D-塔格糖（D-tagatose）是近年来新发现的功能性稀有糖，具有抗氧化、降血糖、改善肠道菌群、防龋齿、预防结肠癌等多种功能，广泛应用于食品、饮料、糖果、化妆品、医药等领域中[1-4]。D-塔格糖的生产主要是利用L-阿拉伯糖异构酶（L-arabinose isomerase，L-AI）将D-半乳糖异构化为D-塔格糖，该酶被认为是生物转化D-塔格糖最优良的生物催化剂，且广泛存在于各种嗜温、嗜热、超级嗜热微生物中[5-8]。由于高温有利于L-AI催化D-半乳糖转化为D-塔格糖，工业生产D-塔格糖所用的微生物主要是嗜热菌或其所产生的L-AI，但其安全性一直饱受质疑。因此人们转向从食品级微生物如乳酸菌中寻找能够产生L-AI的菌株。
目前利用乳酸菌生物转化D-塔格糖的研究主要集中在三方面，一是筛选挖掘野生菌株中的L-AI基因并进行高效异源表达，为D-半乳糖异构化为D-塔格糖提供酶学基础[9-10]；二是开展L-AI酶学性质、酶分子改造、酶固定化等方面研究[11-13]，使其适应工业需求，提高D-塔格糖的产率；三是以产L-AI菌株为全细胞催化剂，通过系统优化全细胞催化条件强化D-半乳糖的异构化[14-15]。乳酸菌是一类公认安全的菌株，目前已发现部分能够产L-AI的乳酸菌，如短乳杆菌（Lactobacillus brevis）、清酒乳杆菌（Lactobacillus sakei）、发酵乳杆菌（Lactobacillus fermentum）等，对D-塔格糖的安全生产具有重要价值与意义。应碧等[16]从腌菜和泡菜中分离筛选出了一株高产D-塔格糖的乳酸菌，经鉴定为植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）WU14，其发酵粗酶液中L-AI酶活达到13.95 U/mL。王晓茹等[17]以菌体量和产酶量为依据，对产L-AI的短乳杆菌（L.brevis）发酵培养条件进行优化，结果表明，在初始pH 6.0、发酵温度37 ℃、发酵时间24 h条件下，菌株全细胞催化反应48 h，对9%D-半乳糖的转化率达到43%～44%。XU Z等[18]将来源于发酵乳杆菌（L.fermentum）CGMCC2921的L-AI进行克隆并异源表达于大肠杆菌（Escherichia coli）BL21（DE3）中，对重组酶进行纯化，研究结果表明，纯化的酶催化效率较高，D-半乳糖的转化数（kcat）/米氏常数（Km）为9.02 mmol/min，在1 mmol Mn2+存在情况下，65 ℃反应12 h，底物转化率高达55%。尽管目前已经发现多种能够产生L-AI的乳酸菌，但乳酸菌属于嗜温菌，其野生菌株的D-塔格糖产率普遍不高，所产的L-AI存在着稳定性较差，最适反应温度较低等问题，不能直接运用于工业生产中，因而需要对菌株生产D-塔格糖的各种条件进行优化，对其所产L-AI的性质进行探究，以期提高D-塔格糖产率，运用于D-塔格糖的工业生产中。
本研究以前期筛选到的L-AI产生菌发酵乳杆菌（Lactobacillus fermentum）C6为研究对象，采用单因素试验及正交试验对菌株C6的培养基及培养条件进行优化，并将菌株C6作为全细胞催化剂，对其生物转化D-塔格糖的全细胞催化反应条件及细胞透性化学处理方式进行研究，旨在开发一种安全高效的全细胞催化剂，获得其生产D-塔格糖的最优条件，提高D-塔格糖的产率，为后续利用全细胞催化法生产制备D-塔格糖提供理论与应用基础。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
发酵乳杆菌（Lactobacillus fermentum）C6：保藏于江西农业大学生物科学与工程学院。
D-塔格糖标准品（纯度＞99%）、D-半乳糖、L-阿拉伯糖（均为分析纯）：上海麦克林生化科技有限公司；盐酸、葡萄糖、磷酸氢二钾（均为分析纯）：西陇科学股份有限公司；间苯二酚（分析纯）：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；酵母浸粉、牛肉膏、蛋白胨（均为生化试剂）：北京奥博星生物技术有限责任公司；吐温-80（生化试剂）：上海申宇医药化工有限公司；硫胺素焦磷酸（thiamine pyrophosphate，TPP）（分析纯）：西格玛奥德里奇（上海）贸易有限公司。
