四甲基吡嗪是一种食品饮料行业中重要的香味添加剂，具有烘烤、甜香的气味[1-2]。其香味阈值极低且对于其他香味物质有良好的衬托作用[3]。此外，四甲基吡嗪作为川芎的主要活性成分之一，对一些心血管、肝脏疾病具有一定的预防作用[4-5]，白酒中含有四甲基吡嗪，各种香型的白酒中，芝麻香型和酱香型白酒四甲基吡嗪含量较高[6-8]，四甲基吡嗪产生特殊的香味的同时，还可以赋予白酒一定的健康因子[9-11]。
白酒中四甲基吡嗪是由微生物代谢产生的前体物质乙偶姻和氨基酸酶解产生的氨经过非酶促反应而得，且高温对该反应有促进作用[12]。例如在酱香型白酒酿造过程中，部分芽孢杆菌能够大量合成四甲基吡嗪的前体物质乙偶姻，再经合成作用产生四甲基吡嗪[13-15]。在微生物合成四甲基吡嗪途径被提出后，许多学者开展了芽孢杆菌发酵生产四甲基吡嗪的研究，张温清等[16]将高温大曲中筛选的解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）应用于麸皮培养基，发酵2.5 d后四甲基吡嗪产量为202.54 μg/g。白酒是固态发酵的产物，所以将高产四甲基吡嗪的芽孢杆菌制成固态麸曲，具有重要的实际应用价值[17-18]。麸曲以麸皮为原料，工业上可以通过麸曲的制备对纯种微生物进行扩培，同时积累特定的代谢产物[19]。郑自强等[20]使用一株产纤维素酶的枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis），以生物量为响应值，采用响应面法优化制作工艺，制得具有多种纤维素酶活性的细菌麸曲。响应面法采用多元二次方程来拟合因素和响应值之间的函数关系，通过对回归方程的分析来寻求最优工艺，在各类优化问题中应用广泛[21]。武顺等[22]采用响应面法对麸曲的制作工艺进行优化，使得麸曲中的四甲基吡嗪含量显著提升。
本研究从酱香型高温大曲中筛选出了一株高产四甲基吡嗪的菌株，通过形态观察及分子生物学技术对其进行菌种鉴定，并将其制作成细菌麸曲，结合单因素试验和响应面法对麸曲的制作工艺进行优化，以期得到最优的麸曲制作工艺和实际生产效果。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
1.1.1 材料
高温大曲、稻壳、麸皮：均由某酒厂提供。
1.1.2 试剂
四甲基吡嗪标品（纯度＞98%）：北京盛世康普化工技术研究院；甲醇、乙醇（均为色谱纯）：成都金山化学试剂有限公司。其他试剂均为国产分析纯。
1.1.3 培养基
富集培养基：酵母膏3 g/L，蛋白胨10 g/L，淀粉3 g/L，MgSO4·7H2O 0.01 g/L，KH2PO4 0.2 g/L，Na2HPO4 2 g/L，pH7.8，121 ℃高压蒸汽灭菌20 min。
牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏5 g/L，蛋白胨10 g/L，氯化钠5 g/L，琼脂20 g/L，pH 7.0～7.2，121 ℃高压蒸汽灭菌30 min。
液态发酵培养基：酵母膏5 g/L，蛋白胨10 g/L，氯化钠10 g/L，pH 7.0～7.2，121 ℃高压蒸汽灭菌20 min。
固态发酵培养基：原料小麦与稻壳10∶1混合，常压下蒸30 min，使水分含量为40%。装入250 mL锥形瓶，每瓶分装50 g，用8层纱布封口，121 ℃高压蒸汽灭菌30 min。
1.2 仪器与设备
DK-98-II电热恒温水浴锅：天津市泰斯特仪器有限公司；JA1203电子天平、DSX-30L-I手提式高压蒸汽灭菌锅：上海申安医疗器械厂；THZ-98AB恒温振荡器、DK-8D电热恒温水槽：上海一恒科学仪器有限公司；安捷伦1260型高效液相色谱仪、安捷伦Poroshell 120 EC-C18色谱柱（4.6 mm×150 mm，4 μm）：安捷伦科技（中国）有限公司；DYCP-31DN脱氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）电泳槽、DYY-5稳压电泳仪：北京六一仪器厂。
1.3 实验方法
1.3.1 高产四甲基吡嗪菌株的分离纯化
无菌环境下称取10 g高温大曲粉，倒入100 mL无菌水中，180 r/min振荡30 min。然后在85 ℃水浴锅中水浴30 min。取5 mL上清液加入到95 mL的富集培养基中，振荡富集培养24 h，培养温度为37 ℃，转速170 r/min。将富集液梯度稀释至10-7。取10-5、10-6、10-7的稀释液涂布于牛肉膏蛋白胨培养基，37 ℃培养24 h。获得的单菌进行多次涂布划线交替操作，将筛得的菌株分开保存备用。
