风味酸奶是以生牛（羊）乳或乳粉为原料，经过巴氏杀菌，添加益生菌、白糖等，经过发酵、后熟等关键步骤制备的一种乳制饮品，具有独特的发酵风味和良好的功能活性[1-2]，营养丰富，具有润肤生津止渴、补虚开胃、润肠通便、促进消化等作用[2]。目前，保加利亚乳杆菌（Lactobacillus bulgaricus）和嗜热链球菌（Streptococcus thermophilus）是酸奶发酵常用的发酵菌种[3]。低聚果糖和水苏糖具有增殖有益菌、调节肠道菌群、提高免疫力、通肠润便以及改善物质代谢、降低胆固醇等功能，对人体健康有着极为重要的作用[4-5]。研究表明，低聚果糖和水苏糖可增殖益生菌、增强乳酸菌活性、调节肠道菌群、提高免疫力、增强产品风味等作用[4-8]。
黑枸杞富含蛋白质、枸杞多糖、氨基酸、维生素、微量元素等多种营养成分，相比于其他种类的枸杞，黑枸杞含有更加丰富的维生素、矿物质、花青素和β-胡萝卜素[9-10]。黑枸杞风味酸奶富含花青素和黄酮，可以较大程度地保留黑枸杞功能性成分含量并发挥其作用[11]。此外，黑枸杞风味酸奶的挥发性物质中醇类、酯类物质较丰富，使产品具备优良风味[12]。刘娟等[13]研究的藜麦黑枸杞酸奶，组织均匀、口感细腻、具有藜麦清香及黑枸杞特有香味。贾庆超等[14-15]研究的黑枸杞-刺梨风味发酵乳和黑枸杞红枣风味发酵乳，酸甜可口、组织均匀，具有黑枸杞刺梨和黑枸杞红枣风味。目前，关于黑枸杞风味酸奶抗氧化性的研究鲜见报道。
本研究以黑枸杞、牛奶为主要原料研制黑枸杞风味酸奶，以感官评价和乳酸菌总数为评价指标，采用单因素试验及响应面试验对其发酵条件进行优化，并考察低聚果糖和水苏糖对黑枸杞风味酸奶品质的影响，以期为新型功能性发酵风味酸奶的研发生产提供指导，并为低聚果糖与水苏糖在益生菌发酵风味酸奶中的应用提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
1.1.1 材料与菌株
宁安堡黑果枸杞：宁夏宁安堡土特产品有限公司；嗜热链球菌（Streptococcus thermophilus）、保加利亚乳杆菌（Lactobacillus bulgaricus）：西安米歇尔生物科技有限公司。
1.1.2 试剂
白砂糖（食品级）：市售；羧甲基纤维素钠（carboxyl methyl cellulose，CMC）（食品级）：利成食品添加剂有限公司；MRS培养基（生化试剂）：杭州百思生物技术有限公司；氢氧化钠（分析纯）：天津市永大化学试剂有限公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）（分析纯）：上海源叶生物科技有限公司；体积分数95%乙醇（分析纯）：瑞康医用科技有限公司；浓硫酸、酚酞、硼酸、硫酸铜、硫酸钾（均为分析纯）：天津科密欧化学试剂有限公司。
1.2 仪器与设备
SPECORD213紫外分光光度计：德国耶拿公司；X-4-11马弗炉：天津泰斯特仪器有限公司；HHS-21-9水浴锅、SPX-250A-Z培养箱：上海博讯医疗生物器械有限公司；N1-50全自动氮吹浓缩仪：上海屹尧仪器科技发展有限公司；XPE205DR分析天平：梅特勒托利多集团；HH.BLL.420-BS发酵箱：上海跃进医疗器械厂；LDZX-50KBS立式高压灭菌器：上海申安医疗器械厂；RCD-1A均质机：常州市亿能实验仪器厂。
1.3 试验方法
1.3.1 黑枸杞风味酸奶的制备工艺流程及操作要点
操作要点：
黑枸杞汁的制备：挑选无虫蛀、无缺损、无霉变的黑枸杞，洗净、晾干后，按照黑枸杞∶水料液比1∶15（g∶mL）[15]放入破碎打浆机中打碎成浆，并在水浴锅于70 ℃浸提4 h，用80目过滤塞过滤，即得黑枸杞汁[15]。
