羊肚菌（Morchella esculenta）是野生名贵食药用菌，含有丰富的蛋白质、生物碱、多糖、脂肪酸、酚酸等营养成分[1-2]，而其中酚酸类化合物含量较高且种类丰富。酚酸类化合物系指在一个苯环上有多个酚羟基取代的芳香羧酸类化合物，其具有抗肿瘤、抗炎、调节免疫力、抗病毒等显著生物活性[3-5]，是预防或治疗慢性炎性疾病的一种天然药物[6-10]。没食子酸、绿原酸、咖啡酸及其衍生物等酚酸类化合物可通过保护细胞、调控相关凋亡基因表达起到抗肿瘤作用[11-13]。酚酸类化合物多存在植物中，如金银花、隐丹参酮、丹参、核桃、柑橘、大球盖菇、当归等。其主要包括没食子酸类、绿原酸、奎宁酸类衍生物、丹参酚酸类化合物、茶多酚类化合物及鞣花酸鞣质类等酚酸类化合物[14-16]。冯佳亮[17]在从粗毛纤孔菌中分离纯化4种酚酸类单体化合物具有抗炎活性分子，具有显著的消炎作用。宋亚玲等[18]从金银花醋酸乙酯部位中分离得到8个酚酸类化合物，均对脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）刺激的巨噬细胞炎症因子均具有不同程度的抑制作用。通过了解羊肚菌次生代谢途径及调控机制，可以通过代谢工程手段改善代谢途径，提高酚酸类化合物代谢产物量；也可以通过合成生物学手段，合成所需目的酚酸类化合物。
蓬勃发展的代谢组学技术在酚酸类化合物测定上更是有显著成效。林洁鑫等[19]利用代谢组学技术对不同产地的红茶代谢产物进行比较分析，共检出937种代谢物；鲁忠富等[20]利用代谢组学技术对不同品种瓠瓜进行代谢物差异分析，共筛选到66种显著差异物质；方贤胜等[21]利用代谢组学技术对不同颜色核桃内种皮成分进行差异分析，共检出680种代谢物。
本实验室前期相关研究表明，MLM与MTL羊肚菌内酚酸类化合物种类多且含量较高，且具备较高的生物学活性。为了探究羊肚菌子实体酚酸类代谢物差异，本研究采用超高效液相色谱-串联质谱（ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，UPLC-MS/MS）技术分析MLM和MTL羊肚菌子实体中酚酸类化合物种类及含量，利用代谢组学技术，重点研究羊肚菌子实体MLM与MTL中酚酸类化合物差异代谢物的相关生物学特性和代谢途径。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
羊肚菌MLM和菌株MTL子实体：沈阳市康平种植基地提供。实验子实体的生长环境和栽培管理措施一致。采用统计分析学里的采样方法对羊肚菌MLM与菌株MTL的子实体进行科学采样。
甲醇、乙腈、乙醇、二甲基亚砜（均为色谱纯）：德国默克公司；氯化钠、氯化钾、磷酸二氢钠、柠檬酸、NaOH（均为分析纯）：国药集团化学试剂有限公司；Tris（分析纯）：赛默飞世尔科技（中国）有限公司。
1.2 仪器与设备
MM 400研磨仪：德国莱驰公司；CBM20A超高效液相色谱仪：日本岛津公司；QTRAP 6500串联质谱：赛默飞世尔科技（中国）有限公司；7754070冷冻机：美国Labconco公司；5430R高速冷冻离心机：德国Eppendorf公司；Milli-Q超纯水机：德国IKA公司；Cubis 
II电子天平：德国赛多利斯公司。
1.3 试验方法
1.3.1 样品预处理
羊肚菌MLM和菌株MTL子实体样品干燥（-18 ℃冷冻干燥72 h）后，研磨粉碎后过200目筛，称取0.1～0.2 g粉末样品溶解于1.2 mL 体积分数为70%甲醇溶液中，涡旋振荡1～2 min混匀，于4 ℃冰箱静置20～28 h，在10 000～12 000 r/min条件下离心15 min，取上清液经0.45 μm微孔滤膜过滤，保存于进样瓶中，用于UPLC-MS/MS分析。
1.3.2 酚酸类化合物的测定
酚酸类化合物的测定利用UPLC-MS/MS法。