1.3.2 高产四甲基吡嗪菌株的筛选
将分离纯化后的菌株分别接种于液态培养基，温度37℃，转速140 r/min，装液量为50 mL/250 mL培养24 h，制成种子液。将种子液接种于固态发酵培养基，接种量为3%，于摇床培养箱培养发酵6 d，第1～3天设置温度为37 ℃，第4天设置温度为45 ℃，第5、6天温度设置为60 ℃，转速为180 r/min，以未接种种子液的固态发酵培养基为空白对照（CK）。发酵完成后测定四甲基吡嗪生成量。
1.3.3 高产四甲基吡嗪菌株的鉴定
菌落形态学鉴定：以稀释涂布的方法将筛得的菌株接种至牛肉膏蛋白胨培养基中，于恒温培养箱中37 ℃条件下培养36 h后观察其在培养基上所呈现的菌落特征。
分子生物学鉴定：根据细菌DNA提取试剂盒提取目的菌株DNA，选择引物序列：27F（5'-AGTTTGATCMTGGCTCAG-3'），1492R（5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'）进行聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR），在25.0 μL聚合酶链式反应体系中，加入提取的DNA 0.5 μL，10×Buffer（含Mg2+）2.5 μL，脱氧核糖核苷三磷酸（deoxyribonucleoside triphosphate，dNTP）1 μL，酶0.2 μL，加入上下游引物各0.5 μL，再加双蒸水（ddH2O）至25 μL。PCR扩增程序：94 ℃预变性4 min，94 ℃预变性45 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，共30个循环，最后72 ℃延伸10 min，取2 μL DNA溶液于1%琼脂糖凝胶100 V电泳20 min[23]。测序由上海生物工程有限公司进行。测序结果输入Genbank数据库中进行基本局部比对搜索工具（basic local alignment search tool，BLAST）比对，然后使用MEGA7软件，选择邻接（neighbor-joining，NJ）法来构建系统发育树。
1.3.4 麸曲的制作工艺
借鉴聂慧芳等[24]的方法，将原料麸皮与稻壳按8∶2的质量比混合后加一定量的水，蒸1h冷却后装瓶，121℃高压蒸汽处理20 min，灭菌完毕待冷却接种活化后稀释至OD600nm值=0.7的种子液，于培养箱中恒温培养固定时间后干燥打粉。
1.3.5 麸曲芽孢数计数方法[25]
采用平板计数法，在无菌环境下称取10 g麸曲样品，加入90 mL无菌水，将待测样品在80 ℃下水浴20 min，灭活菌体，留下芽孢。然后依次稀释至10-8。取10-7、10-8两个梯度进行涂布，培养12～24 h，观察平板上形成的菌落。
1.3.6 四甲基吡嗪的测定方法
前处理：称取10 g样品，加入0.1 g的无水氯化钙，体积分数为57%的乙醇溶液20 mL，浸泡摇匀，在25 ℃条件下经超声波浸提20 min，10 000 r/min离心10 min，上清液用0.22 μm滤膜过滤，每个样品做3个平行样，将得到的上清液合并，即得到待测样品。
高效液相色谱条件：Poroshell 120 EC-C18（4.6 mm×150 mm，4 μm）流动相为甲醇∶超纯水（0.05%三氟乙酸）=7∶3（V/V），柱温30 ℃，检测波长278 nm，流速1 mL/min，进样量5 μL。
1.3.7 麸曲培养条件优化单因素试验
水分含量选择：固定接种量为3%，培养时间为50 h，培养温度为37 ℃，麸皮加水量分别设置为40%、50%、60%、70%、80%，考察不同加水量对麸曲芽孢数量的影响。
接种量的选择：固定水分含量为50%，培养时间为50 h，培养温度为37 ℃，接种量分别设置为1%、3%、5%、7%、9%，考察不同接种量对麸曲芽孢数量的影响。
培养时间的选择：固定接种量为3%，水分含量为50%，培养温度为37 ℃，培养时间分别设置为35 h、40 h、45 h、50 h、55 h，考察培养时间对麸曲芽孢数量的影响。
培养温度的选择：固定接种量为3%，水分含量为50%，培养时间为50 h，培养温度分别设置为33 ℃、35 ℃、37 ℃、39 ℃、41 ℃，考察培养温度对麸曲芽孢数量的影响。
1.3.8 麸曲培养条件优化响应面试验
根据单因素试验的筛选结果，以水分含量（A）、接种量（B）、培养时间（C）、培养温度（D）为试验因素，麸曲芽孢数量（Y）为响应值，运用Design-Expert11软件设计Box-Behnken响应面试验，试验设计因素及水平见表1。
