康普茶（Kombucha）又称红茶菌、海宝、胃宝、醋蛾子等，最早出现于公元前220年，在当时被称为长生不老茶[1]。康普茶是一种以茶糖水为发酵底物、菌膜（主要由醋酸菌、酵母菌、乳酸菌组成）为发酵剂，自然发酵而成的饮料，酸甜可口、健康功效丰富[2]。细菌和酵母菌在发酵过程中会分解茶汤中的营养物质从而产生各种小分子代谢物，如有机酸、维生素、氨基酸、黄酮类和酚类化合物等。许多研究表明，康普茶在抗菌、抗氧化、抗癌、肝脏保护[3]等方面具有一定效果。
在国外，康普茶已实现规模化生产和商业化销售，如星巴克旗下Evolution Fresh推出了有机康普茶系列产品，MOJO和KeVita这两个主打康普茶的饮料品牌也被可口可乐和百事公司分别收购[4]。然而在我国饮料市场，康普茶的生产并未实现标准化，也未见大规模销售。
“药食同源”这个概念近年来在我国十分盛行，即一些食物作为药品也可起到一定保健作用，人们在日常生活中食用这类食品可达到防治疾病、强身健体的效果，这极大程度上推动了我国功能性食品行业的发展。康普茶作为一种富含益生菌以及多种生理活性物质的饮品，将其与药食同源物质进行融合，或可使其健康功效更上一层[5]。BATTIKH H等[6]将百里香、柠檬马鞭草、迷迭香、茴香和胡椒薄荷浸提液分别加入茶糖水中后用康普茶菌进行发酵，结果显示，发酵后抑菌活性得到显著提高；TAMER C E等[7]将椴树、柠檬香脂、鼠尾草、紫锥菊、薄荷和肉桂浸提液添加到康普茶中进行发酵，结果显示，发酵后康普茶的抗氧化能力提升，总酚的生物可利用度在胃肠道消化后显著增加。但是，由于康普茶发酵是一个需氧过程，且发酵周期长，药食同源物质中的多酚类等化合物可能被氧化[8]，且康普茶菌膜中的微生物可能会利用药食同源物质中的活性组分进行生长繁殖，导致一些营养成分的丢失。
铁皮石斛作为一种药食同源植物，具有增强免疫力、抗氧化、抗肿瘤、保肝等多种生理活性[9]；枸杞自古以来便因清肝明目、抗疲劳、滋补肝肾等功效在民间深受欢迎[10]；菊花在我国大规模种植和食用，其富含氨基酸、黄酮类、酚类、萜类、挥发油等多种活性物质[11]。本研究将康普茶发酵液分别与铁皮石斛、枸杞、菊花这三种药食同源物质的提取液进行复配，制得三种功能性康普茶饮品。对这三种康普茶进行感官评价，测定其部分理化性质，同时研究其体外抗氧化、降血糖、降血脂活性，探究它们的成分和功效，为康普茶系列饮品开发提供思路及理论支撑，以期推动康普茶作为一种功能性发酵茶饮品在国内的商业化。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
康普茶菌、白砂糖：市售；红茶：黄山王光熙松萝茶业股份公司；铁皮石斛提取物：浙江森宇有限公司；枸杞提取物、菊花提取物：陕西中鑫生物技术有限公司。
α-葡萄糖苷酶（≥700 000 U/mL）、福林酚、胃蛋白酶（≥3 000 U/mg）、胰蛋白酶（≥2 500 U/mg）、2，2'-联氮双（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二铵盐（2,2'-azino-bis（3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid），ABTS）（分析纯）、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl，DPPH）（分析纯）、没食子酸、芦丁标准品（纯度＞98%）：上海源叶生物科技有限公司；三氯乙酸（分析纯）：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；牛磺胆酸钠、甘胆酸钠、4-硝基苯基-β-D-吡喃半乳糖苷（4-nitro-phenyl-β-D-glucopyranoside，PNPG）（纯度＞97%）：上海麦克林生化科技有限公司；其他试剂均为国产分析纯。
1.2 仪器与设备