混合：以鲜牛乳质量为基准，将9%白砂糖、0.4%羧甲基纤维素钠、4.1%黑枸杞汁充分混匀后加入至150 g（60～70 ℃）鲜牛乳中，搅拌至均匀无颗粒状即可[16]。
均质：采用均质机将上述混合液于1 200 r/min均质15 min。
杀菌、冷却：将均质后混合液进行杀菌，杀菌温度为90～95 ℃，杀菌时间为10 min，冷却至42 ℃左右。
接种：将冷却后的混合液于无菌条件下接种嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌，接种量为2%，两种菌种比例为1∶1。
发酵：将接种后的混合液放入恒温箱中43 ℃发酵5 h，待混合液逐渐由液态变为固态凝乳且滴定酸度达到70 T°即停止发酵[12]。
后熟：将发酵好的酸奶放入4～6 ℃的冰箱中冷藏12 h[15]，即得黑枸杞风味酸奶成品。
1.3.2 黑枸杞风味酸奶的感官评价标准
感官评定参考GB 19302—2010《食品安全国家标准发酵乳》，从色泽、组织状态、滋味及气味方面对黑枸杞风味酸奶进行感官评价，满分为100分，感官评价标准见表1。
表1 黑枸杞风味酸奶的感官评价标准
Table 1 Sensory evaluation standards of black wolfberry flavored yogurt
1.3.3 黑枸杞风味酸奶发酵条件优化单因素试验
以150 g鲜牛乳为基准，固定基本试验条件为：黑枸杞汁添加量4.1%、羧甲基纤维素钠添加量0.4%、白砂糖添加量9%、嗜热链球菌与保加利亚乳杆菌（1∶1）接种量2%[16]，分别考察羧甲基纤维素钠的添加量（0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%）[17]、黑枸杞汁添加量（3.8%、3.9%、4.0%、4.1%、4.2%）[18]、白砂糖添加量（6%、7%、8%、9%、10%）[19]、混合菌种接种量（1.5%、2.0%、2.5%、3.0%、3.5%）对感官评分及乳酸菌总数的影响[16]。
1.3.4 黑枸杞风味酸奶发酵条件优化响应面试验
在单因素试验基础上，以白砂糖添加量（A）、黑枸杞汁添加量（B）、羧甲基纤维素钠添加量（C）和接种量（D）为自变量，以感官评分（R1）、乳酸菌总数（R2）为响应值，采用4因素3水平的响应面试验对其发酵条件进行优化，Box-Behnken试验因素与水平见表2。
表2 发酵条件优化响应面试验因素与水平
Table 2 Factors and levels of response surface tests for fermentation conditions optimization
1.3.5 低聚果糖和水苏糖对黑枸杞风味酸奶品质的影响
（1）低聚果糖
分别添加1.2%、1.4%、1.6%、1.8%、2.0%的低聚果糖于黑枸杞风味酸奶中[8]，搅拌均匀，放置于冰箱（4 ℃），后熟12 h，考察低聚果糖对黑枸杞风味酸奶品质的影响。
（2）水苏糖
分别添加0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%的水苏糖于黑枸杞风味酸奶中[20]，搅拌均匀，放置于冰箱（4 ℃）后熟12 h，考察水苏糖对黑枸杞风味酸奶的影响。
1.3.6 理化指标以及微生物指标的测定
乳酸菌总数的测定：参考GB 4789.35—2016《食品微生物学检验乳酸菌检验》；酸度的测定：参考GB 5009.239—2016《食品酸度的测定》第一法酚酞指示剂法；蛋白质的测定：参考GB 5009.5—2016《食品中蛋白质的测定》第一法凯氏定氮法。
