酒用酵母是在酒类酿造过程中产生乙醇以及风味物质等的真核微生物，具有种类多等特点。酒用酵母不能利用多糖，需要淀粉酶和糖化酶发挥作用，将淀粉、纤维素等多糖先转化为葡萄糖，再通过转化糖酵解途径产生乙醇[1]。在酿造过程中多种酵母菌共存并相互影响，尽管其种类和数量发生变化，但它们产酒和生香的代谢活动几乎贯穿整个过程，很大程度上决定了发酵的速度、酒的风味品质[2]。酵母产生酶的种类、酶的活性和发酵产物不同，对发酵的生态环境也有不同的影响。与葡萄酒发酵相比，白酒固态发酵周期长达28 d，酵母群落结构更加复杂多样[3]。工业上最常用的酵母是酵母属（Saccharomyces）和假丝酵母属（Candida），前者可用于生产乙醇、啤酒、白酒、葡萄酒和各种果酒，后者中的产朊假丝酵母（Candida utilis）的蛋白质和维生素含量均比较高，可用于生产供人畜食用的蛋白质。
部分酿造酒中天然酵母会给酒液带来不愉悦的风味，甚至可能使发酵进程脱离掌控。研究者通常根据需求对菌种进行育种，如在清香型白酒中主要香气成分是乙酸乙酯和乳酸乙酯，为增强白酒风味，选育高产乙酸乙酯的酵母菌，提高乙酸乙酯含量，对改善基酒品质有重要的作用[4]。在葡萄酒中，乙醇含量过高会影响葡萄酒的风味特征以及人类的身体健康，而选育具有降低乙醇能力的本土非酿酒酵母成为解决葡萄酒乙醇含量过高的最简单和经济的方法[5]。总之，为了使酒风味、酒精度以及口感等朝着好的方向发展，会使用物理、化学、基因工程等育种手段增强酵母某个方面的功能，凭借可靠的生物技术手段对生物或生物组分的遗传物质进行目的性地改造，从而实现优化生物的遗传性状和改善新品种的质量的目的。目前基因工程与代谢工程的崛起，为酒用酵母育种提供了新的思路与方法。
为了提高酒的品质，本文总结了酒类发酵中常见酵母菌的种类，综述了采用自然筛选、诱变育种、杂交育种、原生质体融合、基因工程和代谢工程技术对酒用酵母进行育种的研究现状，以期为酿酒领域的研究提供思路与解决办法，为酒类产品的工业化生产提供参考依据。
酒用酵母是具有发酵产酒能力的酿酒活性酵母，其繁殖的方法为出芽生殖。酒类发酵中常见的酵母菌有酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）、异常汉逊酵母（Hansenula anomala）、粟酒裂殖酵母（Schizosoccyoromyces pombe）、球拟酵母（Torulopsis globosa）、胶红酵母（Rhodotorula mucilaginosa）、假丝酵母（Candida）、库德里阿兹威氏毕赤酵母（Pichia kudriavzevii）等。
酿酒酵母具有高发酵能力和对恶劣条件的良好耐受性，通常被认为是酿酒过程中将糖转化为乙醇和其他代谢物的重要物质[6]，被应用于各种酒类酿造中。ZHAO Y Z等[7]对171株酿酒酵母进行筛选，获得两株低产高级醇和高产乙酸酯的酿酒酵母菌株，其中酿酒酵母jiangnan1#菌株产生的尿素和氨基甲酸乙酯降解率分别为13.89%和45.51%，表明jiangnan1#能更好突出花的风味，提高饮用安全性和舒适度。异常汉逊酵母具有高产乙酸乙酯的能力，且在较高温度下具有较强的发酵力和酯化力，是酿造工业中的主要生香来源[8]，被应用于白酒、葡萄酒、蜂蜜酒等。曾朝珍等[9-10]研究发现，异常汉逊酵母与酿酒酵母的协同作用下有效促进了更多酯类、醇类物质的合成，降低了脂肪酸的含量，增加了香气成分的种类，发酵的苹果白兰地风味物质最复杂，改善了苹果白兰地的品质及风味。粟酒裂殖酵母能将苹果酸转化为乙醇和二氧化碳，使葡萄酒口感柔和，改善颜色稳定性，提高安全性[11-12]。高娉娉等[13]研究发现，粟酒裂殖酵母和酿酒酵母顺序接种能够更好地增加黑比诺干红葡萄酒的醇类、酯类和萜烯类物质含量及种类，降低苹果酸含量，能够提升葡萄酒感官品质。