液相及质谱条件参考CHEN W等[22-23]的方法。液相色谱条件为：Agilent SB-C18色谱柱（1.8 μm，2.1 mm×100 mm）；流动相：A相为超纯水（加入0.2%的甲酸），B相为乙腈（加入0.2%的甲酸）；洗脱梯度：0～10 min内A由95%降低到5%、B由5%增加到95%，并维持在95%，保持2 min；12～14 min内B相比例降为5%，并以5%平衡30 min，流速0.40 mL/min；柱温40 ℃；进样量5 μL。
质谱条件为：电喷雾离子（electron sprayionization，ESI）源；离子源温度550 ℃；离子喷雾电压5 500 V（正离子模式）/-4 500 V（负离子模式）；离子源气体I（GSI），气体II（GSII）和帘气（CUR）分别设置为50 psi、60 psi和25.0 psi，碰撞诱导电离参数设置为高。采用多反应监测（multiple reaction monitor，MRM）模式，获得三重四极杆扫描结果。
1.3.3 数据分析
采用UPLC-MS/MS对羊肚菌酚酸类代谢物进行提取；根据迈维生物技术有限公司MVDB V2.0数据库、代谢物公共数据库对羊肚菌酚酸类代谢物进行鉴定。采用三重四极杆质谱多反应监测模式对羊肚菌酚酸类代谢物进行定量分析。差异代谢物根据Analyst 1.6.3软件对物质质谱峰进行峰面积积分、偏最小二乘判别分析（partial least squaresdiscriminant analysis，PLS-DA）、正交偏最小二乘判别分析（orthogonal partial least squares-discriminant analysis，OPLSDA）等，选取变量重要性投影（variable importance in the projection，VIP）值（VIP＞1）、单维统计（P＜0.05）及差异倍数（fold change，FC）值≥2和差异倍数值≤0.5的代谢物来筛选差异代谢物[24-26]。
2 结果与分析
2.1 MLM与MTL羊肚菌子实体中酚酸类化合物代谢组分总体分析
采用UPLC-MS/MS对羊肚菌子实体酚酸类代谢物进行定性与定量分析，结果见表1。由表1可知，MLM与MTL样本中检测到102种酚酸类代谢物，其中羊肚菌菌株MLM子实体98种酚酸类代谢物，羊肚菌菌株MTL子实体97种酚酸类代谢物。共有化合物93种，显著差异代谢物有55种，其中6'-O-阿魏酰-D-蔗糖、苯甲酰酒石酸、二氢咖啡酰葡萄糖、3,4-二甲氧基肉桂酸只在MTL中含有3,4-二羟基苯乙醇、丁香酸、棓因、3-O-阿魏酰奎宁酸、硫磺菊素只在MLM含有。MLM和MTL子实体中酚酸类差异代谢物含量分别占酚酸类代谢物含量的45.37%、54.63%。
表1 MLM与MTL羊肚菌子实体样品中酚酸类代谢物测定结果
Table 1 Determination results of phenolic acid metabolites of Morchella esculenta MLM and MTL fruitbody samples
续表
续表
注：“√”表示含有化合物；“－”表示不含有化合物；“*”表示化合物存在同分异构体。
2.2 MLM与MTL羊肚菌子实体中酚酸类化合物组分差异分析
2.2.1 主成分分析结果
通过对样本酚酸类化合物进行分析，区别MLM与MTL羊肚菌子实体样本之间组内与组间的变异度大小，得到5个主成分，结果见图1。由图1a可知，主成分分析（principal component analysis，PCA）结果显示主成分PC1、PC2、PC3的方差贡献率分别为92.62%、4.24%、3.14%，PCA结果显示各组间分离趋势较好，提示样本组间代谢组存在明显差异，差异较大易于后期研究提取分离酚酸类化合物。由图1b可知，两样本具有明显的分离趋势，组间MLM分离大于MTL，酚酸类化合物提取较为容易。结果表明，PCA能够从整体上反映出两组样品之间的代谢物存在明显差异。
图1 MLM与MTL羊肚菌子实体样品中酚酸类代谢物的主成分分析得分图