1.3.7 DPPH自由基清除率的测定
DPPH·清除率的测定参考贾庆超等[14，21]的测定方法。
1.3.8 数据处理
所有试验数据采用SPSS21.0进行方差分析，以P＜0.05为差异显著，采用Origin 2018绘制折线图。
2 结果与分析
2.1 黑枸杞风味酸奶发酵条件优化单因素试验
2.1.1 羧甲基纤维素钠添加量的确定
羧甲基纤维素钠既具有增稠性又具有较强的黏性，添加适量的羧甲基纤维素钠有助于发酵乳成品更均匀细腻，稳定性更强，避免乳清析出，产品稳定的同时也让乳酸菌的分布的更加均匀[22]。羧甲基纤维素钠添加量对风味酸奶感官品质及乳酸菌总数的影响见图1。由图1可知，随着CMC添加量的增加，黑枸杞风味酸奶的感官评分先升高再下降，在CMC添加量＜0.4%时，感官评分逐渐增加；当CMC添加量为0.4%时，感官评分达到最高值，为88.59分，此时黑枸杞风味酸奶黏稠度适中、酸甜可口、口感协调柔和；当CMC添加量＞0.4%时，黑枸杞风味酸奶感官评分下降。随着CMC添加量在0.1%～0.5%范围内的不断增加，乳酸菌总数逐渐增加，这可能是由于CMC带负电，可降低酸奶的酸度，进而促进酸奶的进一步发酵，这与刘冠卉等[23]研究结果一致。CMC添加量为0.3%时，风味酸奶的感官评分与菌落总数结果与CMC添加量为0.4%时差异不大。综合考虑，选取羧甲基纤维素钠添加量为0.2%、0.3%、0.4%进行响应面试验优化。
图1 羧甲基纤维素钠添加量对风味酸奶感官品质及乳酸菌总数的影响
Fig.1 Effect of sodium carboxymethyl cellulose addition on sensory quality and total lactic acid bacteria counts of flavored yogurt
2.1.2 黑枸杞汁添加量的确定
黑枸杞汁添加量对风味酸奶感官品质及乳酸菌总数的影响见图2。由图2可知，随着黑枸杞汁的添加量在3.8%～4.1%范围内的增加，黑枸杞风味酸奶的感官评分逐渐增加；当黑枸杞汁添加量为4.1%时，感官评分达到最大值，为88.3分，此时，黑枸杞风味浓郁、酸甜度适中，整体风味协调柔和、质地均匀无乳清析出；当黑枸杞汁添加量＞4.1%时，感官评分逐渐下降。当黑枸杞汁添加量＜3.9%时，乳酸菌总数逐渐增加；当黑枸杞汁添加量为3.9%时，乳酸菌总数达到最大值，为16.8×108 CFU/mL；当黑枸杞汁添加量＞3.9%时，乳酸菌总数逐渐下降，与刘奕炜[24]的研究结果较一致。综合考虑，选取黑枸杞汁添加量为4.0%、4.1%、4.2%进行响应面试验优化。
图2 黑枸杞汁添加量对风味酸奶感官品质及乳酸菌总数的影响
Fig.2 Effect of black wolfberry juice addition on sensory quality and total lactic acid bacteria counts of flavored yoghurt
2.1.3 白砂糖添加量的确定
白砂糖添加量对风味酸奶感官品质及乳酸菌总数的影响见图3。由图3可知，随着白砂糖添加量在6%～9%范围内的增加，感官评分逐渐增加；当白砂糖添加量为9%时，感官评分达到最高值，为88.1分，黑枸杞香味适中、酸甜度适中，整体风味协调柔和、质地均匀无乳清析出；当白砂糖添加量＞9%时，感官评分逐渐下降。当白砂糖添加量在6%～8%范围内的增加，乳酸菌总数逐渐增加；当白糖添加量为8%时，乳酸菌总数达到最高，为12.1×108 CFU/mL；当白砂糖添加量＞8%时，乳酸菌总数降低，其原因可能是白砂糖添加量相对较高，微生物细胞中的水分向外流动，形成反渗透现象，从而抑制微生物的生长[25]。综合考虑，选择白砂糖添加量为8%、9%、10%进行响应面试验。