球拟酵母是白酒生产应用中最广泛的生香酵母之一，具有良好的产酯能力。在白酒酿造过程中，球拟酵母对高产酯酿酒酵母产酯能力具有强化作用[14]，供氧不足时，其对酒精发酵影响最小，对产酯影响最大[15]。胶红酵母含有较高的糖苷酶，常作为增香酵母应用于果酒发酵。在干白葡萄酒中，使用胶红酵母与酿酒酵母混合接种发酵，提高了品种和发酵香气化合物的含量，胶红酵母增强了花香、果香等宜人的香气特性，而在较高的接种量下，也能使葡萄酒香气产生轻微的动物味[16]。假丝酵母为好氧型酵母，发酵初期可大量存活，发酵能力和耐酒精能力较强，显著特点是高产甘油[17]，主要应用于白酒和果酒发酵。XU A H等[18]研究发现，在南丰蜜桔酒中使用乙醇假丝酵母（Candida ethanolica）纯发酵，其多酚含量高达138.78 mg/L，若使用酿酒酵母与乙醇假丝酵母混合发酵，多酚含量高达140.21 mg/L。库德里阿兹威氏毕赤酵母具有良好的产乙酸乙酯的能力[19]，主要应用于白酒酿造。章钰浛等[20]对从堆积后的酱香酒醅中分离出的库德里阿兹威氏毕赤酵母进行研究发现，其为酱香型白酒中一株耐高温的产香酵母，具有较强的产醇能力，主要产生以异戊醇为主的醇类物质，还能产生较多的乙基酯类物质。
酒类酿造是一个复杂的微生物反应过程，不同的酒用酵母特性不同，在发酵过程所发挥的作用也不同，但根据具体酒类产品的需求不同，可通过育种技术进行针对性的增强菌株某方面的功能，如发酵力、产香味物质、感官品质、耐受性等。目前酒用酵母育种技术主要有自然筛选、诱变育种、杂交育种、原生质体融合、基因工程、代谢工程。
自然筛选法是由自然界多种因素、低剂量的诱变效应引起的微生物突变[21]，该法筛选出的酵母菌株经过环境驯化，能够更好的适应发酵条件，能够发挥酵母菌优良的特性[22]。PRENDES L P等[23]从圣拉斐尔产区的酿酒葡萄表皮中分离附生酵母并进行分子鉴定，筛选出能够降低曲霉生长和噻唑酸产量的拮抗酵母。COSTANTINI A等[24]从意大利葡萄园中分离、筛选、鉴定出奇异酵母（Saccharomyces paradoxus）和酿酒酵母，通过定量挥发性化合物和感官分析测试发现奇异酵母甘油产量高，苹果酸降解能力强，乙醇产量低，挥发酸度低，而酿酒酵母赋予葡萄酒宜人的玫瑰气味。蒋海娇等[25]从酒曲中选育出3株耐高渗酵母，其均可耐受体积分数14%的乙醇，耐受糖550 g/L，该研究对提高冰酒风味有重要意义。自然筛选法虽然简单稳定性好、绿色环保，但突变效率低、试验周期长、过程复杂、耗时长、工作量巨大、盲目性高。
诱变育种是通过物理、化学诱变剂，人为地对出发菌株进行诱变处理，然后运用合理的筛选程序及适当地筛选方法，将符合要求的优良变异菌株筛选出来[26]。诱变育种能使酒用酵母高产醇类和酯类、提高产品质量、简化生产工艺、产生新的代谢产物、为遗传学及其他研究提供材料。此育种方式方便快捷、成本较低及成功率较高，但有益突变频率较低，变异的方向和性质难以控制。
2.2.1 紫外诱变
紫外线（ultraviolet，UV）辐射可导致化学修饰、脱氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）裂解、有丝分裂交叉和环丁烯嘧啶二聚体的形成，紫外诱变是一种方便、快捷、应用范围广的诱变方式，具有突变率高、不易恢复的特点。李颖[27]以一株酿酒酵母为出发菌，经紫外诱变及硒盐胁迫筛选得到的突变株，在混合硒源条件下制备高生物量的富硒酵母，结果表明，突变菌株具有较高的富硒水平，其硒含量可达3 129.40 μg/g，是出发菌株的2倍。陈忠军等[28]通过紫外诱变法选育出耐高糖且具有高发酵度的酵母菌株，发现诱变后菌株的耐糖特性和产酒精特性均有提高，且菌株发酵度比工业菌株提高了6%，酒精度提高了1.4%vol。SHIGEMATSU T等[29]对米酒中的酿酒酵母进行紫外诱变育种，得到一株压敏突变株，该突变株能产生高水平的己酸乙酯，且不产生尿素，适合酿造高质量的清酒。