MRS培养基：葡萄糖20 g、酵母浸粉5 g、牛肉膏10 g、蛋白胨10 g、乙酸钠5 g、柠檬酸氢二铵2 g、磷酸氢二钾2 g、吐温80 1 mL、无水硫酸镁0.58 g、硫酸锰0.25 g、蒸馏水1 000 mL、pH 6.5。115 ℃湿热灭菌30 min。
初始发酵培养基：葡萄糖5 g、酵母浸粉10 g、蛋白胨10 g、无水乙酸钠10 g、MgSO4·7H2O 0.4 g、MnSO4·2H2O 0.05 g、K2HPO4 0.4 g、L-阿拉伯糖（诱导剂）1 g、蒸馏水1 000 mL、pH 6.5。115 ℃湿热灭菌30 min。
1.2 仪器与设备
LDZX-50KBS立式高压蒸汽灭菌器：上海申安医疗器械厂；DK-8D三温三控水槽：上海博迅实业有限公司医疗设备厂；LXJ-IIB大容量低速离心机：上海安亭科学仪器厂；JW-3022HR医用离心机：安徽嘉文仪器装备有限公司；JY92-IIDN超声波细胞粉碎机：宁波新芝生物科技股份有限公司；HH-S21-4-S电热恒温水浴锅：上海新苗医疗器械制造有限公司；LRH-250A生化培养箱：广东泰宏君科学仪器股份有限公司；SpectraMax 190全波长酶标仪：美谷分子仪器（上海）有限公司。
1.3 实验方法
1.3.1 发酵乳杆菌C6的活化及发酵培养
将甘油管保藏的发酵乳杆菌C6按1%（V/V）接种量接入MRS培养基中，37 ℃培养12 h，再按2%（V/V）接种量转移到发酵培养基中，37 ℃发酵培养24 h，获得菌株C6的发酵液。
1.3.2 菌株C6全细胞催化剂制备
将50 mL发酵液常温下5 000 r/min离心10 min，用10 mL磷酸盐缓冲液（50 mmol/L，pH 7.0）洗涤菌体沉淀2次，离心除去上清液，所得菌体沉淀即为菌株C6全细胞反应催化剂。
1.3.3 全细胞催化反应体系
菌株C6的全细胞催化反应在50 mL离心管中进行，向其中加入2mL0.5mol/LD-半乳糖液（蒸馏水配制，含10mmol/L氯化锰），然后置于37 ℃水浴反应36 h。
1.3.4 发酵乳杆菌C6的发酵条件优化
（1）单因素试验
以最初始培养基成分及培养条件为基础，以D-塔格糖产率为评价指标，研究各发酵培养基成分（碳源、氮源、诱导剂、金属离子、生长因子）及各培养条件（反应温度、反应pH、装液量、接种量）对D-塔格糖产率的影响。发酵条件优化单因素试验设计见表1。
表1 发酵乳杆菌C6发酵条件优化单因素试验设计
Table 1 Design of single factor tests for Lactobacillus fermentum C6 fermentation conditions optimization
续表
（2）正交试验
在单因素试验的基础上，以D-塔格糖产率为评价指标，选取接种量（A）、诱导剂添加量（B）、初始pH值（C）、葡萄糖添加量（D）4个因素进行4因素3水平L9（34）的正交试验，正交试验因素及水平见表2。
表2 发酵乳杆菌C6发酵条件优化正交试验因素与水平
Table 2 Factors and levels of orthogonal experiments for Lactobacillus fermentum C6 fermentation conditions optimization
1.3.5 全细胞催化反应条件优化
以单因素试验及正交试验结果为基础，对菌株进行发酵培养，并制备全细胞催化剂，通过改变全细胞催化反应体系中反应温度（35 ℃、40 ℃、45 ℃、50 ℃、55 ℃、60 ℃、65 ℃、70 ℃、75 ℃）、反应pH（4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5）、金属离子种类（Cu2+、Mg2+、Mn2+、Ca2+、Fe2+）及浓度（0、5 mmol/L、10 mmol/L、15 mmol/L、20 mmol/L）、底物浓度（0.25 mol/L、0.50 mol/L、0.75 mol/L、1.00 mol/L、1.25 mol/L）及反应时间（12 h、24 h、36 h、48 h、60 h）、底物加入体积（2 mL、5 mL、10 mL、15 mL、20 mL、25 mL、30 mL），研究各因素对全细胞催化过程中D-塔格糖产率的影响，从而确定最优全细胞催化反应条件。试验所需缓冲液有醋酸盐缓冲液（pH 4.5～5.5）、磷酸盐缓冲液（pH 6.0～7.0）、Tris-HCl缓冲液（pH 7.5～8.5），缓冲液浓度均为50 mmol/L，调节反应液pH时，菌体沉淀洗涤及底物D-半乳糖配制应用同样pH值的缓冲液。
