金刺梨（Rosa sterilis）作为贵州省安顺市特产，是一种早产高产、生长旺盛的果树，其果实营养价值丰富。成熟的金刺梨果实气香味酸甜，果肉肉质丰厚，可食用维生素C（vitamin C，VC）含量达899.5 mg/100 g，超氧化歧化酶（superoxide dismutase，SOD）含量达12 249 U/mL，还富含黄酮[1]、胡萝卜素及10余种对人体有益的矿物质元素、20多种氨基酸，其中抗白血病的天门冬氨酸含量阈值超过1[2]，被誉为“肠道清道夫”、“血管清道夫”[3]。研究表明，金刺梨果汁能显著降低重金属引起的氧化损伤，减少镉、锰、砷对人体的损伤，并促进这些元素的排泄。总体来说，金刺梨具有很高的营养价值和多种医疗保健作用[4]，同时具有很高的开发利用价值。
酵素主要是以新鲜蔬菜、水果等为原料，经过榨汁、萃取等一系列工艺后，再经微生物发酵所产生的含有丰富营养成分以及一些重要酶类等生物活性物质的混合发酵液[5]。近年来，酵素是非常流行的功能性食品，经过益生菌发酵能生成具有美白、抗氧化、调节肠道微生物菌群等多种保健功能[6-8]的代谢产物。部分乳酸菌在发酵饮料中也有一定降血清、降胆固醇等益生功能，对人体健康水平有益[9-11]。本研究利用乳酸菌发酵剂发酵金刺梨汁制备酵素，通过响应面法优化乳酸菌发酵金刺梨酵素工艺条件，并对其品质指标及抗氧化活性进行分析，为金刺梨酵素发酵工艺的产业化开发提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
1.1.1 试验材料
100%金刺梨原汁：贵州天赐贵宝食品有限公司。
1.1.2 菌株
乳酸菌发酵剂（植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）∶短乳杆菌（Lactobacillus brevis）=2∶1）：贵州大学生命科学学院微生物实验室。
1.1.3 试剂
芦丁、亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）、冰醋酸、草酸、抗坏血酸、碳酸氢钠、2,6-二氯酚靛酚、福林酚、碳酸钠、无水乙醇、没食子酸（均为分析纯）：赛兰博科技有限公司；蒸馏水：本实验室自制；白砂糖：市售。
1.1.4 培养基
MRS培养基：蛋白胨10 g，牛肉膏10 g，葡萄糖20 g，柠檬酸钠2 g，乙酸钠2 g，硫酸镁0.58 g，硫酸镁0.25 g，磷酸氢二钾2 g，吐温-80 1 mL，蒸馏水1 000 mL，pH 6.28±0.06，121 ℃灭菌30 min。
1.2 仪器与设备
SW-CJ-IFD型单人单面净化工作台：苏州净化科技有限公司；SHP-250型立式压力蒸汽灭菌锅：上海申安仪器有限公司；HPX-9082MBE电热恒温培养箱：江苏省科学器材有限公司；FA2204N型精密电子天平：上海菁海科技有限公司；PHS-3C精密酸度计：上海大普仪器有限公司；SKY-2112B恒温振荡培养箱：上海达平仪器有限公司；DK-98-II型电热恒温水浴锅：天津市泰斯特仪器有限公司。
1.3 试验方法
1.3.1 金刺梨汁的制备
金刺梨原汁与蒸馏水按3∶7（V/V）的比例混合，在71 ℃、10 min条件下进行巴氏灭菌[12]。
1.3.2 金刺梨酵素发酵工艺优化单因素试验
固定发酵温度37 ℃，发酵时间48 h，白砂糖添加量6%，乳酸菌发酵剂接种量3%；分别考察乳酸菌发酵剂接种量（1%、2%、3%、4%、5%）、发酵温度（33 ℃、35 ℃、37 ℃、39 ℃、41 ℃）、发酵时间（12 h、24 h、36 h、48 h、60 h、72 h、84 h）、白砂糖添加量（2%、4%、6%、8%、10%）对金刺梨酵素品质的影响。
1.3.3 金刺梨酵素发酵工艺优化Box-Behnken试验设计
为确定金刺梨酵素最佳发酵工艺参数，在单因素试验的基础上，选择乳酸菌发酵剂接种量（A）、发酵温度（B）、发酵时间（C）、白砂糖添加量（D）为影响因素，以感官评分（Y）为响应值，根据Box-Behnken中心组合设计原理，运用Design-Expert 8.6.0.1软件设计响应面试验，考察各因素交互作用对金刺梨酵素感官评分的影响，响应面试验因素与水平见表1。
表1 金刺梨酵素发酵工艺优化响应面试验因素与水平
Table 1 Factors and levels of response surface experiments for Rosa sterilis Jiaosu fermentation process optimization
1.3.4 测定方法
pH值：用PHS-3C精密酸度计进行测定。
感官评价：由10人组成感官评价小组，分别对金刺梨酵素的色泽、香气、口感、组织状态进行评分，去除最高分与最低分后平均得分为金刺梨酵素最终得分，满分100分，金刺梨酵素的感官评分标准见表2[13]。
表2 金刺梨酵素的感官评分标准
