浓香型白酒是以粮谷为原料，采用浓香大曲为糖化发酵剂，经泥窖固态发酵、蒸馏，陈酿、勾调而成的，不添加食用酒精及非自身发酵产生的呈香呈味物质，而基酒是酒醅经蒸馏后得到的未经过贮藏和勾兑的白酒，其酒精度一般在60%vol左右[1]。白酒中目前已知的风味成分有1 000多种，含量极低，仅占总质量的1%～2%，但决定着白酒香型、风格及品质[2-3]。
随着各种检测技术不断发展成熟，白酒的检测分析已不再限制对其风味成分的定性定量研究，如何将各种检测技术与有效的数据处理和分析方法相结合，构建精确度高、成熟的模型，便于分析，达到快速鉴定是目前面临的问题。目前已有研究表明，运用各种光谱技术如三维荧光光谱（three dimension excitation emission matrix fluorescence spec troscopy，3D-EEM）、近红外（near-infrared，NIR）光谱、中红外光谱、经典直角荧光光谱等，通过不同算法手段对不同等级、不同贮藏年限以及不同品种的酒类光谱图进行差异性分析，然后结合化学计量学方法，如层次聚类分析（hierarchical cluster analysis，HCA）、主成分分析（principal components analysis，PCA）、平行因子分析（parallel factor analysis，PARAFAC）、偏最小二乘法-判别分析（partial least squares-discriminant analysis，PLS-DA）等，可以对不同酒样进行有效区分[4-7]。
近年来，近红外（NIR）技术得到快速发展广泛应用于各个行业的分析检测，如烟草行业、油脂行业、医药行业、饲料行业等，特别是在酒类分析应用中发展迅速。ANJOS O等[8]将带有氢火焰离子化检测器（flame ionization detector，FID）的气相色谱（gas chromatography，GC）与近红外光谱技术结合研究葡萄酒陈酿技术，成功运用近红外识别葡萄酒陈酿过程中使用的不同技术和木材容器。传统的白酒分析方法中，如指示剂法、酒精计法、气相色谱法、液相色谱法等存在步骤繁琐、样品预处理费时、费力、人的感官评定与化学值误差大等缺点，不能满足大批量样品在线快速检测的要求。ZHONG J等[9]应用NIR结合带有集成移动窗口（moving window，MW）波段筛选的偏最小二乘法-判别分析（PLS-DA）建立识别模型用于大规模鉴别品牌白酒和山寨酒。YANG B等[10]将近红外与偏最小二乘法-判别分析结合应用于识别不同品牌白酒。HAN S H等[11]研究了傅里叶变换近红外光谱法快速测定白酒中戊酸乙酯的可行性。可见，将近红外光谱技术与传统检测方法结合建立分析模型，可达到对白酒快速准确检测分析的目的。
目前，应用近红外光谱对白酒建立定性分析模型大多是针对不同品牌和不同等级白酒，及针对白酒中某些理化指标[12]、酯类、醇类以及酸类等常见物质建立定量模型。然而，有关运用近红外光谱对不同产地浓香型基酒建立定性模型以及对造成近红外光谱差异性的关键指标尚未有报道。故本研究拟采用NIR建立合格性测试方法对来自四川不同区域的浓香型白酒基酒建立分类模型，进一步结合GC-FID检测不同产区浓香型基酒共有挥发性风味成分，并利用HCA、PCA等化学计量学分析手段，评价通过NIR对不同产区浓香型基酒达到快速分类和鉴别的可行性与有效性，以及初步探索造成不同产区浓香型基酒光谱差异性的关键挥发性成分，以期为近红外光谱实现浓香型基酒快速分类和鉴别提供科学参考。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
1.1.1 原料
供试酒样为四川泸州、宜宾和成都三个产区产出的浓香型白酒基酒，共52个酒样，包括宜宾产区酒样15个（编号为Y1～Y15）；泸州产区酒样19个（编号为L1～L19）；成都产区酒样12个（编号为C1～C8、C11、C12、C14、C15）；验证酒样6个（编号为L20～L22来自泸州产区，编号为C9～C13来自成都产区），储藏年限均达4年。
