连翘（Forsythia suspensa）为木犀科连翘属双子叶植物，是中国常见的中草药之一[1]，其果实是常用的药用部位，含有多种生物活性成分，如木质素、苯乙二醇苷、黄酮类化合物以及少量的醇类、酯类、醚类和酮类[2]，具有清热解毒、消肿、抗氧化、抗炎、抑菌、抗病毒等多种药用价值[3]。近年来，人们发现连翘叶中的成分与连翘果非常相似，且有效活性成分连翘苷、连翘脂素的含量远高于连翘果[4]，具有抗氧化、抗疲劳、清热解毒、抑菌、明目、保肝、降血糖等多种活性[5]。此外，连翘叶营养丰富，含有蛋白质、膳食纤维、维生素和各种必需氨基酸[3]。2017年7月，国家卫计委正式将连翘叶列入新食品原料，这为以连翘叶为原料开发食品提供了政策支持[6]。尽管如此，工业生产中，连翘叶大都被扔弃，造成连翘叶资源浪费。目前，国内市场上常见的连翘叶产品只有连翘叶茶，种类单一，且以连翘叶红茶和绿茶为主[7]，难以满足消费者的需求。
功能性发酵饮料因富含活性化合物及益生菌，具有抗氧化、抗菌、调节人体胃肠道功能等多种生理功能，对人体健康具有积极的影响，因而人们对发酵饮料的消费兴趣一直在稳步增加[8]。近年来，以水果和蔬菜汁为原料开发发酵型功能性饮料，已经广泛引起了人们的兴趣，因其富含多种活性化合物，是碳水化合物、膳食纤维、维生素、矿物质等营养化合物的良好来源，并能作为益生菌的载体[9]。连翘叶富含连翘脂素、连翘苷等活性物质及必需氨基酸、膳食纤维等营养物质[3-4]，也是一种良好的功能性发酵饮料的原料。
汪青波[10]研究表明，连翘叶经发酵后，不易口服吸收的连翘苷大量转化为药理活性更高的连翘脂素，可减少直接服用连翘苷给肝脏带来的代谢负担，因此连翘叶发酵类食品可能具有更强的潜在功效作用，是未来连翘叶产品研发的重要方向。本研究以连翘叶为主要原料制备连翘叶发酵型饮料，采用单因素试验及二次通用旋转组合试验对其发酵工艺进行优化，并考察连翘叶发酵型饮料对1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）、2,2'-联氮-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸（2,2'-azino-bis（3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid，ABTS）自由基清除能力及还原力，为连翘叶系列健康产品的开发提供一定的理论参考。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
1.1.1 原料和菌株
连翘叶：云南天佑科技开发有限公司；嗜酸乳杆菌（Lactobacillus acidophilus）Bio-03690、罗伊式乳杆菌（Lac tobacillus reuteri）Bio-67171、植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum subsp. plantarum）Bio-03539、克鲁维毕赤酵母（Pichia kluyveri）Bio-65051、酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae Hansen）Bio-51995：中国工业微生物菌种保藏管理中心。
1.1.2 化学试剂
阿拉伯胶、白砂糖：郑州百合食品化工有限公司；DPPH：梯希爱（上海）化成工业发展有限公司；ABTS：北京索莱宝科技有限公司；无水乙醇：成都金山化学试剂有限公司；没食子酸、福林酚：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；三氯乙酸、氯化铁、铁氰化钾、氢氧化钠：成都市科隆化学品有限公司。试验所用试剂均为分析纯。
1.1.3 培养基
MRS肉汤培养基：北京索莱宝科技有限公司。
1.2 仪器与设备