2.2.2 常压室温等离子体诱变
常压室温等离子体（atmospheric and room temperature plasma，ARTP）诱变育种是在室温常压条件下，用高纯氦气（He）产生的大量等离子体流，作用于微生物细胞，使其细胞膜的结构及通透性改变，并引起遗传物质DNA损伤而产生大量突变株，从中筛选获得目标菌株的菌种育种方法。该方法与传统诱变方法相比，能够有效造成DNA多样性的损伤，突变率高，并易获得遗传稳定性良好的突变株；与分子操作手段相比，具有操作简便、成本低、无有毒有害物质参与诱变过程等优点[30]。张立钊等[30]将分离得到的野生菌株异常威克汉姆酵母通过ARTP技术进行诱变处理120 s后，突变菌株发酵60 h后，乙醇含量为20.78 g/L，较出发菌株提高了42.59%，木糖利用率为84.61%，葡萄糖利用率为81.05%。张雪等[31]从菠萝蜜果浆自然发酵液中分离获得1株产酯酶酿酒酵母，利用ARTP技术对其进行诱变育种180 s后，发现突变菌株酯酶活力高于出发菌株，且酒样总挥发性物质和酯类物质分别提高34.28%、60.67%，明显增强了菠萝蜜果酒的香气质量。杨耀[32]利用ARTP技术对酿酒酵母进行诱变育种85 s，以谷胱甘肽的产量为筛选指标，最终获得一株高产谷胱甘肽酿酒酵母，其胞内谷胱甘肽产量提高了32.74%。
2.2.3 复合诱变
复合诱变是两种或两种以上诱变剂同时处理、不同的诱变剂交替处理、同一诱变剂连续处理以及紫外线与光复活交替处理。在进行复合诱变时需要注意：不是任何两种诱变剂复合处理都能提高诱变效果；诱变处理的顺序有可能会影响诱变效果；诱变力强、广谱的诱变剂可采用同一诱变剂连续处理；作用方式单一的诱变剂如羟胺、碱基类似物等，连续处理会导致回复突变。史雁飞[4]通过紫外微波复合诱变（紫外线照射150 s、微波照射35 s）选育高产乙酸乙酯的酿酒酵母和异常威克汉逊酵母，发现使用突变株进行酿造，酒样的酯含量高达3.4 g/L，比对照组提高了1倍左右。PATTANAKITTIVORAKUL S等[33]采用UV和甲基磺酸乙酯诱变技术对一株能产生高浓度乙醇的耐热酵母进行改良，结果表明，突变体在40 ℃条件下产生乙醇能力以及对高糖浓度、糠醛、羟甲基糠醛和醋酸的耐受性均优于野生型。YANG Y J等[34]采用乙醇驯化、紫外诱变和原生质体融合技术对酿酒酵母进行复合诱变，结果表明，诱变后酿酒酵母酿造黄酒的风味化合物总含量升高，具有更好的2-苯乙醇、短链和长链脂肪酸乙酯的产生能力。XU X等[35]采用ARTP与2,4-二硝基苯肼对卡尔斯博酵母（Saccha romyces pastorianus）进行复合诱变，使用突变株酿造的啤酒乙醛产量降低了53.7%，啤酒的耐腐值提高了99.8%，5-羟甲基糠醛含量低于亲本，使啤酒的稳定性提高。
杂交育种是扩大遗传多样性的一种有效途径。通过有性杂交，可以从多个亲本菌株中构建具有优良特性的新酵母菌株。杂交改变了生物的遗传组成，并且不产生新基因。杂交育种不仅可以使两个或多个优良性状结合在一起，而且解决了菌株在经过长期诱变后导致代谢产物无法持续增长的难题[26]。SANCHEZ R G等[36]将拉格酵母菌与艾尔酵母菌株杂交，提高了拉格酵母菌株的抗逆性。杨贵恒[37]利用杂交育种技术培育耐高酒精度、高渗透压且发酵性能优良的酵母菌株，选出适用于酿造帝国世涛特种啤酒的酵母菌。从帕洛米诺菲诺白葡萄品种中分离出来的酿酒酵母与从马尔瓦尔白葡萄品种中分离出来的酵母亲本菌株杂交，获得了3种硫化氢产量较低的进化变体，减少了硫化氢产生，且进化后的菌株与亲本菌株非常相似，不仅在工业水平上减少了感官缺陷，还在葡萄酒中产生更多的花卉味和水果味[38]。