1.1.2 试剂
挥发性风味物质标准品（均为色谱纯）：上海麦克林生化科技有限公司；叔戊醇、2-乙基丁酸、乙酸正戊酯（纯度均＞98%）：北京坛墨质检标准物质中心；无水乙醇（色谱纯）：成都市科隆化学品有限公司；超纯水符合国标GB/T 6682—2016《分析实验室用水规格和试验方法》规定一级水要求。
1.2 仪器与设备
G3000光栅型近红外光谱分析仪（配有积分球漫反射系统，内置PTFE参比模块和聚苯乙烯波长标准片，光谱范围为11 000～4 000 cm-1，可采集浓香型基酒样品在近红外光谱整个区域的光谱信息）：四川威斯派克科技有限公司；7890B气相色谱仪（配氢火焰离子化检测器，ALS自动进样器）：美国安捷伦科技有限公司；MIX-2500涡轮振荡仪：杭州佑宁仪器有限公司；UPT-I-10T超纯水系统：四川优普超纯科技有限公司；AX224ZH电子天平：常州奥斯仪器有限公司；KS-500VDV/2液晶超声波清洗器：昆山洁丽美超声仪器有限公司。
1.3 实验方法
1.3.1 挥发性风味成分测定
挥发性风味成分测定采用GC-FID法，其色谱条件如下：CP-Wax 57 CB色谱柱（50 m×0.25 mm×0.2 μm）；升温程序为初始温度为35 ℃，保持2 min，以3 ℃/min的速率升高至70 ℃；以1.5 ℃/min速率升高至80 ℃；以2 ℃/min速率升高至105 ℃；以20 ℃/min速率升高至210 ℃，保持12 min。载气为氮气（N2）（纯度＞99.999%），柱流量1.0 mL/min；进样口温度250 ℃；FID温度250 ℃；进样量1 μL，分流比20∶1。
1.3.2 近红外光谱采集
利用G3000光栅型近红外光谱仪采集光谱。测量前，将仪器预热20 min，通过PQ测试和校正后方可使用。选择0.2 mm的间隙，采集光谱时环境温度保持在（25±2）℃范围内，仪器参数设置：①光谱扫描范围：11 000～4 000 cm-1；②分辨率：12 cm-1；③光谱扫描次数：4次；重复扫描：1次；④光谱采集方式：透反射。每个样品采集3次，取3次采集的光谱平均值作为样本的原始光谱，且在测量过程中，温度、湿度等环境条件尽量保持一致。
1.3.3 光谱数据预处理
为了消除光谱数据采集过程中引入的随机误差和噪声的影响，提高光谱数据信噪比，优化加强光谱信息；所以，在建模前需对原始光谱进行预处理，以提高模型的稳定性[13]。目前在食品安全与品质光谱检测技术中常用到预处理方法有：平滑、导数、标准正态变量变换法（standard normal variate transformation，SNV）、多元散射校正（multiplicative scatter correction，MSC）、矢量归一化（vector normalization，VN）、SG（Savitzky-Golay）卷积平滑法等。本研究选择二阶导数结合矢量归一化法，平滑点数为17作为原始光谱预处理方法，以消除原始光谱基线漂移、增强原始光谱特征带、克服原始光谱谱带重叠、提高信噪比。
1.3.4 数据处理
利用Origin 2021绘图并进行聚类分析；利用SPSS 25.0对GC数据进行多重比较、相关性分析（Person）和主成分分析；利用Bruker OPUS 7.5对样品光谱进行分析。
2 结果与分析
2.1 光谱预处理
52个浓香型白酒基酒酒样（含验证样）的近红外原始光谱见图1，取自每个酒样采集3次之后的平均光谱。由图1可以看出，每个酒样的光谱信息趋势基本一致，但略有不同。原始光谱经过二阶导数、矢量归一化处理后的光谱图见图2。由图2可以看出，近红外原始光谱经导数处理后特征峰均增多，这是因为经二阶导数处理消除了光谱中赘余的背景信息并提高了分辨率[14]。
