外，其余指标均呈不同幅度的增加。以刺梨原汁为原料制备的刺梨酵素，符合T/CBFIA 08003—2017《食用植物酵素》标准中特征性理化指标的要求。
2.2.2 有机酸分析结果
以有机酸标准品质量浓度（x）为横坐标，对应峰面积（y）为纵坐标，绘制有机酸标准曲线回归方程、相关系数R2见表7。
由表7可知，在对应浓度范围内，7种有机酸标准曲线线性关系较好，可用于有机酸含量分析。
表7 有机酸标准曲线回归方程及相关系数
Table 7 Standard curves regression equation and correlation coefficient of organic acids
有机酸是影响酵素品质的因素之一，适量的有机酸存在，可以改善酵素的风味，抑制外源菌的生长。刺梨原汁酵素的有机酸含量测定结果见表8。
表8 刺梨原汁酵素有机酸含量测定结果
Table 8 Determination results of organic acid contents of Rosa roxburghii juice Jiaosu
由表8可知，刺梨原汁酵素共检出6种有机酸，有机酸总含量为1.30 g/L，主要以草酸、酒石酸、乳酸、乙酸为主，酵母菌通过糖降解和三羧酸循环途径，在生长期可产生大量有机酸，乳酸菌除可通过糖代谢生成乳酸，还可在苹果酸乳酸酶的作用下将苹果酸转化成乳酸，这可能也是刺梨酵素中苹果酸含量较少的原因。
2.2.3 游离氨基酸的测定
对刺梨原汁酵素中游离氨基酸测定结果见表9。
表9 刺梨原汁酵素游离氨基酸含量测定结果
Table 9 Determination results of free amino acid contents of Rosa roxburghii juice Jiaosu
由表9可知，刺梨原汁酵素中，共检出10种氨基酸，总含量为1.81 mg/mL，其中必需氨基酸3种，占氨基酸总含量的33.14%。氨基酸对维系人体生命活动具有重要意义，它不仅具有各种生理功能，自身还具有呈味特性，参与了刺梨酵素风味物质的合成[34]，这些氨基酸的存在，丰富了刺梨酵素的营养成分和口感风味。
2.2.4 感官评价
刺梨原汁酵素感官评价结果见表10。
表10 刺梨原汁酵素感官评价结果
Table 10 Sensory evaluation results of Rosa roxburghii juice Jiaosu
由表10可知，刺梨原汁酵素感官评分为89分，有光泽，具有刺梨风味，有一定的发酵香，酸甜爽口，酸味柔和不刺激；无肉眼可见的外来杂质，无明显分层现象，符合团体标准T/CBFIA 08003—2017《食用植物酵素》的要求。
3 结论
通过单因素试验和正交试验，确定最佳酵母菌发酵工艺条件为：以SY酵母菌为发酵菌种，酵母菌接种量0.3%，发酵时间16 h，白砂糖添加量5%，发酵温度27 ℃。在此优化条件下，刺梨原汁酵素的SOD活性为7 294.41 U/mL，酵母菌活菌数为1.46×108 CFU/mL。最佳乳酸菌发酵工艺条件为：发酵时间32 h，发酵温度36 ℃，乳酸菌接种量2.5%。在此优化条件下，刺梨原汁酵素的SOD活性为7 709.89 U/mL，乳酸菌活菌数为1.50×108 CFU/mL。本研究制备刺梨原汁酵素，感官评分为89分，具有刺梨独特的风味及发酵香，酸味柔和，无明显外来杂质。刺梨原汁酵素与未发酵前相比，除多糖外，其余指标均呈不同幅度增加。刺梨原汁酵素共检出6种有机酸，总含量为1.30 g/L，主要以草酸、酒石酸、乳酸、乙酸为主。刺梨原汁酵素共检出10种氨基酸，总含量为1.81 mg/mL，这些氨基酸对刺梨原汁酵素风味形成做出了一定的贡献。
本研究对刺梨产品开发具有一定的参考意义，对刺梨产业行业有一定的进步性价值，但对刺梨原汁酵素风味物质以及滋味物质的研究不够深入和全面，未来还可以一步进行降血脂、提高免疫力等功能性研究，加深对刺梨原汁酵素的全面认识。
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