豆酱是一种以黄豆为主发酵的酱[1-2]。现代豆酱通常会辅以面粉，用来调整豆酱的风味，制曲时有利于霉菌繁殖。制曲是多种微生物和酶协同作用的过程，也是决定豆酱风味和品质的关键。因此要将制曲作为关键控制点严格控制，以保证产品品质[3-5]。在豆酱制曲过程中，成曲的质量受众多因素影响，包括原料的配比、米曲霉添加量、制曲温度以及制曲时间等[1，6-8]。
银杏（Ginkgo biloba）果是指除去外种皮的白色种核[9]。银杏果多被加工成休闲食品，但其中所含的银杏酸等限制其加工和贮藏[10]。银杏果在中医方面起到很重要的作用，可对早期阿尔兹海默症和多发性梗死痴呆患者有益，也有报道称银杏对舒张血管和降低胆固醇有显著作用[11-13]。银杏果含有黄酮类、萜类、生物碱、银杏内酯等，不但能够增强人体抗疲劳、延缓衰老能力，还具有提高机体耐缺氧和免疫调节的作用[10，14-17]。
因此，本试验以黄豆、面粉、银杏为原料，选用米曲霉As3.951进行制曲，制备银杏豆酱。探究米曲霉添加量、原料配比、制曲温度及制曲时间对酱曲中蛋白酶活力的影响，筛选出更好适合米曲霉生长的条件，采用单因素及响应面试验对银杏豆酱的制曲工艺进行研究，为银杏酱工业化生产提供技术支持，丰富市场以满足更多消费者需求。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
银杏、黄豆、面粉：市售；米曲霉（Aspergillus oryzae）As3.951（沪酿3.042）：购自锦润生物企业店。
磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、干酪素、氢氧化钠、酪氨酸（均为分析纯）：国药集团化学试剂有限公司；福林酚（分析纯）：上海麦克林生化科技有限公司。其他试剂均为国产分析纯。
1.2 仪器与设备
LRH-70型培养箱：上海一恒科学仪器有限公司；TGL-18C型离心机：上海安亭科学仪器厂；V-1800型可见光分光光度计：上海美谱达仪器有限公司；PHS-3C型pH计：上海仪电科学仪器股份有限公司。
1.3 方法
1.3.1 银杏豆酱的制曲工艺流程与操作要点
银杏粉的制备：一定量的银杏置于微波炉中进行加热，700 W火力加热1 min，放凉后对其进行剥壳、去除内芯和衣等操作。利用压力锅进行蒸煮，设置为121 ℃，25 min。无菌条件下将银杏进行放凉，然后在烘箱中干燥10 h，用粉碎机进行粉碎，即得银杏粉。
操作要点：黄豆经水洗浸泡12 h后，挑选完整颗粒。然后将黄豆在121 ℃下蒸煮45 min。取冷却后的黄豆50 g，拌入80%银杏粉，蒸煮一定时间，加入20%面粉，于一次性饭盒中，接入0.9%米曲霉曲精，加入30 mL水拌匀摊平。将酱曲置于恒温培养箱中30 ℃培养42 h，中间翻曲一次。若成曲无灰黑绒毛夹心且呈黄绿色即可[18]。
1.3.2 蛋白酶活力的测定
称取打碎的10 g成曲（精确至0.01 g），加100 mL的pH7.5磷酸缓冲液，在40 ℃水浴中浸出30 min，用快速滤纸过滤后按照参考文献[19]及GB/T 28715—2012《饲料添加剂酸性、中性蛋白酶活力的测定》[20]测定蛋白酶活力并进行调整。在适合的pH与温度的条件下，用酱曲中的酪蛋白作为反应的底物与酶液发生分解反应，反应一段时间以后，加入三氯乙酸，使反应停止，并且沉淀未反应完的酪蛋白，使酪蛋白与反应产物分开。过滤、加入适量碳酸钠，加福林试剂，产生蓝色，用分光光度计测定。蛋白酶活力定义为1 g干曲在一定条件下，1 min水解酪蛋白生成酪氨酸的微克数为1个酶活单位（U/g）。
1.3.3 银杏豆酱制曲工艺优化
（1）单因素试验
改变单一变量，设定银杏与面粉质量比分别为5∶0、4∶1、3∶2、2∶3、1∶4，米曲霉添加量分别为0.3%、0.5%、0.7%、0.9%、1.1%，制曲时间分别为36 h、42 h、48 h、54 h、60 h，制曲温度分别为26 ℃、28 ℃、30 ℃、32 ℃、34 ℃。分别考察原料质量比、米曲霉添加量、制曲温度及制曲时间对成曲蛋白酶活力的影响[21]。
（2）Box-Behnken响应面试验