Fig.1 Principal component analysis score plots of phenolic acids metabolites in Morchella esculenta MLM and MTL fruitbody samples
2.2.2 正交偏最小二乘法判别分析结果
基于正交偏最小二乘法判别分析（orthogonal partial least square-discriminant analysis，OPLS-DA）模型，对102种酚酸类代谢物数据进行分析及验证实验，结果见图2。由图2a可知，样品的区分效果明显。OPLS-DA得到主成分1的方差贡献率为92.8%、主成分2的方差贡献率为3.10%。评价模型的预测参数有R2X，R2Y和Q2，其中R2X和R2Y分别表示所建模型对X和Y矩阵的解释率，Q2表示模型的预测能力，这三个指标越接近于1时表示模型越稳定可靠，Q2＞0.5时可认为是有效的模型，其中Q2＞0.9为出色的模型。由图2b可知，对OPLS-DA进行置换验证实验（n=200）。X轴方向模型的累积解释率R2X=0.959，X轴方向模型的累积解释率R2Y=1、模型的累积预测率Q2=1，根据OPLS-DA模型分析代谢组数据，绘制各分组的得分图，进一步展示各个分组之间的差异。
图2 MLM与MTL羊肚菌子实体样品中酚酸类代谢物的正交偏最小二乘判别分得分图（a）及验证图（b）
Fig.2 Orthogonal partial least squares discriminant analysis score plot (a) and validation plot (b) of phenolic acids metabolites in Morchella esculenta MLM and MTL fruitbody samples
2.2.3 差异代谢物鉴定
根据OPLS-DA 结果，获得VIP值（VIP值反映出对应代谢物的组间差异在模型中各组样本分类判别中的影响强度），一般认为VIP值＞1的代谢物则为差异显著。通过筛选VIP值＞1 的代谢物，得到55种（见表2）差异代谢物，占共有代谢成分（93种）的59.14%，说明两种羊肚菌子实体酚酸类代谢物质差异显著。
表2 MLM与MTL羊肚菌子实体样品中酚酸类代谢物分析结果
Table 2 Analysis results of phenolic acid metabolites of Morchella esculenta MLM and MTL fruitbody samples
2.3 酚酸类差异代谢物产物分析
2.3.1 酚酸类差异代谢物聚类分析
为方便观察代谢物变化规律，对各组样品中差异显著的酚酸类代谢物的原始相对含量采用归一化处理（unit variance scaling，UV Scaling），通过R软件ComplexHeatmap包绘制热图，结果见图3。由图3可知，在55种酚酸类差异代谢物中，相对于羊肚菌菌株MTL子实体，菌株MLM子实体中有14种酚酸类代谢物含量显著增加，增加的代谢成分占55种酚酸类差异代谢成分的25.45%；相对于菌株MTL子实体，菌株MLM子实体中有41种酚酸类代谢物含量显著降低，降低的代谢成分占55种酚酸类差异代谢成分的74.55%。
图3 MLM与MTL羊肚菌子实体样品中酚酸类差异代谢物热图
Fig.3 Heat map of phenolic acids differential metabolites of Morchella esculenta MLM and MTL fruitbody samples
2.3.2 主要酚酸类差异代谢物成分分析