Table 2 Sensory evaluation standards of Rosa sterilis Jiaosu
总黄酮含量测定：采用亚硝酸钠-硝酸铝比色法[14]；SOD酶活力测定：按照SOD试剂盒说明进行；维生素C含量测定：采用2,6-二氯氢靛酚法[16]；总酚含量测定：采用Fulin-Denis法[17]。
SOD酶活力：按照SOD试剂盒说明进行测定。
DPPH自由基清除率[15]：准确称取20 mg DPPH，用无水乙醇定容于250 mL容量瓶中，得到浓度为20 mmol/L的DPPH溶液。取2 mL金刺梨酵素样液及2 mL 20 mmol/L DPPH混匀后反应30 min，测定波长517 nm处的吸光度值变化，对照溶剂用无水乙醇代替，按下式计算DPPH清除率：
式中：Ai为DPPH液与样液的吸光度值；Aj为无水乙醇与样液的吸光度值；Ac为DPPH液与无水乙醇的吸光度值。
1.3.5 统计分析
试验设计和数据处理采用Design-Expert 8.6.0.1软件，数据处理和差异性分析采用Origin2021和SPSS25.0软件。所有试验均重复3次。
2 结果与分析
2.1 金刺梨酵素发酵工艺优化单因素试验
2.1.1 乳酸菌发酵剂接种量对金刺梨酵素品质的影响
由图1可知，随着乳酸菌发酵剂接种量的增加，金刺梨酵素pH值持续下降、感官评分呈先上升后下降的趋势；乳酸菌发酵剂接种量为3%时，金刺梨酵素感官评分达到最高为93分，此时pH值为3.61。接种量过低时发酵速率缓慢，产酸不足，更易受到有害菌污染，影响产品的品质[18]；接种量过高，产品过酸，影响口感，因此选择最优乳酸菌发酵剂接种量为3%。
图1 乳酸菌发酵剂接种量对金刺梨酵素pH值和感官评分的影响
Fig.1 Effect of lactic acid bacteria inoculum on pH and sensory evaluation of Rosa sterilis Jiaosu
2.1.2 发酵温度对金刺梨酵素品质的影响
由图2可知，随着发酵温度的升高，金刺梨酵素pH值呈先下降后上升的趋势，感官评分呈先上升后下降的趋势；发酵温度为37 ℃时金刺梨酵素感官评分达到最高为94.8分，此时pH值为3.61。温度过高不适宜乳酸菌生长代谢[19]。因此选择最优发酵温度为37 ℃。
图2 发酵温度对金刺梨酵素pH值和感官评分的影响
Fig.2 Effect of fermentation temperature on pH and sensory evaluation of Rosa sterilis Jiaosu
2.1.3 发酵时间对金刺梨酵素品质的影响
发酵时间会影响乳酸发酵产酸量、发酵完全程度[20]和产品口感。由图3可知，随着发酵时间的延长，pH值呈现先剧烈再逐渐平缓的下降趋势，感官评分呈先上升后下降的趋势；发酵第48 h时金刺梨酵素感官评分达到最高94分，此时pH值为3.61。发酵时间过短，乳酸发酵产酸量较低，影响感官品评；发酵时间过长，乳酸发酵产酸量过多导致产品过酸，影响感官品评。因此选择最优发酵时间为48 h。
图3 发酵时间对金刺梨酵素pH值和感官评分的影响
Fig.3 Effect of fermentation time on pH and sensory evaluation of Rosa sterilis Jiaosu
2.1.4 白砂糖添加量对金刺梨酵素品质的影响
由图4可知，白砂糖添加量对pH值影响较弱，主要影响产品口感，感官评分呈现先上升后下降的趋势，白砂糖添加量为6%时，感官评分达到最高94.8分，此时pH值为3.61。白砂糖添加量过低，产品过酸影响口感；白砂糖添加量过高，产品过甜。因此选择最优白砂糖添加量为6%。
图4 白砂糖添加量对金刺梨酵素pH值和感官评分的影响
Fig.4 Effect of glucose addition on pH and sensory evaluation of Rosa sterilis Jiaosu
2.2 金刺梨酵素发酵工艺优化BBD响应面试验结果与分析
2.2.1 响应面试验设计方案与结果
金刺梨酵素发酵条件优化响应面试验设计及结果见表3。
表3 金刺梨酵素发酵条件优化响应面试验设计及结果
Table 3 Design and results of response surface tests for Rosa sterilis Jiaosu fermentation conditions optimization
续表
2.2.2 建立回归模型和方差分析
利用响应面软件Design-Expert 8.6.0.1对表3所得结果进行多元回归拟合，获得响应值感官评分（Y）的回归模型方程式分别为：
对该模型进行方差分析，对模型系数进行显著性检验，结果见表4。
表4 以感官评分为评价指标的回归模型方差分析结果