在单因素试验基础上，以米曲霉添加量（A）、制曲温度（B）、制曲时间（C）为主要考察因素，以成曲中蛋白酶活力（Y）为评价指标，设计3因素3水平响应面试验，Box-Behnken试验因素与水平见表1。
表1 制曲工艺优化Box-Behnken试验因素与水平
Table 1 Factors and levels of Box-Behnken experiments for koji-making technology optimization
1.3.4 数据处理及分析
采用Design-Expert 8.0.6处理响应面试验结果，SPSS 21.0对数据进行显著性分析，Excel 2003进行绘图整理。所有试验重复3次。
2 结果与分析
2.1 单因素试验结果
2.1.1 银杏与面粉质量比对成曲中蛋白酶活力的影响
银杏与面粉质量比对成曲中蛋白酶活力的影响见图1。由图1可知，蛋白酶活力随着面粉比例的增加先升高后降低，银杏与面粉质量比为4∶1时，酶活性最高，此时发酵环境适宜微生物生长，以满足微生物生长繁殖的需要。随着面粉含量的不断增加，蛋白质降解产物中的氨基酸会发生美拉德反应，消耗微生物生长所需的部分营养物质，从而降低酶的活性[17，22-24]。综合考虑选择银杏与面粉质量比为4∶1。
图1 银杏与面粉质量比对成曲中蛋白酶活力的影响
Fig.1 Effect of mass ratio of ginko and flour on protease activities in koji
不同字母表示组间差异显著（P＜0.05）。下同。
2.1.2 米曲霉添加量对成曲中蛋白酶活力的影响
米曲霉添加量对成曲中蛋白酶活力的影响见图2。由图2可知，随着米曲霉添加量在0.3%～0.9%范围内的增大，成曲中蛋白酶的活力值逐渐增大；当接种量为0.9%时酶活性最高；当接种量＞0.9%时，这可能是由于接种量过高，产生的米曲霉数量过多，过多的消耗了环境中的营养物质，使得米曲霉在分泌蛋白酶的过程中营养物质供应不足，菌丝体较早衰老退化从而分泌蛋白酶的速度减慢[25-26]。因此，在进行响应面试验时选取米曲霉添加量为0.7%、0.9%、1.1%。
图2 米曲霉添加量对成曲中蛋白酶活力的影响
Fig.2 Effect of Aspergillus oryzae addition on protease activities in koji
2.1.3 制曲温度对成曲中蛋白酶活力的影响
制曲温度对成曲中蛋白酶活力的影响见图3。由图3可知，随着制曲温度在26～30 ℃范围内的升高，蛋白酶活力呈现上升的趋势。当制曲温度为30 ℃时，蛋白酶活力最大，为136.88 U/g，此时的温度最适合；当温度＞30 ℃时，蛋白酶活力减弱。由于制曲是一个开放的过程，温度过高易滋生其他杂菌，菌体的生长优劣直接影响产酶量。因此，选择28 ℃、30 ℃、32 ℃进行响应面试验。
图3 制曲温度对成曲中蛋白酶活力的影响
Fig.3 Effect of koji-making temperature on protease activities in koji
2.1.4 制曲时间对成曲中蛋白酶活力的影响
制曲时间对成曲中蛋白酶活力的影响见图4。由图4可知，随着培养时间的延长，米曲霉利用营养物质不断地生长繁殖，造成蛋白酶的积累增加。当制曲时间在36～48 h时，酱曲中蛋白酶活力呈现增大的趋势；当制曲时间为48 h时酶活性最高；制曲时间＞48 h以后，蛋白酶活力开始逐渐降低，这是由于当米曲霉菌体生长到一定阶段时开始产生大量的孢子，米曲霉菌丝体开始分化，分泌蛋白酶的速度减慢从而导致蛋白酶活力下降[25]。因此，选择42 h、48 h、54 h用于后续的响应面试验。
图4 制曲时间对成曲中蛋白酶活力的影响
Fig.4 Effect of koji-making time on protease activities in koji
2.2 响应面试验结果
2.2.1 响应面试验方案及结果
根据响应面Box-Behnben试验的原理，固定银杏∶面粉质量比为4∶1，选取米曲霉添加量（A）、制曲温度（B）、制曲时间（C）为试验因素，以蛋白酶活力（Y）为响应值进行响应面试验设计，设计方案及结果见表2。
表2 制曲工艺优化Box-Behnben试验结果与分析