YXQ-LS-100SII立式压力蒸汽灭菌器：江阴滨江医疗设备有限公司；LRH-250智能生化培养箱、DHG-2150B电热鼓风干燥箱：郑州生元仪器有限公司；LC-4014低速离心机：安徽中科中佳科学仪器有限公司；SW-CJ-2F超净工作台：苏州安泰空气技术有限公司；400Y多功能粉碎机：永康市铂欧五金制品有限公司。
1.3 方法
1.3.1 连翘叶发酵型饮料加工工艺流程及操作要点
完整、无霉烂连翘叶→清洗→杀青→捻揉→烘干→磨粉筛选→浸提→过滤→调配适量糖和阿拉伯胶→灭菌→接种→发酵→过滤→成品
操作要点：
连翘叶的选择及洗涤：选择完整、无霉烂的连翘叶，用水冲洗表面的泥沙、杂质等，直至表面冲洗干净。
杀青：鼓风干燥箱中控制温度200 ℃，杀青时间5 min，使鲜叶中的氧化酶活性钝化，同时使鲜叶水分散失，促进连翘叶香气形成。
捻揉：按照轻2 min、重1 min的步骤反复揉捻，使叶片卷曲，汁液外溢，直至握团时无汁液外滴停止。
烘干：鼓风干燥箱中控制温度120 ℃，干燥时间25 min。
研磨筛选：将烘干后的连翘叶研磨成粉，过100目筛，使粉质均匀，细腻。
浸提、过滤：将研磨后的连翘叶粉末加入适量的90 ℃水混合均匀，热水浸提2 h，趁热过滤，滤液冷却备用。
调配：加入适量的糖和阿拉伯胶混合均匀。
灭菌：121 ℃灭菌15 min。
接种：灭菌后的连翘汁放至室温后加入适量的冻干菌粉。
发酵：将接入菌种后的连翘汁放在37 ℃恒温培养箱中发酵一定时间，至发酵液富有光泽、口感醇厚、酸甜适中、无异味停止发酵。
过滤：发酵后的连翘汁过200目尼龙筛（已灭菌），得到连翘叶发酵型饮料。
1.3.2 连翘叶发酵型饮料发酵工艺优化
（1）单因素试验
菌种类型的确定：固定阿拉伯胶添加量0.6%，菌种添加量0.04%，白砂糖添加量5%，料液比1∶50（g∶mL），发酵时间18 h条件下，研究菌种类型（嗜酸乳杆菌Bio-03690、罗伊式乳杆菌Bio-67171、植物乳杆菌Bio-03539、克鲁维毕赤酵母Bio-65051、酿酒酵母Bio-51995以及复合菌种）对连翘叶发酵饮料感官品质的影响。
菌种添加量的确定：固定阿拉伯胶添加量0.6%，克鲁维毕赤酵母∶植物乳杆菌=1∶1，白砂糖添加量5%，料液比1∶50（g∶mL），发酵时间18 h条件下，研究菌种添加量（0.02%、0.03%、0.04%、0.05%、0.06%）对连翘叶发酵饮料感官品质的影响。
白砂糖添加量的确定：固定阿拉伯胶添加量0.6%，克鲁维毕赤酵母∶植物乳杆菌=1∶1，菌种添加量0.04%，料液比1∶50（g∶mL），发酵时间18 h的条件下，研究白砂糖添加量（3%、4%、5%、6%、7%）对连翘叶发酵饮料感官品质的影响。
料液比的确定：固定阿拉伯胶添加量0.6%，克鲁维毕赤酵母∶植物乳杆菌=1∶1，菌种添加量0.04%的条件下，白砂糖添加量5%，发酵时间18 h条件下，研究料液比（1∶30、1∶40、1∶50、1∶60、1∶70（g∶mL））对连翘叶发酵饮料感官品质的影响。
发酵时间的确定：固定阿拉伯胶添加量0.6%，克鲁维毕赤酵母∶植物乳杆菌=1∶1，菌种添加量0.04%的条件下，白砂糖添加量5%，料液比1∶50（g∶mL）条件下，研究发酵时间（16 h、17 h、18 h、19 h、20 h）对连翘叶发酵饮料感官品质的影响。
（2）二次通用旋转组合试验
以单因素试验为基础，按照二次通用旋转组合试验设计原理，以白砂糖添加量（X1）、菌种（克鲁维毕赤酵母∶植物乳杆菌=1∶1）接种量（X2）、料液比（X3）、发酵时间（X4）为自变量，以感官评分（Y）为响应值，进行4因素5水平的二次通用旋转组合试验分析，试验因素与水平见表1。
表1 二次通用旋转组合试验因素与水平
Table 1 Factors and levels of second universal rotating combination experiments
