饮酒作为中国的一种传统习俗，自古有无酒不成席之说，古代人类喝酒看重的是一种豪迈的情怀，近代人喝酒更多是为增加节日气氛、增进友谊。随着现代经济的发展、社会的发展以及健康知识的普及，保健酒逐渐引起了消费者的关注[1-3]。目前，保健酒品种有限，并且绝大多数是通过高度白酒泡制方式获得[4-6]。依据国家酒业总体政策为“限制高度酒的发展，鼓励发酵酒和低度酒的发展”，项目研究采用微生物发酵法将含有养生保健功效成分的原材料和谷物原料共同发酵酿制低度酒，既可使原材料中大分子类功能物质转化为人体易吸收的小分子物质溶于酒中，又满足人们对低度保健酒的需求，同时也响应国家政策的号召。
铁皮石斛（Dendrobium officinale）又名救命仙草，为兰科石斛属多年生草本植物，铁皮石斛含有石斛碱、多糖、氨基酸、芪类及其衍生物、挥发性成分等多种天然生物活性成分[10-14]，现代药理研究表明铁皮石斛具有降血糖、降血脂、抗衰老、抗肿瘤、增强机体免疫力等多种功效[15-19]。将铁皮石斛进行深加工成为近年来的热点，其主要应用有泡水、泡酒、口服液、冲剂、药片等多种形式[20-22]；通过发酵作用制成的产品有铁皮石斛酸奶、石斛乳酸饮料、石斛辣椒酱等[23-25]。关于利用铁皮石斛制酒，戴立威等[8，26]采用单一原料铁皮石斛进行混菌发酵制备铁皮石斛酒，史学琴等[9，27-28]采用将铁皮石斛和糯米共同发酵制备铁皮石斛米酒，汪江波等[29]采用超声波破碎法制备铁皮石斛配制酒并对配制酒及其提取物进行抗氧化活性研究。但有关铁皮石斛黄酒鲜有报道，目前市场上铁皮石斛保健黄酒产品尚未出现，研究将铁皮石斛加入传统的深受人们喜爱的低度黄酒的制作中，不仅可以为铁皮石斛产业发展注入新活力，同时也可为低度保健酒开发丰富产品种类。
本研究以铁皮石斛和糯米为原料，结合传统黄酒发酵工艺制备半干型铁皮石斛保健黄酒，并采用单因素试验和正交试验优化铁皮石斛保健黄酒主发酵工艺条件，对其理化指标进行测定，并研究铁皮石斛保健黄酒酿制过程中各成分的变化规律。以期为铁皮石斛保健黄酒的规模化生产提供理论依据，推动石斛和黄酒相关产业发展。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
铁皮石斛干品、糯米：市售；酒石酸钾钠、葡萄糖、无水乙醇、亚甲基蓝、氢氧化钠、盐酸、亚铁氰化钾、浓硫酸（均为分析纯）：国药集团化学试剂有限公司；安琪甜酒曲：安琪酵母股份有限公司。
1.2 仪器与设备
淮安市酿酒工程重点实验室黄酒生产线一套：上海伊本轻工机械有限公司；PHS-3E型pH计：上海仪电科学仪器股份有限公司；DHG-9140A电热鼓风干燥箱：上海一恒科学仪器有限公司；752紫外分光光度计：上海谱元仪器有限公司；LFP-800T粉碎机：永康市红太阳机电有限公司；MS-TS分析天平：梅特勒-托利多国际贸易（上海）有限公司；XAMY板框压榨机：东莞市佳睿机械设备有限公司；78HW-1恒温磁力搅拌器：常州金坛良友仪器有限公司。
1.3 方法
1.3.1 铁皮石斛保健黄酒的酿造工艺流程及操作要点[12]
操作要点：
铁皮石斛干粉的制备：将铁皮石斛干品置于电热鼓风干燥箱中60 ℃烘干3 h，取出粉碎，过100目筛，备用。
糯米饭的制备：以糯米∶水=1∶1.5的质量比，加水浸泡8～12 h，过滤掉水分，置于蒸锅中蒸煮，冒气后蒸20 min，摊凉至30 ℃以下，添加糯米质量6%的铁皮石斛干粉。
接种、发酵：接种糯米质量0.3%的安琪甜酒曲，陶缸搭窝发酵（24～28 ℃、30 d），糖化2 d（26 ℃）。
主发酵：主发酵温度为28 ℃，发酵时间7 d，期间每天搅拌2次。
后发酵：后发酵温度为15～18 ℃，静置发酵1个月。
压榨：板框压榨机进行压榨。