表1 麸曲培养条件优化Box-Behnken试验因素与水平
Table 1 Factors and levels of Box-Behnken experiments for culture conditions optimization of Fuqu
1.3.9 麸曲应用模拟
以最优工艺条件制作麸曲，将其应用于模拟固态发酵，以1%的接种量接种于固态发酵培养基，培养6 d，固态发酵的温度设置为37 ℃培养3 d，保证前体物质的积累，45 ℃培养1 d作为升温的缓冲，60 ℃高温培养2 d促进四甲基吡嗪的合成[12]，发酵结束后测定发酵产物中的四甲基吡嗪含量，验证麸曲产四甲基吡嗪能力。
1.3.10 数据分析
采用Excel 2016进行数据统计；采用Design-Expert 11软件设计响应面试验。
2 结果与分析
2.1 高产四甲基吡嗪菌株筛选
从大曲样品中通过稀释涂布和平板划线交替操作，分离出15株菌株，将其制成种子液接种于固态发酵培养基，模拟固态发酵，检测各菌株产四甲基吡嗪的能力，发酵6 d后测定发酵产物中四甲基吡嗪含量，结果见表2。
表2 分离菌株四甲基吡嗪产量测定结果
Table 2 Determination results of tetramethylpyrazine yield of isolated strains
由表2可知，有5 株菌发酵产物未检测出四甲基吡嗪，菌株B2四甲基吡嗪产量最高，达到了886.00 μg/g，所以选择该菌为目标菌株制作细菌麸曲，应用于后续研究。
2.2 菌株B2鉴定
2.2.1 形态观察
将菌株B2接种于年肉膏蛋白胨培养基，培养箱中37 ℃培养36 h，观察菌落形态特征。其菌落形态特征如图1。由图1可知，菌株B2的菌落呈乳白色，湿润，具有较强的黏着性，中间呈火山状凸起，边缘不规则，表面粗糙，附着能力强。
图1 菌株B2的菌落形态
Fig.1 Colony morphology of strain B2
2.2.2 分子生物学鉴定
利用通用引物对菌株B2进行PCR扩增，获得菌株B2的16S rDNA扩增序列交由上海生物工程有限公司测序，测序完成后的序列进行16S rDNA同源性分析法进行鉴定，将得到的碱基序列与Genbank数据库进行BLAST比对，选取与所述菌同源性高的相关菌的碱基序列，使用MEGA7软件的NJ方法建立菌株B2的系统发育树，结果见图2。由图2可知，菌株B2与解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）相似性达99%，再结合菌株B2菌落形态，将所筛出高产四甲基吡嗪细菌B2鉴定为解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）。
图2 菌株B2基于16S rDNA同源性分析的系统发育树
Fig.2 Phylogenetic tree of strain B2 based on 16S rDNA homology analysis
2.3 麸曲培养条件优化试验结果
2.3.1 单因素试验结果
由图3a可知，水分含量对芽孢的形成数量有重要影响，在随着麸曲水分含量的升高，麸曲芽孢数量先上升后下降，水分含量为60%时麸曲的芽孢数量最高。可能是由于水分含量过低时，会导致水分流失时间变短，底物干燥，不利于微生物的生长繁殖，形成的芽孢数量少；而过高的水分使底物结团，不利于疏松通气，导致微生物生长代谢缓慢。故最佳水分含量为60%。
由图3b可知，麸曲的芽孢数量随着接种量的升高先上升后下降，接种量为3%时芽孢数量最多。适当的接种量可以使菌株更快的生长繁殖，形成较多芽孢。接种量过大会带入较多的种子培养期的代谢产物，并使菌体前期生长过快，而使最终菌数下降，接种量过小则使菌体增殖缓慢，培养时间延长[26]。故最佳接种量为3%。
由图3c可知，随着培养时间的延长，麸曲芽孢数量先升高后降低。培养时间为40 h时，麸曲芽孢形成数量最高。培养时间过短时芽孢转化率和成熟率都低，时间过长，芽孢转化率和成熟率并无明显提高，反而会出现菌体老化，菌数下降，导致芽孢数下降[26]。故最佳培养时间为40 h。
由图3d可知，随着培养温度的升高，麸曲的芽孢数量先升高后降低，培养温度为37℃时，麸曲芽孢数量最多。可能是由于温度对细菌的生长繁殖具有重要的影响，温度上升过程中，逐渐贴近其最适的生长温度，促进细菌旺盛生长，芽孢数量增加，而随着温度继续升高，高于最适温度，其生长繁殖又受到抑制，芽孢数量随之下降。故最佳培养温度为37 ℃。
图3 麸曲培养条件优化单因素试验结果