图1 52个浓香型白酒基酒样品近红外原始光谱瀑布流图
Fig.1 Waterfall flow chart of the near-infrared original spectrum of 52 strong-flavor base liquor samples
图2 52个浓香型白酒基酒样品近红外原始光谱经过二阶导数矢量归一化处理后的光谱图
Fig.2 Near infrared spectrum of 52 strong-flavor base liquor samples after second derivative vector normalization
2.2 建立合格性测试模型
根据合格性测试方法原理[15]，在除去验证酒样的46个酒样中，将34个泸州和宜宾产区生产浓香型白酒基酒样作为对应合格性测试模型的参考集，选取12个成都产区的白酒基酒作为模型测试集对模型进行内部验证，建立可区分四川不同区域浓香型白酒基酒合格性测试模型。根据测试集的测试报告设置模型参数为：光谱预处理方式为二阶导数平滑、矢量归一化法，建模范围为4 428.70～9 345.79 cm-1，平滑点数17，置信系数（confidence interval，CI）值为3.4，采用最大合格性索引算法，52个浓香型白酒基酒合格性测试模型验证结果见图3，图中绿色数据点代表参考光谱，蓝色数据点代表测试光谱，红线表示CI置信范围。由3A可知，参考集光谱与验证集光谱分别分布在红线两侧，说明泸州和宜宾产区酒样与成都产区的酒样可以通过近红外光谱区分开来。由图3B可知，将未参与建模的验证样（L20、L21、L22、C9、C10、C13）对模型进行外部验证结果发现，C9、C10、C13分布在蓝色数据点一侧，L20、L21、L22分布在绿色数据点一侧。综上说明该合格性测试模型能有效鉴别四川不同区域浓香型白酒基酒。
图3 52个浓香型白酒基酒样品近红外光谱合格性测试模型验证图
Fig.3 Validation diagram of near infrared spectrum qualification test model of 52 strong-flavor Baijiu base liquor samples
A为用46个浓香型基酒建模酒样建立的合格性测试模型图；B为添加6个验证酒样后的合格性测试模型图。
2.3 挥发性风味成分可视化分析
为了进一步验证该合格性测试模型判断结果的准确性以及分析不同产区浓香型白酒基酒近红外光谱差异性原因，对52个浓香型基酒样品中挥发性风味成分进行气相色谱分析，结果见表1。由表1可知，共检测出31种挥发性风味成分，包括3种醛类，11种酯类，9种醇类，8种酸类。
表1 52个浓香型白酒基酒样品挥发性风味成分含量测定结果
Table1 Determination results of volatile flavor components contents in 52 strong-flavor Baijiu base liquor samples
2.3.1 层次聚类分析
层次聚类分析（HCA）是一种通过比较样品性质，将性质相似样品聚类并捕获聚类规律进行数据可视化的统计方法[16]。对31种共有挥发性风味成分进行层次聚类分析（HCA），结果见图4。由图4可知，在欧式距离32处，来自不同产区46个浓香型白酒基酒样品分为3类，可以明显看出泸州和宜宾产区酒样明显聚为一大类，成都产区酒样聚为另一大类，这与近红外光谱合格性测试模型验证结果基本一致。在第一大类中，泸州和宜宾生两个不同产区浓香型白酒基酒酒样又被分为两类，由于两地毗邻在酿酒原料和工艺上长期相互交流影响逐渐趋于一致，因此宜宾个别酒样（Y2和Y3）与泸州产区个别酒样聚为一小类；由于酒样L1～L4取自泸州另一酒厂，因此单独聚为一小类；同时又由于相同酒厂不同窖池、不同层酒糟、不同摘酒时间等因素使酿造出的基酒具有差异性，因此同一产区个别酒样被单独分类（C11、C12）。