图3 白砂糖添加量对风味酸奶感官品质及乳酸菌总数的影响
Fig.3 Effect of sugar addition on sensory quality and total lactic acid bacteria counts of flavored yoghurt
2.1.4 接种量的确定
接种量对风味酸奶感官品质及乳酸菌总数的影响见图4。由图4可知，随着接种量的增加，益生菌发酵黑枸杞风味酸奶的感官评分先快速升高再下降。当接种量＜2.0%时，感官评分逐渐增加；当接种量为2.0%时，感官评分达到最高值，为86分，此时黑枸杞风味酸奶色泽均匀一致，酸甜适中整体口感协调柔和；当接种量＞2.0%时，感官评分逐渐下降。随着接种量在1.5%～3.5%范围内增加，乳酸菌总数逐渐增加。当嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌（1∶1）添加量为2.0%时，黑枸杞风味酸奶pH值和酸度相对适宜，当接种剂添加量继续上升时，酸奶产酸能力过强，酸度上升有利于乳酸菌总数的增长[26]。综合考虑，选取接种量1.5%、2.0%、2.5%进行响应面试验。
图4 接种量对风味酸奶感官品质及乳酸菌总数的影响
Fig.4 Effect of inoculum on sensory quality and total lactic acid bacteria counts of flavored yoghurt
2.2 响应面优化试验
在单因素试验基础上，以白砂糖添加量（A）、黑枸杞汁添加量（B）、羧甲基纤维素钠添加量（C）和接种量（D）为自变量，以感官评分（R1）、乳酸菌总数（R2）为响应值，进行4因素3水平的响应面试验设计，结果见表3，感官评价方差分析见表4。
表3 发酵条件优化Box-Behnken试验设计与结果
Table 3 Design and results of Box-Behnken experiments for fermentation conditions optimization
表4 以感官评价为评价指标的回归模型方差分析结果
Table 4 Variance analysis results of regression model with sensory evaluation as evaluation index
注：“**”表示对结果影响极显著（P＜0.01）。
采用Design-Expert10.0.7软件对表3的数据进行回归拟合分析，得到4因素与感官评分（R1）二次多项回归方程为：R1=88.82+3.61A+2.61B-2.33C+3.28D-0.48AB-0.35AC-1.00AD+0.60BC-0.80BD+1.08CD-6.71A2-3.71B2-3.66C2-3.66D2
由表4可知，该模型极显著（P＜0.000 1），失拟项不显著（P=0.099 9＞0.05），说明模型能拟合试验结果，数据有高度可靠性[27]。对试验模型的可信度进行分析，其决定系数R2=0.963 3，调整决定系数R2Adj=0.926 7，表明响应值96.33%的变化来自于所选因素，方程的拟合度较好。变异系数（coefficient of variation，CV）=1.84%，模型具有良好重现性[28]。由P值可知，一次项A、B、C、D，二次项A2、B2、C2、D2对结果影响极显著（P＜0.01）。交互项AB、AC、AD、BC、BD、CD对结果影响不显著（P＞0.05）。由F值可知，影响黑枸杞风味酸奶感官评分的4个因素先后次序为A＞D＞B＞C，即白糖添加量＞接种量＞黑枸杞汁添加量＞羧甲基纤维素钠添加量。各因素间交互作用对黑枸杞风味酸奶感官评分影响的响应曲面见图5。