Table 2 Results and analysis of Box-Behnken experiments for koji-making technology optimization
通过Design Expert 8.0.6软件中的Box-Behnben Design模型对表2中数据进行二次响应面回归拟合，得到成曲中蛋白酶活力与3个因素之间的回归方程：Y=297.14-7.91A+8.35B-18.59C-6.08AB+12.28AC+5.17BC-11.03A2-51.09B2-22.36C2。
2.2.2 回归模型方差分析
通过软件Design-Expert 8.0.6对试验结果进行方差分析，以验证回归模型与因素的显著性，方差分析见表3。
表3 回归模型方差分析
Table 3 Variance analysis of regression model
续表
注：“*”表示对结果影响显著（P＜0.05），“**”表示对结果影响极显著（P＜0.01）。
由表3可知，二次多项式回归模型P＜0.000 1，说明该回归模型极显著，决定系数R2=99.13%＞85%，拟合程度较好，试验误差小，该回归方程可以代替试验真实点对银杏豆酱的制曲试验结果进行分析和预测。失拟项P 值=0.059 2＞0.05，说明失拟项不显著。根据F值可知，3个因素对成曲蛋白酶活力的影响从大到小依次为C（制曲时间）、B（制曲温度）、A（米曲霉添加量）。由P 值可知，一次项A、B、C、交互项AC及二次项A2、B2、C2对结果影响极显著（P＜0.01）。交互项AB对蛋白酶活力的影响均显著（P＜0.05）。其他项对酶活的影响不显著（P＞0.05）。
2.2.3 响应面分析
采用Design Expert 8.0.6软件绘制各因素对成曲中蛋白酶活力的响应面分析图及等高线图见图5。考察所拟合的响应面形状，分析米曲霉添加量、制曲温度和制曲时间对蛋白酶活力的影响。响应面越陡则说明该试验中的某一因素对蛋白酶活力的影响越大，等高线近似于一个椭圆形，那么就表示这两个因素的交互作用越强[27-28]。由图5可知，随着米曲霉添加量和制曲温度的增加，蛋白酶活力呈现先增加后减小的趋势，且其等高线偏椭圆形，判断米曲霉添加量和制曲温度之间的交互作用显著（P＜0.05）；随着米曲霉添加量和制曲时间的提高，蛋白酶活力呈现先增大后减小的趋势，等高线图呈椭圆形，说明米曲霉添加量和制曲时间存交互作用显著（P＜0.05）；制曲时间和制曲温度交互作用的等高线呈偏圆形，表明两个因素之间有一定的交互作用但不显著（P＞0.05），这与回归方程分析的结果是一致的。
图5 各因素间相互作用对蛋白酶活力影响的响应面及等高线
Fig.5 Response surface plots and contour lines of effects of interaction between each factor on protease activities
依据Design Expert 8.0.6软件对响应面试验进行优化分析，得到最佳工艺条件：米曲霉添加量0.76%，制曲温度30.19 ℃，制曲时间44.38 h。蛋白酶活力的理论值为305.975 U/g。考虑实际操作，将上述最佳发酵条件修正为米曲霉添加量0.8%，制曲温度30 ℃，制曲时间44 h，该条件下进行3次平行试验，测得成曲中蛋白酶活力实际值为305.96 U/g，相对误差为0.004%，说明回归方程与实际情况拟合较好。
3 结论
在单因素试验基础上，利用响应面法对银杏豆酱制曲工艺进行了优化，得到最优的工艺条件：米曲霉添加量0.9%，制曲温度30 ℃，制曲时间44 h。该条件下测得成曲中蛋白酶活力为305.96 U/g。本研究为银杏豆酱的发展奠定了理论基础，为银杏的综合利用提供了一种新的方向，所得银杏豆酱生产成本低廉，工艺简单，有实际应用价值。
[1]高雅文，徐静源，李鸿梅.响应面试验优化东北黄豆酱制曲工艺[J].中国酿造，2017，36（6）：95-98.
[2]包启安.豆酱的功能性[J].中国酿造，2002，21（3）：1-6.
[3]胡文康，孙莉，熊坤，等.响应面法优化紫苏豆酱的制曲工艺[J].中国酿造，2018，37（5）：193-197.