DK-S28恒温水浴锅：上海精宏实验设备有限公司；1510全波长酶标仪：美国Thermo Fisher Scientific公司；DD-5M低速离心机：湘仪离心机仪器有限公司；ST3100台式pH计：美国OHAUS公司；PAL-1糖度计：爱宕（ATAGO）科学仪器有限公司；ZHWY-2102恒温摇床：上海天呈实验仪器制造有限公司；LRH-250生化培养箱：上海一恒科技有限公司。
1.3 方法
1.3.1 不同康普茶饮品的制备流程及操作要点
操作要点：
铁皮石斛、枸杞、菊花提取液制备：将铁皮石斛、枸杞、菊花提取物分别溶于饮用水中制成质量浓度为50 g/L的提取液。
康普茶发酵液制备：在饮用水中加入100 g/L蔗糖和10 g/L红茶叶，煮沸10 min后过滤茶叶，茶汤灭菌（121 ℃、20 min）后按10%接种量接入康普茶菌，30 ℃条件下静置发酵7 d后用纱布过滤菌膜，备用。
康普茶饮品制备：将康普茶发酵液分别与铁皮石斛、枸杞、菊花提取液1∶1（V/V）混合。
1.3.2 不同康普茶饮品部分理化指标测定
pH：使用pH计测定；糖度：使用手持糖度计测定；酸度（以乙酸计）：参照GB/T12456—2021《食品中总酸的测定》[12]。
总酚含量：采用Folin-Ciocalteu法[13]测定，并稍作改进。分别配制质量浓度（x）为0、0.004 mg/mL、0.008 mg/mL、0.012 mg/mL、0.016 mg/mL、0.020 mg/mL的没食子酸溶液，取上述不同质量浓度的没食子酸溶液1 mL，然后加入0.3 mL福林酚试剂，混匀后加入1 mol/L碳酸钠溶液1.5 mL，充分混匀，75 ℃水浴避光反应10 min后迅速冷却至室温，于波长760 nm处测吸光度值（y），绘制标准曲线，得标准曲线回归方程y=0.190 4x-0.131 4（相关系数R2=0.999）。取样品溶液1 mL按上述实验步骤进行测定，将吸光度值代入标准曲线方程计算得出总酚含量，以没食子酸当量（gallic acid equivalent，GAE）表示。
总黄酮含量：采用硝酸铝比色法[14]测定，并稍作改进。分别配制质量浓度（x）为0、0.032 mg/mL、0.064 mg/mL、0.096 mg/mL、0.128 mg/mL、0.160 mg/mL、0.192 mg/mL的芦丁溶液，取上述不同质量浓度的芦丁溶液2.5 mL，然后加入5%NaNO2溶液0.25 mL，反应6 min，再加入5%Al（NO3）3溶液0.25 mL，反应6 min，最后加入2 mL NaOH溶液，反应15 min后于波长510 nm处测吸光度值（y），得标准曲线回归方程y=0.116 2x-0.066 3（相关系数R2=0.999），以芦丁当量（rutin equivalent，RE）表示。取稀释至合适倍数的样品溶液2.5 mL按上述实验步骤进行测定，将吸光度值代入标准曲线方程回归计算得出总黄酮含量。
总多糖含量：采用苯酚-硫酸法[15]测定。分别配制质量浓度（x）为0、0.02 mg/mL、0.04 mg/mL、0.06 mg/mL、0.08 mg/mL、0.10 mg/mL的葡萄糖溶液，取上述不同浓度的葡萄糖溶液1 mL，然后加入0.5 mL 5%苯酚溶液以及2.5 mL浓硫酸，沸水浴中反应20 min，迅速冷却至室温后于波长490 nm处测吸光度值（y），绘制标准曲线，得标准曲线回归方程y=0.161 5x-0.085 4（R2=0.999）。取1 mL样品，加入4倍无水乙醇，在4 ℃条件下醇沉24 h，3 500 r/min离心10 min，弃去上清液，加水溶至10 mL，得样品多糖溶液。将上述溶液稀释至合适倍数，取1 mL按上述实验步骤进行测定，将吸光度值代入标准曲线回归方程计算得出总多糖含量。
1.3.3 不同康普茶饮品的体外活性测定
（1）DPPH自由基清除率测定
参考HOU X等[16]的方法，并稍作修改。DPPH溶于无水乙醇制成0.2 mmol/L溶液，将2 mL样品与2 mL上述DPPH溶液混合均匀，避光反应30 min后于波长517 nm测定吸光度值，按下式计算DPPH自由基清除率：