原生质体融合是一项重要的基因重组育种技术，是将双亲细胞脱去细胞壁获得原生质体，采用物理或化学方法诱导原生质体融合，使原生质体进行物质与信息交换，筛选出同时具有双亲优良性状的融合子[26]。由于微生物形态的不同，原生质体融合技术的操作也不尽相同，但大体的四个步骤是固定的，分别是原生质体的制备、再生、融合和筛选[26]。微生物原生质体融合育种技术不仅解决了远缘杂交的难题，使得跨界融合理论具备理论支撑，还在实际生产过程中扮演着重要角色，具有重要的理论研究和实际生产意义[39]。原生质体融合育种与传统育种方法相比具有效率高、速度快、操作简便和优良性状提升幅度大等优点，在酵母菌育种中的应用与日俱增。WANG Z L等[40]以酿酒酵母和乙醇假丝酵母为亲本，通过原生质体融合育种，得到的稳定融合菌株制成的苹果酒的酒精含量（2.0%～5.2%）远低于亲代品系，其中重组融合酵母在生产高质量、低酒精的苹果酒方面具有巨大的潜力。XIN Y等[41]在啤酒发酵中，通过原生质体融合育种技术，对酿酒酵母菌株Q、L的单倍体进行研究，获得了耐受体积分数14%乙醇的融合子Q/L-f2。徐奎栋[42]利用原生质体融合进行低醇增香型酵母选育，通过构建新型杂交酵母菌株来达到降低酒中乙醇含量、提高酒中的香气和风味。
基因工程育种是一种快速直接的定向育种技术，通过载体将外源目的基因导入至受体细胞内，以实现外源目的基因在受体细胞内顺利表达并产生所需代谢产物的效果[43]。基因工程育种主要包括基因重组、成簇规律间隔的短回文重复序列相关蛋白（clustered regularly interspaced short palindromic repeats/associated protein，CRISPR/Cas9）基因编辑技术等，和其他育种方法相比具有定向性，目的明确，甚至可以突破种属的限制，但是人工导入外源基因对酵母菌的安全性影响没有办法确认，且微生物细胞结构及其代谢等均非常复杂，所以进行理性设计通常要求结合设计-构建-测试-学习（Design-Build-Test-Learn，DBTL）循环的方法，这样就会出现周期长、设备比较昂贵、技术难度高和生物安全性等问题，难以在育种领域广泛应用。
2.5.1 基因重组
基因重组指在生物体进行有性生殖的过程中，通过控制不同性状的基因重新组合来产生大量的变异类型，但只产生新的基因型，不产生新的基因，是杂交育种的理论基础[44]，具有低成本、易于操作、高突变诱导率、生产周期短、转化效率高、环境友好等优点。WANG Y P等[45]利用基因重组技术构建了8种氨基酸代谢基因缺失重组菌株，发现一株重组菌株的总乙醇体积分数比亲本降低27.31%，且另一株重组菌株中高级醇的总含量达1 493.96 mg/L，表明氨基酸代谢在酿酒酵母对高级醇的代谢中起着重要作用。葡萄酒存在香气不明显、酒质差、勾兑技术水平低等问题，导致低醇葡萄酒产业发展缓慢，WANG X D等[46]构建了一株酿酒酵母W303-1A的重组菌株W303-EAT，重组菌株发酵后的米酒、蓝莓酒和玫瑰酒的乙酸乙酯产量均高于亲本菌株，异丁醇、异戊醇、酚的含量均低于亲本菌株，说明重组菌株具有降低较高酒精含量的作用。LI W等[47]对酿酒酵母进行基因重组，发现一株突变株的乙酸酯产量是原菌株的43.16倍，具有不同乙酸酯生产能力和较高酒精产量的突变体具有开发和应用的潜力。
2.5.2 CRISPR/Cas9基因编辑技术