图4 46个浓香型白酒基酒样品中31种共有挥发性风味组分层次聚类分析结果
Fig.4 Hierarchical cluster analysis result of 31 common volatile components in 46 strong-flavor Baijiu base liquor samples
综上，通过聚类分析明确四川不同地缘区域生产浓香型白酒基酒挥发性组分表达具有差异性，并且进一步验证对不同区域浓香型白酒基酒近红外光谱建立的合格性测试模型具有可靠性，结合近红外光谱分析原理[17]，进一步说明不同样品中化学成分含量的差异会导致样品对近红外光有不同的吸收特性。
2.3.2 主成分分析
主成分分析（PCA）是一种利用降维思想，在损失很少信息的前提下把多个指标转化为几个综合指标的多元统计方法。转化生成的综合指标被称为主成分，每个主成分都是原变量的线性组合[18]。在对实验样品进行PCA之前，使用相关系数矩阵对31种共有挥发性组分数据进行适应性检验，结果见图5。由图5可知，31种挥发性组分之间表现出一定的相关性。其中丁酸乙酯、仲丁醇、正丙醇、丙酸、丁酸、戊酸、异戊酸、乙酸、乳酸乙酯等挥发性组分之间均有互为正相关的关系且相关系数较高，尤其是一些挥发性组分，如：异丁醇、戊酸乙酯与庚酸、己酸、异戊酸、戊酸等物质之间相关性达到了极显著水平（P＜0.01）。乙醛、丙酸、正戊醇、2-甲基丁酸、3-甲基丁酸、正丁醇等挥发性物质之间表现为负相关。大多数挥发性组分之间相关系数绝对值＞0.3，表明相关性较强。
图5 46个浓香型白酒基酒中31种共有挥发性风味成分相关性热图
Fig.5 Correlation heat map of 31 common volatile flavor components in 46 strong-flavor base liquor samples
对46个浓香型白酒基酒样品（不含验证样）31种共有挥发性风味成分进行主成分分析，以特征值大于1的主成分进行提取；同时对结果进行KMO和Bartlett检验得出，KMO值为0.885＞0.6，且Sig值＜0.5，说明这31种挥发性风味成分之间关联程度高，主成分分析结果理想。由表2可知，前5个主成分特征值累计方差贡献率达到91.139%，其中第1主分、第2主分、第3主分、第4主成分和第5主成分的方差贡献率分别为74.403%、5.256%、4.625%、3.508%和3.348%，说明这5个主成分可代表这46个浓香型基酒酒样挥发性物质的大部分信息。
表2 主成分分析特征值及方差贡献率
Table 2 Eigenvalue and cumulative contribution rates of principal components analysis
由表2及表3可知，第1主成分特征值为23.065，除了癸酸乙酯、丙酸、甲酸乙酯这3种挥发性物质，其余28种物质均具有较高的载荷值并在第1主成分中起正向作用，表明第1主成分越大时，这28种物质含量在浓香型基酒中越高。第2主成分特征值为1.629，甲酸乙酯、丙酸两种物质的正向载荷权数较大，其值分别为0.501、0.64，具有负向载荷权数的物质其绝对值均＜0.3，且正向作用挥发性物质数多于负向作用数目，因此，第2主成分主要反映了甲酸乙酯和丙酸两种物质的信息。第3主成分特征值为1.434；第4主成分特征值为1.087；第5主成分特征值为1.038；综合分析5个主成分主要代表相关性，均已涵盖了浓香型基酒风味物质的所有信息。
表3 主成分载荷矩阵
Table 3 Load matrix of principal components
续表