全细胞催化合成D-塔格糖：以最优发酵培养基及培养条件培养菌株，在最优全细胞催化反应条件下转化D-半乳糖，每隔8 h取样，测定菌体L-阿拉伯糖异构酶酶活及D-塔格糖产率，与初始全细胞催化反应条件对比，研究不同催化条件对菌体L-阿拉伯糖异构酶酶活及底物转化率的影响。
1.3.6 细胞透性化学处理方式优化
将50 mL菌体发酵液常温5 000 r/min离心10 min，离心除去上清液，向菌体沉淀中加入10 mL已知浓度的透性剂：2%甲苯、20%乙醇、20%丙酮、0.2%曲拉通、0.2%吐温80、0.2%二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）（所有试剂均用Tris-HCl缓冲液配制），重悬混匀，置于20 ℃静置处理20 min、40 min、60 min，对照加入等量缓冲液处理同等时间，处理完毕后常温离心去除上清液，使用Tris-HCl缓冲液洗涤菌体2次，获得透性化细胞，将其投入最优全细胞催化反应体系，转化时间24 h，反应结束后离心取上清测定D-塔格糖浓度，计算D-塔格糖产率。
1.3.7 D-塔格糖浓度及产率的测定
D-塔格糖浓度的测定采用间苯二酚法[19]：使用12%的稀盐酸配制1 mg/mL的间苯二酚溶液，取反应上清液25 μL，加蒸馏水稀释200倍至5 mL，加入等体积间苯二酚液，沸水浴30 min，冷却5 min，利用酶标仪测定反应液在波长400 nm处的吸光度值，用稀释200倍的底物为空白对照，以D-塔格糖质量浓度（X）为横坐标，吸光度值（Y）为纵坐标，绘制D-塔格糖标准曲线，获得标准曲线回归方程Y=0.004 9X+0.002 98，相关系数R2=0.999 7，确定D-塔格糖产率，其计算公式如下：
1.3.8 L-阿拉伯糖异构酶酶活的测定
收集菌体发酵液50 mL，于8 000 r/min冷冻离心5 min，去除发酵液上清，剩下的菌体沉淀使用Tris-HCl缓冲液（50 mmol/L，pH 7.5）洗涤2遍，最后用5 mL缓冲液重悬菌体。超声破碎（超声功率240 W，工作2 s，间歇2 s，破碎时间20 min）后10 000 r/min冷冻离心10 min，取上清液作为粗酶液测定酶活。酶活反应体系：0.5 mL粗酶液+0.5 mL D-半乳糖液，60℃反应1h，反应结束后100 ℃沸水浴5 min，10 000 r/min离心2 min，取上清液测定D-塔格糖的含量（μg/mL）。L-阿拉伯糖异构酶酶活定义为：每毫升酶液每分钟生成1 μg D-塔格糖定义为一个酶活力单位（U/mL）。
1.3.9 数据处理
所有试验均重复3次，试验结果以“平均值±标准差”表示，采用Excel 2019软件对试验数据进行分析处理，采用Origin 9.0软件对数据进行分析作图，采用DPS 7.05软件对正交试验结果进行方差分析。
2 结果与分析
2.1 发酵培养基成分对菌株C6D-塔格糖产率的影响
为制备获得性能优良的全细胞催化剂，对发酵乳杆菌C6的发酵培养基中碳源、氮源、诱导剂、生物素、金属离子的种类和浓度进行优化，结果见图1。
由图1a可知，固定碳源添加量为5 g/L，当碳源为葡萄糖时，D-塔格糖产率最高，为（13.71±0.20）%，说明葡萄糖最有利于菌株生产L-AI，转化D-半乳糖为D-塔格糖。因此，确定碳源为葡萄糖。
图1 发酵培养基成分对D-塔格糖产率的影响
Fig.1 Effect of fermentation medium composition on D-tagatose yield
不同字母表示组间差异显著（P＜0.05）。下同。
由图1b可知，葡萄糖添加量为2.5～7.5 g/L时，D-塔格糖产率逐渐增加；当葡萄糖添加量为7.5 g/L时，D-塔格糖产率达到最大值，为（12.69±0.13）%，葡萄糖添加量＞7.5 g/L时，D-塔格糖产率逐渐下降，这可能与L-阿拉伯糖操纵子有关。L-阿拉伯糖操纵子中araB、araA和araD基因（合称PBAD基因）分别编码阿拉伯糖代谢所需的和酮糖激酶、阿拉伯糖异构酶、核酮糖-5磷酸差向异构酶，它们的表达由操纵子中另一个基因araC产生的转录因子AraC蛋白调控，当葡萄糖浓度过高或者L-阿拉伯糖浓度过低时，菌体内环磷酸腺苷（cyclic adenosine monophosphate,cAMP）浓度低，转录因子AraC处于Pr形式（起阻遏作用），阻遏PBAD基因的转录，尽管菌体生长迅速但无法有效合成L-AI，反而致使塔格糖产率降低[20-21]。因此，确定碳源添加量为7.5 g/L。