1.3.3 连翘叶发酵型饮料质量评定
（1）感官评价
挑选20名（男女各半）专业的感官评定人员针对连翘叶发酵饮料的色泽、状态、口感及滋味四个方面进行评定，满分100分，感官评分标准见表2。
表2 连翘叶发酵型饮料感官评定标准
Table 2 Sensory evaluation standards of fermented Forsythia suspensa leaves beverage
（2）理化指标测定
pH值的测定：采用pH计法；总糖含量的测定：根据GB 5009.7—2016《食品安全国家标准食品中还原糖的测定》；总酚含量的测定：采用Folin-Ciocalteu比色法[3]。
（3）微生物指标
大肠菌群、霉菌的测定：根据GB 7101—2022《食品安全国家标准饮料》；致病菌的测定：按照GB 29921—2021《食品安全国家标准预包装食品中致病菌限量》；乳酸菌的测定：按照GB 4789.35—2016《食品微生物学检验乳酸菌检验》。
1.3.4 抗氧化活性测定
（1）DPPH自由基清除率
参考GU L P等[11]的方法测定。将样品溶液与DPPH乙醇溶液等体积混合，避光反应30 min，在波长517 nm处测定其吸光度值，记为A样品；以样品溶液与乙醇等体积混合液为对照，记为A对照；以DPPH溶液与乙醇等体积混合液为空白，记为A空白。DPPH自由基清除率计算公式如下：
（2）ABTS自由基清除率
参考PELLEGRINI N等[12]的方法测定。将7 mmol/L ABTS溶液与2.45 mmol/L过硫酸钾溶液等体积混合，混匀后避光反应12～16 h。实验前用磷酸缓冲液将储备液稀释至波长734 nm处吸光度值为0.70±0.02备用；将0.2 mL样品与0.8 mL体积ABTS+稀释液混合于37 ℃水浴10 min，在波长734 nm处测定其吸光度值。以ABTS+稀释液作对照，ABTS自由基清除率计算公式如下：
（3）还原力测定
参考LIU F G等[13]的方法测定。取0.5 mL样品溶液，2.5 mL磷酸缓冲液，2.5 mL 1%的铁氰化钾溶液混匀后50 ℃孵育20 min，结束后立即冰浴冷却。加入2.5 mL 10%三氯乙酸，混匀后离心。取2.5 mL上清液、2.5 mL蒸馏水、0.5 mL 0.1%三氯化铁混合，25 ℃反应10 min，测定波长700 nm处的吸光度值（OD700nm值）。
1.3.5 数据处理
采用DPS v7.05、Graphpad prism 8.0.2对试验数据进行分析，每项试验至少3次平行重复，结果以“平均值±标准差”表示。
2 结果与分析
2.1 单因素试验结果
2.1.1 菌种类型对连翘叶发酵型饮料感官品质的影响
由表3可知，复合菌种制备连翘叶发酵型饮料感官评分为74.5～85.5分，大都优于单一菌种制备连翘叶发酵型饮料的感官评分（72.8～80.7分）。这可能是由于酵母菌和乳酸杆菌在不同的发酵阶段具有一定的互补作用：酵母菌在发酵初期消耗氧气，为乳酸菌创造了适宜的无氧条件；当培养基中氧气量低于乳酸菌发酵临界氧气量时，乳酸菌产酸并抑制其他微生物的生长；同时，酵母菌分解产生的淀粉酶、蛋白酶等酶类物质可分解体系基质为乳杆菌生长提供营养物质，而乳杆菌代谢产生的乳酸盐和半乳糖可作为酵母菌的代谢底物。乳酸菌和酵母菌的这种互补关系，使得这两种菌种组合发酵的效果优于单独作用的效果[14-15]。结果表明，克鲁维毕赤酵母和植物乳杆菌以1∶1配比，进行联合发酵时，制得的连翘叶发酵型饮料感官评分最高，为（85.5±1.4）分，饮品富有光泽、口感醇厚、无沉淀、酸甜适中、无异味。因此，综合考虑，采用克鲁维毕赤酵母和植物乳杆菌复合菌种（1∶1）发酵连翘叶发酵型饮料。
表3 不同菌种对连翘叶发酵型饮料感官评分的影响
Table 3 Effect of different kinds of strains on sensory scores of fermented Forsythia suspensa leaves beverage