Fig.3 Results of single factor tests for Fuqu culture conditions optimization
2.3.2 Box-Behnken试验设计与结果
根据单因素试验结果，以麸曲的水分含量（A）、接种量（B）、培养时间（C）、培养温度（D）为自变量，以麸曲的芽孢数量（Y）为响应值，进行Box-Behnken试验设计，试验设计及结果见表3，回归模型方差分析见表4。
表3 麸曲培养条件优化Box-Behnken试验设计及结果
Table 3 Design and results of Box-Behnken experiments for culture conditions optimization of Fuqu
续表
表4 回归模型方差分析
Table 4 Variance analysis of regression model
注：“*”表示对结果影响显著（P＜0.05）；“**”表示对结果影响极显著（P＜0.01）。
使用Design-Expert 11软件对表3的数据进行多元回归拟合，得到二次多元回归方程：Y=12.36-1.29A+1.1B-0.244 2C-0.025 0D-2.04AB-2.67AC-1.32AD+0.325BC-2.27BD+0.325CD-3.89A2-4.55B2-5.05C2-4.35D2。
由表4可知，P＜0.000 1，表明模型极显著，失拟项P值为0.692 7（P＞0.05），失拟项不显著，表明二次回归模型和试验结果拟合度较好，模型可用于试验拟合。决定系数R2为0.924 1，回归模型足够精确。由P值可知，交互项AC、二次项A2、B2、C2、D2对结果影响极显著（P＜0.01）；一次项A、B，交互项AB、BD对结果影响显著（P＜0.05）；一次项C、D，交互项AD、BC、CD对结果无显著影响（P＞0.05）。由F值可知，各因素对麸曲芽孢数的影响顺序为：水分含量（A）＞接种量（B）＞培养时间（C）＞培养温度（D）。
各因素间交互作用对麸曲芽孢数量的影响的响应曲面与等高线见图4。由图4可知，各因素间交互作用对麸曲芽孢数量的影响顺序为AC＞BD＞AB，与表4方差分析结果一致。
图4 各因素间交互作用对麸曲芽孢数量影响的响应曲面与等高线
Fig.4 Response surface plots and contour lines of effect of interaction between various factors on the number of Fuqu spores
根据拟合的二次多项式方程，对模型的最优解进行预测，可得当水分含量为57.7%，接种量为3.4%，培养时间为40.2 h，培养温度为36.9 ℃时，芽孢数量预测值为1.259×1010 CFU/g。考虑到实际操作的方便性，将结果修正为：水分含量58%、接种量3.4%、培养时间40 h、培养温度37 ℃。在该条件下进行3次平行试验，验证其可靠性。结果表明，在该条件制得的麸曲芽孢数平均实际值为1.21×1010 CFU/g，与预测结果1.259×1010 CFU/g误差为3.8%，该工艺优化结果理想。因此将最优培养条件确定为：水分含量58%、接种量3.4%、培养时间40 h、培养温度37 ℃。
2.4 麸曲产四甲基吡嗪性能验证
在最优培养条件下制作麸曲，并将麸曲应用于固态发酵培养基，模拟固态发酵，发酵6 d后发酵产物的中四甲基吡嗪含量为0.98 mg/g，而传统高温大曲中四甲基吡嗪的仅为0.024～0.16 μg/g，含量较低[27]，且该产量高于目前进行固态发酵产四甲基吡嗪的相关文献报道[28-29]。说明响应面优化的最佳培养条件下制得的麸曲具有良好的产四甲基吡嗪性能。
3 结论
本研究通过传统分离方法从高温大曲中筛选出一株高产四甲基吡嗪的芽孢杆菌，编号为B2，经鉴定为解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）。用该菌株制作细菌麸曲，以麸曲的芽孢数量为响应值，通过单因素试验和响应面法相结合对麸曲的培养条件进行优化，得到最佳培养条件为：水分含量58%、接种量3.4%、培养时间40 h、培养温度37℃。最佳培养条件下制得的麸曲芽孢数为1.21×1010CFU/g。将该条件下制得的麸曲应用于模拟固态发酵6 d，产物中四甲基吡嗪含量达到0.98 mg/g，表明该麸曲具有一定的产四甲基吡嗪性能。后续可将该工艺制作的麸曲应用于工厂实际生产中，以期提高白酒中四甲基吡嗪的含量。
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