由图1c可知，当氮源为酵母浸粉时，其D-塔格糖产率最高，为（13.17±0.12%），其次为蛋白胨，其D-塔格糖产率为（5.92±0.01%）。相对于无机氮源，有机氮源营养更加丰富，常常含有丰富蛋白质、肽类、游离氨基酸、脂肪等物质[22]。因此，确定氮源为酵母浸粉与蛋白胨（1∶1）。
由图1d可知，当酵母浸粉与蛋白胨（1∶1）添加量为10～40 g/L时，D-塔格糖产率逐渐增加；酵母浸粉与蛋白胨（1∶1）添加量为40 g/L时，D-塔格糖产率达到最大值，为（17.91±0.23%）；酵母浸粉与蛋白胨（1∶1）添加量＞40 g/L时，D-塔格糖产率逐渐下降。因此，确定酵母浸粉与蛋白胨（1∶1）添加量为40 g/L。
由图1e可知，当诱导剂L-阿拉伯糖添加量为0～2 g/L时，D-塔格糖产率逐渐增加；L-阿拉伯糖添加量为2 g/L时，D-塔格糖产率达最大值，为（16.93±0.39）%；L-阿拉伯糖添加量＞2 g/L时，D-塔格糖产率逐渐下降。少量添加诱导剂便能大大提升塔格糖产率，这可能是由于阿拉伯糖能够与AraC蛋白结合，使其变为Pi形式（激活状态），能够促进PBAD基因的转录[23]。因此，确定诱导剂添加量为2 g/L。
由图1f可知，当生物素添加量为0～100 μg/L时，D-塔格糖产率逐渐增加；生物素添加量为100 μg/L时，D-塔格糖产率达最大值，为（15.86±0.01）%；生物素添加量＞100 μg/L时，D-塔格糖产率下降至呈平稳趋势。因此，确定生物素添加量为100 μg/L。
由图1g可知，当硫胺素焦磷酸添加量为0～400 μg/L时，D-塔格糖产率逐渐增加；生物素添加量为400 μg/L时，D-塔格糖产率达最大值，为（15.04±0.03）%；生物素添加量＞400 μg/L时，D-塔格糖产率下降。研究表明，微量添加部分生长因子如生物素、硫胺素焦磷酸能够促进菌体细胞生长，进而提升塔格糖产率[24]。因此，确定硫胺素焦磷酸添加量为400 μg/L。
由图1h可知，锌离子提升D-塔格糖产率效果明显，其D-塔格糖产率为（17.68±0.14%）。其原因可能是，金属离子通常能影响酶活性进而影响底物转化率[25]，而其他二价金属离子均有不同程度的抑制作用。因此，确定金属离子为锌离子。
由图1i可知，当硫酸锌添加量为0～0.04 g/L时，D-塔格糖产率逐渐增加；硫酸锌添加量为0.04 g/L时，D-塔格糖产率最高，为（14.95±0.08）%；硫酸锌添加量＞0.04 g/L时，D-塔格糖产率下降。因此，确定硫酸锌添加量为0.04 g/L。
2.2 发酵条件对菌株D-塔格糖产率的影响
对发酵乳杆菌C6的发酵条件（培养温度、培养基初始pH值、装液量和接种量）进行优化，结果见图2。
图2 发酵条件对D-塔格糖产率的影响
Fig.2 Effect of fermentation conditions on D-tagatose yield
由图2a可知，在27～47 ℃范围内，随着培养温度在27～37 ℃范围内增加，D-塔格糖产率逐渐增加；培养温度为37 ℃时，D-塔格糖产率为（11.47±0.24）%；培养温度＞37 ℃时，D-塔格糖产率逐渐下降。因此，最适培养温度为37 ℃。由图2b可知，随着培养基初始pH值在4～8范围内的增加，D-塔格糖产率逐渐增加，说明其适应性较强，在酸性、中性及弱碱性环境都能正常生长。当pH值为8时，菌株D-塔格糖产率达到最大值，为（21.60±0.21）%。因此，最适发酵培养基的初始pH值为8。由图2c可知，装液量对D-塔格糖生成影响不大，其原因可能是，菌株C6是乳酸菌，属于兼性厌氧型细菌，对氧气需求量并不严格。因此，最适装液量为70 mL/150 mL。由图2d可知，随着接种量在1%～6%范围内的增加，D-塔格糖产率呈先升高后下降的趋势。当接种量为2%时，D-塔格糖产率为最高值，为（12.69±0.11）%。因此，最适接种量为2%。
2.3 发酵乳杆菌C6的发酵条件优化正交试验结果
在单因素试验的基础上，以D-塔格糖产率为评价指标，选择对D-塔格糖产率影响较大的因素葡萄糖质量浓度、诱导剂质量浓度、初始pH值、接种量，进行4因素3水平的正交试验设计，正交试验结果与分析见表3。
表3 发酵条件优化正交试验结果与分析