式中：A0为用无水乙醇替代样品时测得的吸光度值；Ai为用样品测得的吸光度值；Aj为用无水乙醇替代DPPH溶液时测得的吸光度值。
（2）ABTS自由基清除率测定
参考GONG J等[17]的方法，并稍作修改。将7 mmol/L ABTS溶液与2.4 mmol/L过硫酸钾溶液1∶1混合，黑暗环境中培养12 h，稀释30～60倍，在波长734 nm处测吸光度值，使得吸光度值在0.7±0.1，得ABTS工作液。将1 mL样品与3 mL ABTS工作液混合均匀，避光反应10 min后于波长734 nm处测定吸光度值，按下式计算ABTS自由基清除率：
式中：A0为用去离子水替代样品时测得的吸光度值；Ai为用样品测得的吸光度值；Aj为用去离子水替代ABTS工作液时测得的吸光度值。
（3）OH自由基清除率测定
参考高妍妍等[18]的方法，并稍作修改。将9 mmol/L FeSO4储备液1 mL与0.03%（8.8 mmol/L）H2O2 1 mL混合，接着加入1 mL样品溶液，最后加入9 mmol/L乙醇-水杨酸1 mL后摇匀，37 ℃水浴加热30 min后取出，冷却后于波长510 nm处测吸光度值，按下式计算OH自由基清除率：
式中：A0为用去离子水替代样品时测得的吸光度值；Ai为用样品测得的吸光度值；Aj为用去离子水替代H2O2溶液时测得的吸光度值。
（4）还原能力测定
参考陈雅楠等[19]的方法，并稍作修改。将2 mL样品、2 mL 0.2 mol/L（pH=6.6）磷酸盐缓冲溶液和2 mL 1%铁氰化钾混匀，50 ℃水浴反应20 min，迅速冷却后加2 mL 10%三氯乙酸，3 000 r/min离心10 min，留上清液；依次取1 mL上清液和3 mL去离子水以及0.4 mL 0.1%FeCl3溶液加入试管中混匀，静置10 min后于波长700 nm处测定吸光度值，按下式计算样品还原能力：
还原能力=A-A0
式中：A0为用去离子水替代样品时测得的吸光度值；A为用样品测得的吸光度值。
（5）降血糖能力测定
参考孟洋等[20]的方法，并稍作修改。用pH=6.9的磷酸缓冲液配制1 U/mL α-葡萄糖苷酶溶液，取50 μL样品液与50 μL α-葡萄糖苷酶溶液充分混匀，在37 ℃恒温培养箱中保持10 min。100 μL 5 mmol/L PNPG加入混合液中，混匀，置于37 ℃恒温培养箱中保持30 min，之后用100 μL 1 mol/L的Na2CO3终止酶反应，于波长405 nm测定吸光度值。样品对α-葡萄糖苷酶的抑制率由下式计算得出：
式中：A0为用磷酸缓冲液替代样品时测得的吸光度值；Ai为用样品测得的吸光度值；Aj为用磷酸缓冲液替代α-葡萄糖苷酶溶液时测得的吸光度值。
（6）降血脂能力测定
参考唐茹萌等[21]的方法，并稍作修改。取1 mL样品，加入1 mL模拟胃液，涡旋混匀，37 ℃恒温振荡消化1 h，取出后加入0.1 mol/L NaOH溶液，调pH至6.3，再加入4 mL模拟肠液，37 ℃恒温振荡消化1 h。每支试管分别加入4 mL配制好的1 mmol/L胆酸盐溶液，37 ℃水浴反应1 h后，4 000 r/min离心10 min，取2.5 mL上清液，加入3倍体积的60%的硫酸溶液，混匀后70 ℃水浴20 min，取出立即冰浴5 min，于波长387 nm处测定吸光度值。胆酸盐结合率按下式计算：
式中：A0为用磷酸缓冲液替代样品时测得的吸光度值；Ai为用样品测得的吸光度值。
1.3.4 不同康普茶饮品的感官评定
由10名成员组成的感官评价小组（来自浙江大学食品微生物细胞工程与安全实验室），参照杨婧娟等[22]的评分标准，分别从色泽、气味、滋味和组织状态四个方面对3种康普茶饮品进行评分，满分为100分，感官评分标准见表1。
表1 康普茶饮品感官评分标准
Table 1 Sensory evaluation standards of Kombucha tea beverage
续表
1.3.5 数据处理