Table 4 Variance analysis results of regression model using sensory evaluation as evaluation index
注：“**”表示对结果影响极显著（P＜0.01）；“*”表示对结果影响显著（P＜0.05）。
由表4可知，模型显著（P＜0.01），失拟项不显著（P＞0.05），模型复相关系数R2为0.987 5，校正决定系数R2为0.975 0，说明该模型拟合度较高。由F值可知，各因素对金刺梨酵素感官评分的影响程度由强到弱依次为发酵温度（B）＞发酵时间（C）＞白砂糖添加量（D）＞菌接种量（A），且结合表中P值可知，感官评价回归模型中一次项A、B、C、D，交互项AD、CD，二次项A2、B2、C2、D2对结果影响极显著（P＜0.01）；交互项AB、BD对结果影响显著（P＜0.05），其他因素影响不显著（P＞0.05）。
2.2.3 响应面因素交互作用分析
通过模型方程绘制的响应面图和等高线图可直观体现出响应面因素与响应值之间的关系以及各响应因素间的交互作用关系及强弱[21]。等高线图中越接近椭圆形代表两者交互作用越强，越接近圆形则代表交互作用越弱[22]；而三维响应面图曲面坡度幅度则代表响应值的变化幅度，曲面坡度越陡对响应值的影响越大，反之则越小[23]。
由图5可知，响应面的下端投影显示，AB、BD线较密集且接近椭圆，说明乳酸菌发酵剂接种量和发酵温度、发酵温度和白砂糖添加量交互作用显著（P＜0.05）；AD、CD线密集且呈椭圆，说明乳酸菌发酵剂接种量和白砂糖添加量、发酵时间和白砂糖添加量交互作用极显著（P＜0.01）。三维响应面图中顶点清晰、坡面较陡、坡度较大，响应值感官评分（Y）随着4个响应因素的增大呈现先上升后下降的趋势，说明四个响应因素对感官评分（Y）影响均为显著（P＜0.05）。这与方差分析表中数据结果吻合。
图5 接种量、发酵时间、发酵温度和白砂糖添加量间交互作用对感官评分影响的响应面及等高线
Fig.5 Response surface plots and contour lines of effects of interaction between inoculum,fermentation time,temperature and glucose addition on sensory evaluation
2.2.4 响应面模型验证试验
经过Design-Expert 8.0.6.1软件优化处理后，对二次多元回归模型进行分析并求解，以感官评分为评价指标，得到金刺梨酵素的最佳工艺条件为乳酸菌发酵剂接种量3.28%，发酵温度37.78 ℃，发酵时间48.74 h，白砂糖添加量7.18%，在此条件下，金刺梨酵素pH值为3.62，感官评分预测值为94.91分。根据实际情况和可操作性，修正发酵工艺条件为乳酸菌发酵剂接种量3%，发酵温度38 ℃，发酵时间49 h，白砂糖添加量7%，在此条件下进行3次平行试验，金刺梨酵素pH值为3.62，感官评分实际值为95分，与模型预测值基本吻合。
2.3 金刺梨酵素品质分析及抗氧化活性检测结果
金刺梨含有大量黄酮类、总酚、维生素C[24-25]、SOD[26]等营养成分，由于这些营养成分稳定性较差，经微生物转化与利用的发酵过程中易受环境因素的影响，造成不同程度的损耗，发酵过程中微生物的产热、产气等也会导致SOD酶活性[27]和维生素C含量降低[28-29]，且维生素C属于烯醇式化合物，易被氧化为醌类物质[28]。在优化发酵工艺条件下，金刺梨酵素pH值为3.62，感官评分为95分，总黄酮含量为4.38 mg/mL，超氧化物歧化酶（SOD）活力为6 998.40 U/g，维生素C含量为721.80 mg/100 mL，总酚含量为21.78 mg/L，总酸含量为17.41 g/L，乳酸菌活菌数对数值为7.69，致病菌未检出。DPPH自由基清除率为88.65%。金刺梨酵素产品质量指标符合轻工行业标准QB/T 5323—2018《植物酵素》[30]要求，并且具有一定的抗氧化性。
3 结论
本研究以金刺梨原汁为原料，利用乳酸菌剂发酵原汁制备金刺梨酵素，通过响应面试验确定金刺梨酵素最佳发酵工艺条件为：乳酸菌接种量3%，发酵温度38 ℃，发酵时间49 h，白砂糖添加量7%。在此优化条件下金刺梨酵素pH值为3.62，感官评分为95分，总黄酮含量为4.38 mg/mL，超氧化物歧化酶（SOD）活力为6 998.40 U/g，维生素C含量为721.80 mg/100 mL，总酚含量为21.78 mg/L，总酸含量为17.41 g/L，乳酸菌活菌数对数值为7.69，致病菌未检出。DPPH自由基清除率为88.65%。金刺梨酵素产品质量指标符合轻工行业标准QB/T 5323—2018《植物酵素》要求，并且具有一定的抗氧化性。该研究为开发一种绿色益生健康、营养风味俱佳的金刺梨酵素提供理论依据。
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