Table 3 Results and analysis of orthogonal experiments for fermentation conditions optimization
由表3可知，由R值可知，4个试验因素对D-塔格糖产率影响的大小顺序为：D（葡萄糖质量浓度）＞B（诱导剂质量浓度）＞C（初始pH值）＞A（接种量）。可见碳源质量浓度对底物转化率影响最大，是菌株发酵培养过程的关键因素；其次是诱导剂。正交试验结果表明，4因素最优理论组合为A1B3C1D3，即接种量1%、诱导剂质量浓度3 g/L、初始pH值7.5、葡萄糖质量浓度10 g/L。结合单因素试验结果，最终确定发酵乳杆菌C6的最优发酵培养基组成为：葡萄糖10 g/L，酵母浸粉20 g/L，蛋白胨20 g/L，无水乙酸钠10 g/L，MgSO4·7H2O 0.4 g/L，MnSO4·2H2O 0.05 g/L，K2HPO40.4 g/L，L-阿拉伯糖3 g/L，ZnSO4·7H2O 0.04 g/L，生物素100 μg/L，焦磷酸硫胺素400 μg/L；最优发酵条件为：培养温度37 ℃、初始pH值7.5、装液量70 mL/150 mL、接种量1%。
L-阿拉伯糖酶的生物合成属于生长偶联型[17，26]。当菌株发酵时间为24 h，此时菌体量及酶活水平都较高，OD600nm值达到1.25±0.01，酶活达到（107.81±3.22）U/mL，较初始条件（OD600nm值为0.65±0.01，酶活为（49.81±0.66）U/mL），分别提高了92.31%、116.44%，D-塔格糖产率达到（17.79±0.12）%，较初始条件（9.42±0.20）%提高89.05%。培养条件优化过后的各项指标均优于优化前。
2.4 发酵乳杆菌C6全细胞催化反应条件对D-塔格糖产率的影响
大部分生物催化反应中，因游离酶存在稳定性较差、制备困难、纯化工艺较复杂等缺陷，多数反应使用的是全细胞催化法，该法能维持细胞内部酶的稳定性与适应性，且无需进行复杂的酶纯化步骤，具有极大的开发价值[27-28]。以发酵乳杆菌C6为全细胞催化剂，对其全细胞催化反应过程中的反应温度、反应pH值、金属离子浓度、反应时间、底物体积进行研究，结果见图3。
图3 发酵乳杆菌C6全细胞催化反应条件优化
Fig.3 Optimization of Lactobacillus fermentum C6 whole-cell catalytic reaction conditions
由图3a可知，随着反应温度在35～60 ℃范围内的增加，D-塔格糖产率逐渐增大；当反应温度为60 ℃时，D-塔格糖产率达到最大值，为（27.16±0.23）%；当反应温度＞60 ℃时，D-塔格糖产率逐渐下降。因此，最适温度为60 ℃。这是因为L-AI催化反应过程是动态平衡反应，高温有利于平衡向D-塔格糖生成方向进行。工业酶一般要求热稳定要强，最适温度最好在60 ℃以上[29]，可见菌株C6所产的L-AI较符合工业要求，应用潜力较大。
由图3b可知，随着反应pH值在4.5～7.5范围内的增加，D-塔格糖产率逐渐增加；当反应pH值为7.5时，D-塔格糖产率达到最大值，为（34.50±0.08）%；当反应pH＞7.5时，D-塔格糖产率逐渐下降。因此，最适反应pH值为7.5。菌株C6最适反应pH值虽为7.5，但其耐酸性较强，在pH 5.5～7.0范围内底物转化率都比较高，符合工业要求。目前，D-塔格糖工业生产通常以乳糖为原料，其酶解为半乳糖的pH大概为5.0～6.0，为减少调节pH的过程以及副反应的产生，工业要求所用L-AI最适pH值为5.0～6.0[30]。
由图3c可知，随着Cu2+与Fe2+金属离子浓度的增加，D-塔格糖产率逐渐下降，随着Mg2+、Ca2+、Mn2+浓度在0～10mmol/L范围内的增加，D-塔格糖产率有所增加，当Mn2+浓度为10 mmol/L，D-塔格糖产率达到最大值，为（34.11±0.09）%；Mg2+、Ca2+、Mn2+浓度＞10 mmol/L，D-塔格糖产率逐渐下降。因此，最适金属离子为Mn2+（10 mmol/L）。金属离子的添加浓度必须适量，添加高浓度的金属离子不仅会增加工业生产成本，更不利于D-塔格糖后期纯化处理[31]。