每组实验均进行3次平行实验，结果以“平均值±标准差”表示。实验数据使用Excel 2019汇总、SPSS 21进行统计分析及显著性检验（P＜0.05），使用Origin 2018软件作图。
2 结果与分析
2.1 不同康普茶饮品的理化指标及感官评分
三种康普茶饮品部分理化指标及感官评分见表2。
由表2可以看出，三种康普茶饮品都呈酸性，这是由于菌膜中的优势微生物之一—醋酸菌的存在[23]，它会利用茶汤中的各种碳源以及营养组分生长从而产生大量有机酸，使得发酵体系最终呈酸性。康普茶的发酵是一个动态过程，发酵液中各类化学成分的具体含量与发酵时间、茶叶品种、糖添加量、发酵剂、发酵底物等因素相关[24]。所以对于添加不同植物提取液的康普茶，其活性物质含量存在差异。其中，铁皮石斛康普茶的总多糖含量显著高于枸杞康普茶和菊花康普茶（P＜0.05），因为多糖是石斛最主要的生物活性物质[25]；而菊花康普茶和枸杞康普茶中的酚类和黄酮类物质含量显著高于铁皮石斛康普茶（P＜0.05）[11，26]。
表2 三种康普茶饮品部分理化指标
Table 2 Some physicochemical indexes of three kinds of Kombucha tea beverage
注：不同小写字母标注表示差异显著（P＜0.05）。下同。
感官评价结果显示，铁皮石斛康普茶的感官评分明显高于枸杞康普茶和菊花康普茶，说明其作为新型功能性康普茶饮品是具有一定市场前景的，其pH、糖度、酸度分别为3.34、6.67°Bx、1.69 g/L，总酚、总黄酮、总多糖含量分别为145.76 mg GAE/mL、11.34 mg RE/mL、1 622.13 mg/mL。
2.2 不同康普茶饮品的体外活性
2.2.1 体外抗氧化活性
对不同康普茶饮品的ABTS、DPPH、羟基自由基的清除能力及对铁离子的还原能力进行比较，结果见图1。
图1 不同康普茶饮品ABTS自由基（a）、DPPH自由基（b）、羟基自由基（c）的清除能力及铁离子的还原能力（d）比较
Fig.1 Comparison of scavenging ability of ABTS (a),DPPH (b),OH (c) radicals and reducing capacity of iron ions (d) of different Kombucha tea beverage
通常用自由基清除法来评价物质的体外抗氧化能力，自由基清除能力越强，该物质的体外抗氧化能力就越好。从图1（a）～图1（c）可以看出，不同类型康普茶对于ABTS自由基和DPPH自由基都具有很好的清除能力，且清除能力均高于未添加提取液的康普茶，说明在康普茶中添加植物提取液对提高康普茶抗氧化能力是具有增益效果的。由于不同提取液的成分组成、活性物质具体结构以及抗氧化机制存在差异[27]，可能导致添加不同提取液的康普茶对于羟基自由基的清除效果稍显逊色。抗氧化剂对于不同类型自由基的清除活性可能存在较大差异，如酚类化合物能够很好地清除单线态氧，但其清除过氧自由基的能力较弱[28]。
所有康普茶中，铁皮石斛康普茶的体外抗氧化活性最佳，其对ABTS、DPPH、羟基自由基的清除率分别为97.85%、95.26%、75.06%，均显著高于未添加提取液的康普茶（P＜0.05）。添加不同提取液后康普茶体外抗氧化活性增加主要归于其中活性物质的含量，史蓉等[29]研究发现枸杞提取液具有较强的抗氧化能力，王丽霞等[30]通过抗氧化实验证明铁皮石斛多糖对不同自由基均具有一定的清除能力，严淘等[31]研究发现菊花提取物存在抗氧化活性是由于某种或数种特定的成分共存互作达到的效果。
测定物质的还原能力也是评价其体外抗氧化活性的方法之一，具有抗氧化活性的物质亦即还原剂，抗氧化剂的还原能力越强，其抗氧化活性也越好[32]。从图1（d）可知，枸杞康普茶的还原能力最强为0.959，显著高于其他两种康普茶及未添加提取液的康普茶（P＜0.05），且三种康普茶的还原能力皆高于未添加提取液的康普茶，说明添加植物提取液后，康普茶的抗氧化活性得到增强。
2.2.2 体外降血糖活性