根据响应面的坡度及等高线的形状可以看出各因素间交互作用的显著程度。由图5可知，两因素间交互响应面图的响应值均存在一个极大值，说明感官评分极值存在所选水平范围内，说明此模型数据合理。
图5 各因素交互作用对黑枸杞风味酸奶感官评分影响的响应面及等高线
Fig.5 Response surface plots and contour lines of effect of interaction between each factor on sensory score of black wolfberry flavored yogurt
2.3 黑枸杞风味酸奶发酵工艺条件的确定
采用Design-Expert10.0.7软件对回归模型进行最优求解，得到黑枸杞风味酸奶的最佳配方为白糖添加量8.9%、黑枸杞汁添加量4.1%、羧甲基纤维素钠添加量0.31%、接种量2.18%，在此优化条件下，黑枸杞风味酸奶感官评分预测值89.36分，乳酸菌总数预测值为1.317×109 CFU/mL。考虑实际生产因素，将最佳工艺条件修正为白糖添加量8.9%、黑枸杞汁添加量4.1%、羧甲基纤维素钠添加量0.3%、接种量2.2%，在此优化条件下进行3次平行验证试验，感官评分实际值为89.48分，乳酸菌总数实际值为1.306×109 CFU/mL，与优化后预测值接近，证明该模型可用于益生菌发酵黑枸杞风味酸奶工艺优化。
2.4 低聚果糖和水苏糖对黑枸杞风味酸奶品质的影响
2.4.1 低聚果糖对黑枸杞风味酸奶感官评价和乳酸菌总数的影响
由图6a可知，随着低聚果糖添加量在1.2%～1.8%范围内的增加，感官评分缓慢增加，而乳酸菌总数明显增加；当低聚果糖添加量为1.8%时，感官评分及乳酸菌总数均达到最大值，分别为90.2分和9.33×109 CFU/mL；当低聚果糖添加量＞1.8%时，感官评分及乳酸菌总数均下降。杨郁等[29]的研究结果表明，添加1%～2%的低聚果糖对乳酸菌总数有显著增殖作用。饶翔等[30]的研究表明，添加2%的低聚果糖使发酵乳中形成了高渗透压，从而导致乳酸菌总数下降，但仍保持较高水平，与本试验研究结果一致。综合考虑，最适低聚果糖添加量为1.8%，此时，乳酸菌总数为9.33×109 CFU/mL，未添加低聚果糖枸杞风味酸奶乳酸菌总数为1.317×109 CFU/mL，添加低聚果糖枸杞风味酸奶乳酸菌总数是未添加低聚果糖的7.08倍，但感官评分差异不大。
图6 低聚果糖添加量（a）和水苏糖添加量（b）对黑枸杞风味酸奶感官评分及乳酸菌总数的影响
Fig.6 Effect of fructooligosaccharide (a) and stachyose addition (b)on sensory scores and total lactic acid bacteria counts of black wolfberry flavored yogurt
由图6b可知，随着水苏糖添加量在0.2%～0.8%范围内的增加，感官评分逐渐增加；当水苏糖添加量为0.8%时，感官评分达到最大值，为90.6分；当水苏糖添加量＞0.8%，感官评分逐渐下降，但水苏糖的添加量对产品感官评价影响较小。当水苏糖添加量在0.2%～0.6%范围内增加，乳酸菌总数明显增加；水苏糖添加量＞0.6%，乳酸菌总数逐渐平稳。王庭欣等[31]提出，在羊奶中添加水苏糖，当水苏糖添加量为0.4%～1.2%，随水苏糖添加量增加，乳酸菌总数增加，与添加量为0.8%的水苏糖相比，添加量为1.2%水苏糖乳酸菌总数变化不明显，与本试验结果研究结果较一致。综合考虑，水苏糖添加量为0.8%时，感官评分及乳酸菌总数均较高，乳酸菌总数为7.33×109 CFU/mL。未添加水苏糖黑枸杞风味酸奶乳酸菌总数为13.17×108 CFU/mL，因此，添加水苏糖的黑枸杞风味酸奶的乳酸菌总数是未添加水苏糖的黑枸杞风味酸奶的5.6倍，但感官评分差异不大。