对于单一酶反应来说，底物浓度影响着酶促反应速率且遵循米氏方程规律，当底物浓度远小于Km（米氏常数）时，增加底物浓度，反应速度增加，当底物浓度＞Km时，反应速度便不会增加[32]。由图3d可知，随着反应时间在12～36 h范围内的增加，D-塔格糖产率呈升高的趋势；当反应时间＞36 h，D-塔格糖产率逐渐平稳，当反应时间为36 h时，0.5 mmol/L的底物浓度条件下，D-塔格糖产率为（36.10±0.27）%。因此，最适底物浓度为0.5 mol/L。
由图3e可知，当底物浓度一定时，随着底物体积在2～30 mL范围内的增加，底物转化率随之减小，底物加入体积为2 mL时，D-塔格糖产率达到最大值，为（34.74±0.15）%，说明菌体胞内酶对底物的转化能力有限。
2.5 发酵乳杆菌C6全细胞催化生产D-塔格糖的动态变化
分别在初始和优化后的发酵乳杆菌C6全细胞催化反应条件下，测定并对比了催化反应过程中D-塔格糖及L-AI时序性动态变化，结果见图4。
由图4可知，初始反应条件下，反应时间在0～24 h范围内，D-塔格糖产率增长较快，在2～32 h范围内，D-塔格糖产率变化不大，32～40 h范围内，D-塔格糖产率略有上升，40～48 h范围内，D-塔格糖产率略微下降趋于稳定，该条件下，菌体D-塔格糖产率最大值为（20.63±0.16）%。最优反应条件下，反应时间在0～24 h范围内，D-塔格糖产率增长较快，反应时间＞24 h时，D-塔格糖产率趋于稳定，24～48 h范围内，D-塔格糖产率稍微下降，反应时间＞24 h时，D-塔格糖产率达到最大值，为（43.41±0.48）%。结果表明，菌株C6所产L-AI催化D-半乳糖转化为D-塔格糖的反应属于可逆反应，这与有关L-AI催化生产D-塔格糖的研究报道相符[33]，且优化后的反应条件相较初始条件更利于菌株转化D-半乳糖为产物，D-塔格糖产率达到最大值，达到（43.41±0.48）%，相较初始反应条件提高了110.42%。在两种条件下，菌体酶活均随时间延长不断下降，但优化反应条件下的酶活显著高于初始条件，且酶活下降速率更慢，这说明优化反应条件在一定程度上增强了酶的稳定性，减缓了酶活下降速度。
2.6 发酵乳杆菌C6细胞透性化学处理方式优化
由于细胞屏障的阻碍作用，全细胞催化速率不如游离酶。为提高催化效率，研究者利用细胞透性化技术打破细胞屏障，提高细胞壁与细胞膜渗透性，促进底物与酶接触反应，以达到提高全细胞催化效率的目的。微生物所产的L-阿拉伯糖异构酶多为胞内酶[34]，因此透性细胞对于D-塔格糖产率的提高可能具有促进作用。化学渗透剂对菌株产D-塔格糖的影响见图5。
图5 发酵乳杆菌C6全细胞催化反应过程
Fig.5 Process of Lactobacillus fermentum C6 whole-cell catalytic reaction
图5 化学渗透剂对D-塔格糖产率的影响
Fig.5 Effect of chemical penetrant on D-tagatose yield
由图5可知，随着处理时间的延长，D-塔格糖产率均逐渐增加，当处理时间为60 min时，在影响D-塔格糖产率的6种化学渗透剂中，20%丙酮透性细胞效果最好，D-塔格糖产率可达（45.07±0.89）%。此现象表明随着丙酮等渗透剂处理时间的延长，各种化学透性剂充分与细胞接触，穿过细胞壁与细胞膜脂质反应，破坏细胞膜结构与流动性，致使细胞透性增强，有利于底物与胞内酶的接触，提高渗透细胞的底物转化能力[35]。张华等[36]利用2%～5%的甲苯制备透性化植物乳酸杆菌细胞转化D-半乳糖，反应96 h后，底物转化率达到42%，透性细胞表观酶活力最大值达到9.3 U。
3 结论
利用前期筛选得到的一株能够产生L-阿拉伯糖异构酶的发酵乳杆菌C6为全细胞催化剂，以菌株生物量（OD600nm值）及D-塔格糖产率为评价指标，采用单因素试验及正交试验得到菌株C6的最优培养基为：葡萄糖10 g/L、酵母浸粉20 g/L、蛋白胨20 g/L、无水乙酸钠10 g/L、MgSO4·7H2O 0.4 g/L、MnSO4·2H2O 0.05 g/L、K2HPO4 0.4 g/L、L-阿拉伯糖3 g/L、ZnSO4·7H2O 0.04 g/L、生物素100 μg/L、焦磷酸硫胺素400 μg/L；最优培养条件为：培养温度37 ℃、初始pH值7.5、装液量70 mL、接种量1%、培养时间24 h，在此最优条件下，OD600nm值为1.25和L-阿拉伯糖异构酶酶活为107.81 U/mL，较优化前分别提高了92.31%和116.44%，为制备性能优良的全细胞催化剂提供了基础。发酵乳杆菌C6全细胞最优催化反应条件为：反应温度60 ℃、反应pH值7.5、Mn2+10 mmol/L、底物浓度0.5 mol/L、底物加入体积2 mL，反应时间24 h；最优细胞透性处理方式为20%丙酮处理60 min，在此条件下，D-塔格糖产率达到（45.07±0.89）%。发酵乳杆菌C6胞内酶L-阿拉伯糖异构酶在全细胞催化反应所体现的各项性质，如最适温度、pH、底物等，为该酶的后续开发利用及全细胞规模化制备D-半乳糖提供了一定的理论依据。