根据差异倍数值来确定主要差异酚酸类代谢物的上调及下调，结果见图4。由图4可知，MLM和MTL相比较，差异倍数大的前20种酚酸类差异代谢物，上调酚酸类代谢物前10的是3,4-二甲氧基肉桂酸、二氢咖啡酰葡萄糖、苯甲酰酒石酸、6'-O-阿魏酰-D-蔗糖、二氢咖啡酸、邻苯二甲酸、邻氨基苯甲酸-1-O-槐糖苷、绿原酸甲酯、2-羟基-（4-羟基苯基）丙酸、4-氯水杨酸；下调酚酸类代谢物前10的是3-O-阿魏酰奎宁酸、3,4-二羟基苯乙醇、硫磺菊素、棓因、丁香酸、3-羟基苯基乙酸甲酯、咖啡酸、3-（3-羟基苯基）丙酸、5-O-对香豆酰奎宁酸、甲基丁香酚。MLM和MTL相比上调有14种，下调的有41种，差异代谢物占总代谢物的53.92%。其中邻苯二甲酸二异辛酯在MLM中含量最高；2-羟基-（4-羟基苯基）丙酸在MTL中含量最高。其中6'-O-阿魏酰-D-蔗糖、苯甲酰酒石酸、二氢咖啡酰葡萄糖、3,4-二甲氧基肉桂酸只在MTL中含有，3,4-二羟基苯乙醇、丁香酸、棓因、3-O-阿魏酰奎宁酸、硫磺菊素只在MLM含有；在显著酚酸类差异代谢产物中MTL中2-羟基-（4-羟基苯基）丙酸含量最高，而在MLM中邻苯二甲酸二异辛酯含量最高，MTL酚酸类代谢物含量占总代谢物含量的54.63%，MLM酚酸类代谢物含量占总代谢物含量的45.37%，说明MTL比MLM有较高的营养保健价值。
图4 MLM与MTL羊肚菌子实体样品中酚酸类差异代谢物差异倍数柱状图
Fig.4 Histogram of difference fold for phenolic acids differential metabolites of Morchella esculenta MLM and MTL fruitbody samples
2.3.3 酚酸类差异代谢物KEGG功能注释及富集分析
根据差异代谢物结果，进行京都基因和基因组百科全书（kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路富集分析，结果见图5。由图5可知，55种酚酸类显著差异代谢物，主要分布在18条代谢通路中。酚酸类差异代谢物富集最多的前5条通路是：①新陈代谢途径通路中有20种酚酸类差异代谢物，占总差异代谢物的36.36%；②次生代谢通路有8种酚酸类差异代谢物，占总差异代谢物的14.55%；③酪氨酸代谢通路有7种酚酸类差异代谢物，占总差异代谢物的12.73%；④苯丙氨酸代谢通路有7种酚酸类差异代谢物质，占总差异代谢物的12.73%；⑤苯丙素生物合成通路有5种差异代谢物，占总差异代谢物的9.09%。
图5 MLM与MTL羊肚菌子实体样品中酚酸类差异代谢物KEGG富集分析结果
Fig.5 Analysis results of KEGG enrichment for phenolic acids differential metabolites of Morchella esculenta MLM and MTL fruitbody samples
3 结论
利用UPLC-MS/MS对羊肚菌子实体酚酸类代谢物进行分析，检测并鉴定出102种酚酸类代谢物，共有化合物93种，羊肚菌MLM及MTL中酚酸类代谢物含量分别占总酚酸类代谢物含量的45.37%、54.63%。与菌株MTL相比，差异代谢物有55种，菌株MLM有14种成分上调，有41种成分下调。其中邻苯二甲酸二异辛酯、2-羟基-（4-羟基苯基）丙酸分别在MLM、MTL中含量最高；其中6'-O-阿魏酰-D-蔗糖、苯甲酰酒石酸、二氢咖啡酰葡萄糖、3,4-二甲氧基肉桂酸只在MTL中含有，3,4-二羟基苯乙醇、丁香酸、棓因、3-O-阿魏酰奎宁酸、硫磺菊素只在MLM含有。差异代谢物主要分布在新陈代谢途径通路、次级代谢通路、酪氨酸代谢通路等18种代谢通路中。此次检测到酚酸类代谢物可为未来开发羊肚菌子药理活性提供重要依据。代谢组学信息可为羊肚菌酚酸类代谢物有效成分的分离纯化鉴定、活性成分药性研究以及羊肚菌新药理作用的发现提供参考。相关代谢途径也为后续研究关键代谢物、代谢途径上关键基因的功能及其主要代谢产物的生物合成提供参考。
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