由图6a可知，泸州和宜宾产区浓香型白酒基酒分布在X负半轴区域，成都产区分布在X正半轴区域，明显划分为两类，其中宜宾和泸州两产区浓香型白酒基酒酒样距离很近，这与HCA得到的结果基本一致，表明PCA和HCA结果可以相互验证。由图6b可知，PCA中验证酒样的分布，除酒样L22外，不同产区浓香型基酒验证样相对应其46个建模样的分布落在对应区域内，成都的酒样明显与泸州和宜宾的分开，说明利用这31种挥发性组分进行PCA可实现对成都与泸州和宜宾产区的浓香型白酒基酒进行判别，更进一步验证了上述合格性测试模型判别的准确性高，结果可靠。
图6 46个浓香型白酒基酒样品挥发性风味成分主成分分析散点图
Fig.6 Principal component analysis scatter plots of volatile flavor components in 46 strong-flavor base liquor samples
a.建模集PCA得分图；b.验证样PCA得分图。
2.4 近红外光谱差异原因分析
根据近红外光谱原理可知[19]，近红外光谱来源于分子振动时具有非谐振性而使分子振动吸收能量从基态向高能级跃迁时产生的，主要反映被测样本分子中化学键振动的倍频和合频信息。而这些信息主要由被测样品分子中含氢基团X-H的倍频与合频的重叠所决定，所以在近红外光谱分析中以含氢基团为主，如OH、NH、CH等，其他基团如C=O等由于倍频数大则对近红外光吸收强度就小，信号强度较弱[20]。从理论上来说，通过近红外光谱分析，再结合化学计量学可以得到某一成分含量，那么被测样品中含有氢基团的分子含量会对近红外光谱带吸收强度造成影响。本文选取的近红外光谱波段为4 428.70～9 345.79 cm-1，这个波段能反映C-H振动的一倍频、二倍频和三倍频，O-H振动的合频、一级倍频和二级倍频，C=O键的二级倍频和三级倍频[21-23]。C=O键广泛存在于酯类和醛类物质中，C-H广泛存在于醇类、醛类、酸类、酯类等物质中，O-H键广泛存在于醇类、酚类、酸类等物质中。本研究测得的52个浓香型白酒基酒（含验证样）中共有31种挥发性物质，对其中测得的醇类、酯类、酸类和醛类物质各自总含量进行统计，结果见图7。由图7可知，除成都个别酒样（C11、C12）外，每个酒样中的醛类物质含量较少无显著差异，但含量较多的醇类、酯类和酸类物质含量在经过近红外光谱合格性测试、HCA和PCA分析后分成两大类的大多数酒样中差异显著（P＜0.05），即成都产区只有个别基酒样品（C1、C13、C14）的酸类物质总量与其他两产区差异不大，其余样品这三类物质的含量显著高于其他两产区酒样。由此说明，不同样品中酯类、醇类和酸类等物质含量差异是造成近红外光谱的差异性的重要原因，因此本研究从白酒挥发性组分入手，利用化学计量学手段与近红外光谱合格性测试模型相互验证，判断出模型的准确性和可靠性。
图7 52个浓香型白酒基酒酒样中31种共有挥发性风味成分含量分析结果
Fig.7 Analysis results of 31 common volatile flavor components contents in 52 strong-flavor Baijiu base liquor samples
3 结论
本研究采用建立合格性测试方法对52个产自四川泸州、宜宾和成都的浓香型白酒基酒酒样近红外光谱建立合格性测试模型，结果发现泸州和宜宾产的酒样在CI值范围之内而成都产的酒样在CI值之外。接着利用GC测出的31种共有挥发性物质对所有样品进行HCA和PCA，两者结果能相互验证且PCA能成功鉴别验证酒样，验证结果与合格性测试模型测试结果一致，说明该模型准确有效。深入分析发现，在这31种挥发性组分中，醇类、酸类和酯类物质含量在大部分成都产酒样与在泸州和宜宾产酒样中差异显著。结合近红外光谱分析原理[24-25]，说明醇类、酸类和酯类物质是造成两类酒样对近红外光谱吸收特性差异的重要原因，若要具体定位是哪些关键物质造成的这种差异，则后续还需采用其他手段对数据进行深入挖掘分析。
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