[1] ZHAN Y J,XU Z,LI S,et al.Coexpression of β-D-galactosidase and L-arabinose isomerase in the production of D-tagatose:a functional sweetener[J].J Agr Food Chem,2014,62(11):2412-2417.
[2]梁敏，翟娅菲，邹洋，等.新型甜味剂塔格糖的应用及生产[J].食品与药品，2011，13（3）：125-128.
[3] LU Y,LEVIN G V,DONNER T W.Tagatose,a new antidiabetic and obesity control drug[J].Diabetes Obes Metab,2010,10(2):109-134.
[4]沐万孟，张涛，江波，等.D-塔格糖与L-阿拉伯糖异构酶的研究进展[J].食品与发酵工业，2007，33（6）：84-90.
[5]陈洲，李子杰，李爱民，等.生物法合成稀有己酮糖的研究进展[J].生物产业技术，2018，6：40-48.
[6] YOON S H,KIM P,OH D K.Properties of L-arabinose isomerase from Escherichia coli as biocatalyst for tagatose production[J].World J Microb Biot,2003,19(1):47-51.
[7]PRABHU P,TIWARI M K,JEYA M,et al.Cloning and characterization of a novel L-arabinose isomerase from Bacillus licheniformis[J].Appl Microbiol Biot,2008,81(2):283-290.
[8]KIM H J,OH D K.Purification and characterization of an L-arabinose isomerase from an isolated strain of Geobacillus thermodenitrificans producing D-tagatose[J].J Biotechnol,2005,120(2):162-173.
[9] DU M G,ZHAO D Y,CHENG S S,et al.Towards efficient enzymatic conversion of D-galactose to D-tagatose:purification and characterization of L-arabinose isomerase from Lactobacillus brevis[J].Bioproc Biosyst Eng,2019,42(1):107-116.
[10]XU Z,QING Y J,LI S,et al.A novel l-arabinose isomerase from Lactobacillus fermentum CGMCC2921 for D-tagatose production: Gene cloning,purification and characterization[J].J Mol Catal B: Enzym,2011,70(1-2):1-7.
[11]ZHANG G Y,AN Y F,PARVEZ A,et al.Exploring a highly D-galactose specific L-arabinose isomerase from Bifidobacterium adolescentis for D-tagatose production[J].Front Bioeng Biotech,2020,8:377.