迄今为止，CRISPR/Cas9系统是当前使用最为频繁的基因编辑手段，由CRISPR与CRISPR相关蛋白所构成，在Cas9蛋白与小向导核糖核酸（small guide ribonucleic acid，sgRNA）的共同作用下编辑靶基因[48]。CRISPR/Cas9系统因其低成本、易于操作和高突变诱导率等优势，成为一种用于植物遗传改良和育种研究的有效分子操纵技术手段，具有广阔的应用前景[49]。在葡萄酒中常出现臭鸡蛋味，而该味道来源于硫化氢，WALKER M E等[50]的研究结果表明，酵母代谢响应与氮和硫的可用性直接相关，为限制硫化氢产生，通过CRISPR/Cas9基因编辑技术将高亲和力硫酸盐转运蛋白中的基因引入酵母菌中，结果表明，目的菌株可以减少硫化氢的积累。梁强[51]以红法夫酵母（Phaffia rhodozyma）作为出发菌株，比较分析已有的野生型和高产虾青素的红法夫酵母转录组数据的基础上，选取可能影响虾青素合成的基因，应用CRISPER/Cas9基因编辑技术，构建出红法夫酵母菌的突变菌株。黄玉堃等[52]对热带假丝酵母进行了一系列基因的敲除与整合，获得了一株D-乳酸产量为6.10 g/L的菌株。
代谢工程建立在基因重组的基础上，即借助基因工程使细胞代谢方式发生变化，从而革新产物的形成和细胞的性能[53]。KAWAI K等[54]在实验室适应性进化实验的基础上，利用甘油培养序列转移和RNA测序对进化后的细胞进行转录组分析，从而确定了可以通过过表达HAP4或干扰RIM15提高酿酒酵母甘油同化能力。黄佳俊等[55]将4cl和rs整合构建了表达白藜芦醇的整合型酵母表达载体，工程菌在后续验证实验中能够稳定表达白藜芦醇。刘军权[56]利用δ位点随机整合的方法将黑曲霉的木糖利用基因整合在酿酒酵母细胞内，并成功组建了木糖利用型酵母菌，该菌株以木糖作为单一碳源，能够在3 d内利用40 g/L的木糖并产生10 g/L的乙醇。朱灵桓[57]在酿酒酵母中构建以葡萄糖为前体的芳香醇合成途径，所得酿酒酵母合成β-苯乙醇的产量提高至641 mg/L，再利用异源酶的表达在酿酒酵母中搭建β-苯乙醇的高效转化途径，以6.7 g/L的L-苯丙氨酸为前体进行发酵，β-苯乙醇的产量提高至3.59 g/L。
酒用酵母的研究多集中于酿酒酵母，因其具有良好的耐受性和高发酵能力，成为各个酒种的发酵首选。自然筛选技术具有绿色环保、稳定性高，但由于其操作复杂且盲目性高导致效率低；诱变技术具有方便快捷等特点，其中ATRP技术和复合诱变技术使用频率更高，ARTP诱变是一种新型物理诱变技术，由于其诱变效果十分显著，受到广大研究者的喜爱，复合诱变的方式多种多样，研究者们通常根据自己的需求将不同的育种技术相结合；杂交技术在开发和改进酿酒酵母研究领域中被认为是有潜力的育种技术，其适用范围广泛，但存在过程较复杂且耗时长等缺点；原生质体融合技术具有遗传信息量大，重组频率高、操作简便等特点，但存在技术、安全问题；基因工程和代谢工程目前是育种领域研究的新热点，具有方向性强、针对性强、安全性高、转化效率高等许多优点，但也存在试验周期长、技术难度高等缺点。总体来说，利用基因工程、代谢工程等生物技术对菌株进行理性设计成为育种领域的新热点，但是由于目前多数菌种缺乏清晰的遗传背景和明确的代谢机制，因此当下使用最多的育种方法仍然是诱变育种，该研究可为酒用酵母育种领域提供借鉴和参考。
随着科技的发展，组学研究不断完善，酒用酵母育种技术的发展将朝着基因工程和代谢工程方向发展。随着育种技术的发展，酿酒酵母相关研究会更深入，且关于非酿酒酵母的研究将与日俱增，应用面更广阔，不同菌种间的组合方法变得多样化，相信各种酒类产品的风味会越来越丰富。
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Research progress on application of breeding technology in wine yeasts