澄清、过滤：自然澄清3 d后采用超滤膜过滤，获得滤液即为铁皮石斛保健黄酒。
1.3.2 铁皮石斛保健黄酒主发酵条件优化
铁皮石斛保健黄酒主发酵基础条件设定为：铁皮石斛添加量6%、主发酵时间7 d、主发酵温度28 ℃和接种量0.3%。
单因素试验：分别考察铁皮石斛干粉添加量（0、3%、6%、9%、12%）、主发酵温度（22 ℃、24 ℃、26 ℃、28 ℃、30 ℃）、发酵时间（1 d、3 d、5 d、7 d、9 d）和接种量（0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%）对铁皮石斛保健黄酒总糖、总酸、氨基酸态氮含量、感官评分和酒精度的影响。
正交试验：以单因素试验为基础，以感官评分为评价指标，以铁皮石斛添加量（A）、主发酵温度（B）、主发酵时间（C）和接种量（D）为影响因素，采用4因素3水平L9（34）正交试验设计进行正交试验，确定最佳工艺条件，正交试验因素与水平见表1。
表1 铁皮石斛保健黄酒主发酵工艺条件优化正交试验因素与水平
Table 1 Factors and levels of orthogonal tests for main fermentation process conditions optimization of Dendrobium officinale health Huangjiu
1.3.3 铁皮石斛保健黄酒感官评价标准
邀请10名品酒师，从外观颜色、香气及风格3个方面对铁皮石斛黄酒进行感官评价，满分为100分，铁皮石斛黄酒的感官评分标准根据GB/T 13662—2018《黄酒》和GB/T 2758—2012《发酵酒及其配制酒》的感官要求并做修改制定，具体见表2。
表2 铁皮石斛保健黄酒的感官评定标准
Table 2 Sensory evaluation standard of Dendrobium officinale health Huangjiu
1.3.4 分析检测
参照GB/T 13662—2018《黄酒》，总酸和氨基酸态氮的测定：电位滴定法；酒精度的测定：蒸馏法；总糖的测定：亚铁氰化钾滴定法。多糖含量的测定：苯酚硫酸法[30]。
1.3.5 数据处理
用SPSS26.0软件对数据进行统计分析和处理。
2 结果与分析
2.1 铁皮石斛保健黄酒主发酵工艺优化单因素试验结果
2.1.1 铁皮石斛干粉添加量对铁皮石斛保健黄酒品质的影响
由表3可知，随着铁皮石斛干粉添加量在0～12%范围内的增加，铁皮石斛保健黄酒的总糖、总酸、酒精度和氨基酸态氮含量均增加。其原因可能是，铁皮石斛中蛋白质含量高达1.7%[32]，多糖含量高于25%[8]，因而随着铁皮石斛干粉添加量的增加，铁皮石斛保健黄酒中多糖和蛋白质逐渐增加，但同时部分多糖和蛋白质也被酒曲微生物分解转换为酒精、乳酸和氨基酸等，导致所得产物中酒精度、总酸和氨基酸态氮含量随之增加[8]。随着铁皮石斛干粉添加量在0～9%范围内的增加，感官评分呈逐渐增加的趋势；当铁皮石斛干粉添加量为9%时，感官评分达到最大值，为85分；当铁皮石斛干粉添加量＞9%，产品苦味突出，酸味较大，口感欠佳，感官评分下降。因此，确定适宜铁皮石斛干粉添加量为9%。
表3 铁皮石斛干粉添加量对铁皮石斛保健黄酒品质的影响
Table 3 Effect of Dendrobium officinale dry powder addition on the quality of Dendrobium officinale health Huangjiu
2.1.2 主发酵温度对铁皮石斛保健黄酒品质的影响