[12] JAYARAMAN A B,KANDASAMY T,VENKATARAMAN D,et al.Rational design of Shewanella sp.l-arabinose isomerase for d-galactose isomerase activity under mesophilic conditions[J].Enzyme Microb Tech,2021(147):109796.
[13] SHIN K C,SIM D H,SEO M J,et al.Increased production of foodgrade D-tagatose from D-galactose by permeabilized and immobilized cells of Corynebacterium glutamicum,a GRAS host,expressing D-galactose isomerase from Geobacillus thermodenitrificans[J].J Agr Food Chem,2016,64(43):8146-8153.
[14]高文旭.D-塔格糖生产菌发酵工艺条件的研究[D].大连：大连工业大学，2018.
[15]孙志军，陈文薪，凌锦，等.高产D-塔格糖植物乳杆菌WU14的L-阿拉伯糖异构酶发酵培养基优化[J].食品科技，2019，44（5）：24-32.
[16]应碧，张艳丽，周通，等.高产D-塔格糖植物乳杆菌WU14的筛选与鉴定[J].中国饲料，2015，4：17-20.
[17]王晓茹，杜梦鸽，胡木子，等.Lactobacillus brevis D-tag1产L-阿拉伯糖异构酶的条件优化[J].大连工业大学学报，2021，40（3）：171-174.
[18] XU Z,LI S,LIANG J F,et al.Protein purification,crystallization and preliminary X-ray diffraction analysis of L-arabinose isomerase from Lactobacillus fermentum CGMCC2921[J].Acta Crystallogr F,2015,71(1):28-33.
[19]徐磊，赵东莹，王一倩，等.间苯二酚法测定D-塔格糖含量[J].大连工业大学学报，2017，36（3）：168-170.
[20]徐煜，蒋德意，韩迪.植物乳杆菌Lp-G18谷氨酰胺合成酶活力发酵工艺优化[J].乳业科学与技术，2022，42（2）：13-17.
[21]程丽芳，沐万孟，张涛，等.微生物来源的L-阿拉伯糖异构酶的研究进展及应用前景[J].微生物学通报，2008，35（10）：1626-1632.
[22]杜丽红，郝亚男，陈宁，等.有机氮源及其在微生物发酵中的应用[J].发酵科技通讯，2019，48（1）：1-4.
[23] GREENBLATT J,SCHLEIF R.Arabinose C protein: regulation of the arabinose operon in vitro[J].Nature New Biol,1971,233(40):166-170.
[24]雷剑芬，陆可，冯今亮，等.生长因子用量对缬氨酸发酵的影响[J].发酵科技通讯，2002，31（1）：18-19.
[25]李彦君.L-阿拉伯糖异构酶的克隆表达及酶学性质研究[D].天津：天津科技大学，2011.
[26]孙志军.植物乳杆菌WU14的L-AI发酵工艺研究及其分子改良[D].南昌：江西农业大学，2019.
[27]周祺，吕雪芹，柴雪莹，等.枯草芽孢杆菌全细胞催化高效合成α-熊果苷[J].食品与发酵工业，2021，47（22）：1-7.
[28]肖源，张同，杨之帆，等.重组地衣芽胞杆菌全细胞催化合成淫羊藿次苷D2[J].武汉科技大学学报，2021，44（6）：438-444.
[29]程丽芳.解纤维热酸菌L-阿拉伯糖异构酶的克隆表达，性质研究及分子改造[D].无锡：江南大学，2010.
[30]徐铮，李贵祥，李莎，等.生物法生产D-塔格糖的研究进展[J].生物加工过程，2013，11（4）：64-71.
[31]梅文鼎.Bacillus coagulans NL01 L-阿拉伯糖异构酶的理性设计及D-塔格糖制备[D].南京：南京林业大学，2016.
[32]邹刚华，赵凤亮，单颖，等.亚热带稻田土壤反硝化动力学参数估算[J].土壤，2019，51（3）：517-523.
[33]秦丽红.利用乳酸菌L-阿拉伯糖异构酶生产D-塔格糖的研究[D].济南：山东大学，2021.
[34]翁玮慧，张华，江波.L-阿拉伯糖异构酶粗酶性质及其生物合成塔格糖的研究[J].食品工业科技，2006，27（1）：158-162.
[35]王珊.产脂肪酶微生物细胞的透性化及固定化研究[D].大连：大连工业大学，2010.
[36]张华，江波，潘蓓蕾，等.透性化植物乳酸杆菌细胞L-阿拉伯糖异构酶表观活力的研究[J].食品与发酵工业，2006，32（10）：17-19.