2.1.2 菌种接种量对连翘叶发酵型饮料感官品质的影响
菌种接种量是影响微生物发酵的重要因素之一，发酵菌株对数生长期的生长速度和生长周期受接种量高低的影响。接种量过低，菌株繁殖基数小，生长缓慢，容易有杂菌生长，且发酵不充分[13]。采用克鲁维毕赤酵母和植物乳杆菌复合菌种（1∶1），菌种接种量对连翘叶发酵型饮料感官品质的影响见图1。
图1 接种量对连翘叶发酵型饮料感官评分的影响
Fig.1 Effect of inoculum on sensory score of fermented Forsythia suspensa leaves beverage
由图1可知，当混合菌种接种量为0.02%～0.04%时，随混合菌种接种量增加，感官评分呈上升趋势，这可能是由于菌体的大量繁殖促进了发酵[19]；当混合菌种接种量为0.04%时，感官评分最高，为85.93分；当混合菌种接种量＞0.04%之后，感官评分有所下降。菌种接种量越高，发酵液营养物质过度分解，代谢废物积累越多，发酵饮料的感官评分越低；若接种量过高，发酵液中的营养物质被过度消耗，发酵液中溶氧不足，微生物生长缺乏能量，影响发酵产物合成及代谢[20]，此外，接种量过高会导致菌种早衰、自溶等现象的发生，反而不利于发酵的进行[21-22]。因此，选择混合菌种最佳接种量为0.04%。
2.1.3 白砂糖添加量对连翘叶发酵型饮料感官品质的影响
白砂糖作为连翘叶发酵型饮料的主要碳源，在影响微生物生长的同时，显著影响着发酵饮料的感官品质[16]。白砂糖添加量对连翘叶发酵型饮料感官品质的影响见图2。
图2 白砂糖添加量对连翘叶发酵型饮料品质感官评分的影响
Fig.2 Effect of sugar addition on sensory score of fermented Forsythia suspensa leaves beverage
由图2可知，随白砂糖添加量在3%～7%范围内的增大，连翘叶发酵型饮料的感官评分呈先上升后下降的趋势。当白砂糖添加量为3%～5%时，感官评分随之增高；当白砂糖添加量为5%时，感官评分最高，为86.12分；当白砂糖添加量＞5%之后，感官评分随之下降。白砂糖添加量过低，发酵不充分，导致饮料口感过于苦涩，色泽偏深；当白砂糖添加量过多时，连翘叶发酵型饮料口感偏甜发腻，大众接受度不高。此外，在基质氮源含量不变的情况下，只提高白砂糖含量会造成碳氮比失衡，使菌种发生早衰[17]。同时，过量的白砂糖会使菌种的渗透压增强，使微生物发生脱水从而抑制其生长及繁殖[18]，使发酵饮料产生异味。因此，选择最佳白砂糖添加量为5%。
2.1.4 料液比对连翘叶发酵型饮料感官品质的影响
发酵液料液比过高，无法给予菌株充足的发酵底物，导致发酵不足，滋味较淡并有涩味；料液比过低，发酵液中单宁酸、茶多酚过多生成，抑制菌体生长和发酵速度，连翘风味过浓，颜色不均一，口感较差[23]。因此，研究料液比对连翘叶发酵饮料品质的影响至关重要。料液比对连翘叶发酵型饮料感官品质的影响见图3。
图3 料液比对连翘叶发酵型饮料感官评分的影响
Fig.3 Effect of solid and liquid ratio on sensory score of fermented Forsythia suspensa leaves beverage
由图3可知，当料液比为1∶30～1∶50（g∶mL）时，感官评分呈上升趋势；当料液比为1∶50（g∶mL）时，感官评分最高，为86.15分，制得的发酵饮料呈浅绿色，富有光泽，口感柔和，酸甜适中，无颗粒感；当料液比为1∶50～1∶70（g∶mL）时，感官评分有所下降。因此，选择最佳料液比为1∶50（g∶mL）。
2.1.5 发酵时间对连翘叶发酵型饮料感官品质的影响