α-葡萄糖苷酶可将食物中的淀粉、糖原等水解成葡萄糖，葡萄糖会被输送到血液中，从而导致血糖升高[33]，在饮食中引入α-葡萄糖苷酶抑制剂可以减缓餐后血糖水平的升高。不同康普茶饮品对α-葡萄糖苷酶的抑制率结果见图2。从图2可以看出，康普茶发酵液本身便具有一定体外降血糖活性，这与谭培科等[34]得出的实验结论一致。添加植物提取液的三种康普茶饮品也都具有良好的体外降血糖活性，抑制率都在90%以上，其中，铁皮石斛康普茶的抑制率最高，为98.17%，显著高于未添加提取液的康普茶（P＜0.05）。孟洋等[20]通过实验证明铁皮石斛花茶和菊花花茶对α-葡萄糖苷酶都有较好的抑制作用，WOJDYŁO A等[35]研究发现，枸杞可以抑制α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶活性，说明在康普茶中加入上述植物提取液对提高体外降血糖活性具有积极作用。
图2 不同康普茶饮品对α-葡萄糖苷酶活性抑制率比较
Fig.2 Comparison of α-glucosidase activity inhibition rate of different Kombucha tea
2.2.3 体外降血脂活性
人体肝脏中的胆汁酸通常不以游离形式而多以胆酸盐（主要是甘氨酸胆酸钠和牛磺酸胆酸钠）的形式稳定存在[36]，对脂肪和胆固醇的代谢及脂溶性维生素的消化吸收起重要作用[21]。体外降血脂实验的原理是通过体外模拟人体内胃肠道环境，根据待测物与胆酸盐结合量的多少评估其降血脂能力。不同康普茶饮品对甘氨胆酸钠、牛磺胆酸钠的结合率比较见图3。从图3可以得知，不同康普茶饮品都具有一定结合胆酸盐的能力，且结合率较为接近，其中铁皮石斛康普茶对甘氨胆酸钠和牛磺胆酸钠的结合率最高，分别为59.23%和58.15%，这可能是由于铁皮石斛多糖的存在，陈静慧[37]通过胰脂肪酶活性及胆固醇脂酶活性抑制实验以及动物实验证明铁皮石斛多糖具有较好的降血脂作用。此外，张克勤等[38]研究发现，枸杞汁可抑制高脂细胞增殖，菊花中的黄酮类物质对降血脂具有一定作用[39]，故而枸杞康普茶和菊花康普茶的降血脂活性略高于普通康普茶。
图3 不同康普茶饮品对甘氨胆酸钠（a）及牛磺胆酸钠（b）的结合率比较
Fig.3 Comparison of binding rates of sodium glycyrcholate (a) and sodium taurocholate (b) of different Kombucha tea beverage
3 结论
本实验将康普茶发酵液分别与铁皮石斛、枸杞、菊花提取液进行复配，得到了三种功能性饮品，并测定了它们的理化性质以及体外活性。感官评价结果显示，三种康普茶的感官评分均在70分以上，作为一种功能性饮品可以被大众所接受，其中铁皮石斛康普茶接受度最高，其pH、糖度、酸度分别为3.34、6.67°Bx、1.69 g/L，总酚、总黄酮、总多糖含量分别为145.76 mg GAE/mL、11.34 mg RE/mL、1 622.13 mg/mL。三种康普茶饮品的体外抗氧化活性以及降血糖、降血脂活性均高于未与提取液复配的康普茶，其中铁皮石斛康普茶的体外活性总体表现最佳，其ABTS自由基、DPPH自由基、羟基自由基的清除率分别为97.85%、95.26%、75.06%，铁离子还原能力测定的吸光度值为0.784，对α-葡萄糖苷酶活性的抑制率为98.17%，对甘氨胆酸钠、牛磺胆酸钠的结合率分别为59.23%、58.15%。这可能是由于康普茶发酵液与各类植物提取液中皆含有丰富活性物质，本身便具有功能活性，复配之后，各组分间可能存在一定协同作用，产生了增益效果，后续可通过体内实验进一步探究其抗氧化、降血糖效果及作用机制。本研究制备得到的康普茶饮品具有良好风味及功能活性，为康普茶系列产品开发及其工业化生产提供了思路，有助于推进康普茶在我国的商业化。
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