添加低聚果糖或水苏糖获得的黑枸杞风味酸奶色泽均匀一致，呈淡紫色；具有自然的发酵风味和气味，风味适中，酸甜比合适；组织细腻、均匀、无粉末感、无乳清析出。
2.4.2 低聚果糖和水苏糖对发酵黑枸杞风味酸奶酸度的影响
GB 19302—2010《食品安全国家标准发酵乳》中规定发酵乳酸度＞70°T。未添加低聚果糖或水苏糖的发酵风味酸奶酸度为94°T，低聚果糖和水苏糖添加量分别为1.8%和0.8%时，益生菌发酵黑枸杞风味酸奶酸度分别为72°T和75°T，分别降低23.4%和20.2%，但均符合GB 19302—2010《食品安全国家标准发酵乳》要求。饶翔等[30]研究发现，低聚果糖和水苏糖具有抑制乳酸生长的功效，可以被乳酸菌分解吸收，同时低聚果糖和水苏糖也可以作为亲水性大分子物质对水分活度产生影响，从而影响酶活力，间接影响乳酸菌的代谢，减少乳酸的产生，防止发酵乳持续产酸。何君等[8]研究亦发现，低聚果糖可使发酵乳保持柔和的酸甜风味。
2.4.3 低聚果糖和水苏糖对黑枸杞风味酸奶DPPH·清除率的影响
未添加低聚果糖和水苏糖的风味酸奶的DPPH·清除率为36.71%，低聚果糖和水苏糖添加量分别为1.8%、0.8%时，发酵风味酸奶DPPH·清除率分别为45.07%、46.45%，分别提升22.7%、26.5%，这是因为低聚糖协同益生菌在发酵牛奶过程中增强了抗氧化肽的释放，从而提高了发酵乳的抗氧化性[32]。由此可知，低聚果糖和水苏糖的添加量有利于提高黑枸杞风味酸奶的抗氧化性品质。
2.4.4 低聚果糖和水苏糖对发酵黑枸杞风味酸奶蛋白质含量的影响
GB 19302—2010《食品安全国家标准发酵乳》中规定蛋白质含量应＞2.3 g/100 g。未添加低聚果糖或水苏糖的发酵风味酸奶蛋白质含量为3.24 g/100 g，低聚果糖和水苏糖添加量分别为1.8%和0.8%时，蛋白质含量分别为3.8 g/100 g和3.71 g/100 g，分别升高65.2%和61.3%。贾庆超等[15]测得黑枸杞红枣风味发酵乳蛋白质含量为3.16 g/100 g，本研究结果高出其结果（0.55～0.64）g/100 g，由此可知，低聚果糖和水苏糖有助于提高黑枸杞风味酸奶的蛋白质含量。
3 结论
以黑枸杞为主要原料，制备黑枸杞风味酸奶，以感官评价和乳酸菌总数为考察指标，采用单因素试验和响应面法对其制备工艺进行优化，并考察低聚果糖和水苏糖对其品质的影响。结果表明，黑枸杞风味酸奶的最佳制备条件为白砂糖添加量8.9%、黑枸杞汁添加量4.1%、羧甲基纤维素钠添加量0.3%、接种量2.2%。在此优化条件下，黑枸杞风味酸奶感官评分为89.48分，乳酸菌总数为1.3×109 CFU/mL。当低聚果糖和水苏糖添加量分别为1.8%和0.8%时，黑枸杞风味酸奶乳酸菌总数分别提高7.08倍和5.6倍，但感官评分变化不大；蛋白质含量分别增加65.2%和61.3%；DPPH·清除率分别增加22.7%和26.5%；酸度分别下降23.4%和20.2%，表明低聚果糖和水苏糖可有效影响乳酸菌的代谢，减少乳酸的产生，防止发酵乳持续产酸，保持柔和的酸甜风味。以上结果说明低聚果糖和水苏糖对益生菌发酵黑枸杞风味酸奶的品质有一定影响，本研究对黑枸杞风味酸奶的工业化生产可以提供一定的参考依据。
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