微生物发酵完全程度受发酵时间的影响，发酵时间不足，发酵不完全，产品涩味偏重，口感不够柔和，颗粒感明显，色泽不均匀；发酵时间过长，糖类等营养物质减少，菌种出现老龄化，产酸能力下降，代谢废物增多[24]，使发酵饮料产生异味，酸甜失调。发酵时间对连翘叶发酵型饮料感官品质的影响见图4。
由图4可知，当发酵时间为16～18 h时，感官评分随之增高；当发酵时间为18 h时，感官评分最高；为87.03分；当发酵时间＞18 h之后，感官评分有所下降。因此，选择最佳发酵时间为18 h。
图4 发酵时间对连翘叶发酵型饮料感官评分的影响
Fig.4 Effect of fermentation time on sensory score of fermented Forsythia suspensa leaves beverage
2.2 二次通用旋转组合试验结果
在单因素试验基础上，按照二次通用旋转组合试验设计原理，以白砂糖添加量（X1）、菌种（克鲁维毕赤酵母∶植物乳杆菌=1∶1）接种量（X2）、料液比（X3）、发酵时间（X4）为自变量，以感官评分（Y）为响应值，进行4因素5水平的二次通用旋转组合试验分析，二次通用旋转组合试验结果见表4，对回归方程进行显著性检验分析，结果见表5。
表4 二次通用旋转组合试验设计及结果
Table 4 Design and results of second universal rotating combination experiment
续表
表5 回归模型方差分析
Table 5 Variance analysis of regression model
注：“*”表示对结果影响显著（P＜0.05）；“**”表示对结果影响极显著（P＜0.01）。
利用DPS v7.05分析软件，对表4试验数据进行统计分析，建立二次回归模型，其回归方程为：Y=84.262 86+0.763 33X1+1.617 50X2+1.119 17X3-0.678 33X4-1.923 63X12-2.25613X22-1.35863X32-1.84238X42-0.83000X1X2-0.13000X1X3+0.81250X1X4+0.17875X2X3+1.11625X2X4+0.34875X3X4。
由表5方差分析可知，感官评分回归模型显著性检验P值=0.000 1＜0.01，说明二次多元回归模型极显著，能反映感官评分与白砂糖添加量、菌种添加量、料液比、发酵时间之间的关系；感官评分回归模型失拟性检验P值=0.892 5＞0.05，说明连翘叶发酵型饮料的感官评分二次回归模型与实际试验失拟项不显著，表明此模型可用于该试验拟合。由P值可知，一次项X2、X3，二次项X12、X22、X32、X42对结果影响极显著（P＜0.01），一次项X1、X4，交互项X1X2、X2X4对结果影响显著（P＜0.05），其他项对结果影响不显著（P＞0.05）。由F值可知，四个因素对连翘叶发酵型饮料感官评分的影响顺序为：菌种添加量（X2）＞料液比（X3）＞白砂糖添加量（X1）＞发酵时间（X4）。
通过连翘叶发酵饮料感官评分拟合模型的回归方程所作的各因素之间交互作用的响应面及等高线如图5所示。由图5可知，各因素间交互作用对连翘叶发酵饮料感官评分的影响大小依次为X2X4＞X1X2＞X1X4＞X3X4＞X2X3＞X1X3，且其中交互项X1X2、X2X4对结果影响显著（P＜0.05），这与表5结果一致。
图5 各因素间交互作用对连翘叶发酵型饮料感官评分影响的响应面及等高线
Fig.5 Response surface plots and contour lines of effects of interaction between each factor on sensory scores of fermented Forsythia suspensa leaves beverage