[4]李志方，钱亚飞，刘思思，等.多菌株制曲混合发酵制备龙香芋酱工艺优化[J].中国酿造，2021，40（8）：139-144.
[5]李燕，焦爱权，孙言.基于挤压膨化的蚕豆酱成曲蛋白酶活力测定及其工艺优化[J].食品工业科技，2018，39（23）：203-209.
[6]ELFALLEH W,SUN C,HE S,et al.Changes in enzymatic activities during"koji" incubation and natural fermentation of soybean paste[J].J Food Process Preservat,2017,41(6):1-7.
[7]XIE C,ZENG H,QIN L.Physicochemical,taste,and functional changes during the enhanced fermentation of low-salt sufu paste,a Chinese fermented soybean food[J].Int J Food Propert,2018,21(1):2714-2729.
[8]吴拥军.酱（豉）香风味的研究进展[J].山地农业生物学报，2018，37（6）：1-10.
[9]周晓辉，王瑱，邱立娟.银杏白果提取物抗氧化及抗菌研究[J].时珍国医国药，2018，29（3）：577-580.
[10] WANG H Y,ZHANG Y Q.The main active constituents and detoxification process of Ginkgo biloba seeds and their potential use in functional health foods[J].J Food Compos Anal,2019,83:103247.
[11]HUI M A,BO-HAN L I,ZHU M L,et al.Study on the extraction process of ginkgolic acid from seed coat of Ginkgo biloba using alkaline extraction and acid precipitation[J].J Bengbu Medical College,2019,44(9):1264-1267.
[12]邱福祥，谢懿涵，阮威威，等.银杏叶黄酮的富集及抗氧化活性的研究[J].食品工程，2018（4）：43-48.
[13]ZHANG S L,LEI J H,DU X D,et al.Preparation of healthy beverage from fresh sarcotestas of Ginkgo biloba[J].Storage Process,2018,18(3):92-96.
[14]ZHENG Y F,KAN H F,YANG Y,et al.Optimization of content determination method of total ginkgolic acid in compound Ginkgo biloba preparation[J].Modern Chinese Med,2018,20(10):1282-1287.
[15] ESIN R,ESIN O,KHAYRULLIN I.Influence of standardized extract Ginkgo biloba EGb761 towards quality of life indicators in patients with diabetes mellitus type 2[J].Bionanoscience,2018,8(3):916-923.
[16]BOATENG I D,YANG X.Effect of different drying methods on product quality,bioactive and toxic components of Ginkgo biloba L.seed[J].J Sci Food Agr,2020,8:3290-3297.
[17] KANG H.Hypocholesterolemic effect of Ginkgo biloba seeds extract from high fat diet mice[J].Biomed Sci Lett,2017,23(2):138-143.
[18]续丹丹，王文平，王鹏，等.黑豆酱与黄豆酱品质分析及挥发性风味化合物比较[J].中国酿造，2018，37（11）：30-35.
[19]郑东影，陈玮，张卫卫.福林酚法测定酿酒白曲酸性蛋白酶活力的条件试验[J].酿酒，2020，47（2）：63-66.
[20]中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局，中国国家标准化管理委员会.GB/T 28715—2012 饲料添加剂酸性、中性蛋白酶活力的测定分光光度法[S].北京：中国标准出版社，2012.
[21]许彬，李慧星，李斌.响应面法优化杏鲍菇曲制曲条件[J].中国酿造，2017，36（10）：114-119.
[22]刘云珍，许喜林，刘永琪.豆瓣酱制曲工艺条件优化[J].中国酿造，2016，35（11）：108-111.
[23]古小露.复合菌发酵豆酱的研究[D].成都：西华大学，2018.
[24]赵文婷，王颖，邱璠.加工工艺及添加面粉发酵对豆酱抗氧化能力和抗氧化成分的影响[J].中国酿造，2011，30（6）：23-26.
[25]胡雅雯.鲜香糯豆酱加工工艺的研究及优化[D].沈阳：沈阳农业大学，2016.
[26]李燕.基于挤压蒸煮技术的蚕豆酱酿造及其品质分析[D].无锡：江南大学，2019.
[27]毕景硕.鹿骨多肽螯合钙的制备方法与吸收的特性研究[D].长春：吉林大学，2018.
[28]程洋洋，惠靖茹，郝竞霄.响应面优化香菇柄发酵酱糕的制曲工艺[J].中国酿造，2021，40（2）：150-153.