利用DPS v7.05分析软件，得到最佳发酵工艺条件为：白砂糖添加量5.105%、菌种接种量0.044%、料液比1∶50.18（g∶mL）、发酵时间17.99 h。在此条件下，连翘叶发酵型饮料感官评分预测值为84.83分。为了便于实际操作，将最佳工艺条件修正为：白砂糖添加量5%，菌种接种量0.04%、料液比1∶50（g∶mL）、发酵时间18 h。在此优化条件下进行3次平行验证试验，得到的连翘叶发酵型饮料感官评分为（86.53±1.03）分，与预测值较为接近，表明此回归方程可以较好地应用于连翘叶发酵型饮料最佳工艺的优化。
2.3 连翘叶发酵型饮料的质量评价
2.3.1 连翘叶发酵型饮料感官指标
本试验所得到的连翘叶发酵型饮料成品呈绿色、富有光泽、静置无沉淀产生、口感醇厚、酸甜适中、无异味，是一款感官品质较佳的特色饮料产品。
2.3.2 连翘叶发酵型饮料理化指标
由表6可知，由于微生物的生长及合成代谢需要消耗由糖类物质提供的碳源，因此发酵后发酵液总糖含量显著下降。相反，由于微生物可将糖类物质分解为乳酸、乙酸、柠檬酸等有机酸，使得发酵液在发酵后酸度上升，pH值下降[25]。此外，由表6可知，在发酵后，发酵液中总酚含量略有上升，有研究证实总酚含量的上升可能是由于乳酸菌和酵母菌共发酵促进多酚类化合物的释放及转化[23]。
表6 连翘叶发酵型饮料的理化指标
Table 6 Physicochemical indexes of fermented Forsythia suspensa leaves beverage
注：同列不同小写字母表示差异显著（P＜0.05）。
2.3.3 连翘叶发酵型饮料微生物指标
由表7可知，连翘叶发酵型饮料乳酸菌含量＞106CFU/mL，说明连翘叶发酵饮料有助于维持人体肠道健康。大肠杆菌、霉菌及致病菌金黄色葡萄球菌、沙门氏菌在产品制作完成后均未检出，连翘叶发酵型饮料符合GB 7101—2015《食品安全国家标准饮料》中对直接饮用饮料制品的微生物指标要求。说明本产品安全性高。
表7 连翘叶发酵型饮料的微生物指标
Table 7 Microbial indexes of fermented Forsythia suspensa leaves beverage
2.4 连翘叶发酵型饮料的抗氧化性评价
由表8可知，连翘叶发酵型饮料在发酵后DPPH自由基清除能力显著提高，可能与酵母菌与乳杆菌的代谢产物与连翘叶发酵液中活性成分变化有关。相反，连翘叶在发酵后ABTS自由基清除能力显著下降，这可能与微生物发酵消耗多糖类物质有关[26]。多糖具有良好的抗氧化功能，发酵使发酵液中多糖含量下降，并由此使得ABTS自由基清除能力下降[27]。还原力作为一个综合性的抗氧化指标，与结合自由基的清除、过氧化物的分解反应等多种抗氧化机制密切相关，能综合反应样品的体外抗氧化水平[28]。发酵后还原力的上升，说明乳杆菌和酵母菌的共发酵作用能够提升发酵液的抗氧化水平。
表8 连翘叶发酵型饮料抗氧化活性测定结果
Table 8 Determination results of antioxidant activities of fermented Forsythia suspensa leaves beverage
注：同列不同小写字母表示差异显著（P＜0.05）。
3 结论
采用单因素试验结合二次通用旋转组合分析确定连翘叶发酵型饮料的最佳发酵工艺为白砂糖添加量5%，菌种（克鲁维毕赤酵母∶植物乳杆菌=1∶1）接种量0.04%、连翘叶粉添加量2.0%、阿拉伯胶添加量0.6%，发酵时间18 h。在此优化条件下，连翘叶发酵型饮料感官评分为（86.53±1.03）分，色香味俱佳，口感酸甜，无明显苦味，理化与微生物指标均符合国家标准。连翘叶发酵型饮料，口感独特，并兼具抗氧化功能，市场前景广阔，同时连翘叶发酵型饮料的研发也在一定程度上促进了连翘叶精深加工及全产业链的发展。
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