由表4可知，主发酵温度低于26 ℃时，随发酵温度升高，铁皮石斛总糖含量增加；主发酵温度为26 ℃时，总糖含量达到最大值，为16.01 g/L；主发酵温度高于26 ℃时，铁皮石斛总糖含量减少。其原因可能是，温度较低时，酒曲中产生淀粉酶和糖化酶的微生物为主导菌，原料中淀粉不断被分解，因而总糖含量不断上升，当温度超过26 ℃时，酒曲中的酵母菌开始旺盛生长，消耗掉部分糖类物质，因而总糖含量下降[7]。随着主发酵温度在22～30 ℃范围内的增加，酒精度、总酸和氨基酸态氮含量随发酵温度升高均呈升高趋势，其原因可能是，温度升高，酒曲中酵母菌生长代谢加快，此过程中糖转化成酒精和酸类物质，蛋白质转化为氨基酸，因而产品中总酸含量、酒精度和氨基酸态氮含量增加[7，30]。产品感官评分呈先升高后下降的趋势，主发酵温度为26 ℃时，感官评分达到最高值，为83分，此时，产品酸甜适宜，铁皮石斛风味突出，酒味柔和。因此，选择适宜主发酵温度为26 ℃。
表4 主发酵温度对铁皮石斛保健黄酒品质的影响
Table 4 Effect of main fermentation temperature on the quality of Dendrobium officinale health Huangjiu
2.1.3 主发酵时间对铁皮石斛保健黄酒品质的影响
由表5可知，当主发酵时间在1～3 d范围内的增加，总糖含量迅速由11.12 g/L上升到17.95 g/L，然后随发酵的继续进行，在第9天时，总糖含量下降到15.11 g/L。其原因可能是，在发酵初期，酒曲中微生物分泌的糖化酶分解糯米中淀粉产生了大量的糖类物质，因而总糖含量上升；此后，酒曲中的酵母菌逐渐成为优势菌会利用糖类物质，因而总糖类含量下降[7]。在整个主发酵期，总酸、酒精度及氨基酸态氮含量逐渐上升，主要原因是随发酵的进行，部分糖类物质逐渐被转化为酸、酒精，蛋白质被转化为氨基酸[7，30]。当主发酵时间在1～7 d范围内增加，感官评分逐渐增加；当主发酵时间为7 d时，感官评分最高，为80分，此时产品颜色、香气、风格都达到良好状态；当主发酵时间＞7 d，感官评分逐渐下降。因此，确定适宜主发酵时间为7 d。
表5 主发酵时间对铁皮石斛保健黄酒品质的影响
Table 5 Effect of main fermentation time on the quality of Dendrobium officinale health Huangjiu
2.1.4 接种量对铁皮石斛保健黄酒品质的影响
由表6可知，随着接种量在0.2%～0.6%范围内增加，总糖含量逐渐降低；总酸、氨基酸态氮含量及酒精度逐渐上升。当接种量在0.2%～0.5%范围内增加，感官评分逐渐增加；当接种量为0.5%时，感官评分达到最大值，为86分；当接种量＞0.5%，感官评分逐渐下降。因此，确定适宜接种量为0.5%。
表6 接种量对铁皮石斛保健黄酒品质的影响
Table 6 Effect of inoculum on the quality of Dendrobium officinale health Huangjiu
2.2 铁皮石斛保健黄酒主发酵条件优化正交试验
在单因素试验基础上，以铁皮石斛干粉添加量（A）、主发酵温度（B）、主发酵时间（C）和接种量（D）为影响因素，以感官评分为评价指标，设计4因素3水平L9（34）试验，考察各因素对铁皮石斛保健黄酒感官评分的影响，正交试验结果与分析见表7。
表7 铁皮石斛保健黄酒主发酵工艺条件正交试验设计及结果
Table 7 Design and results of orthogonal test for main fermentation process conditions optimization of Dendrobium officinale health Huangjiu
由表7可知，4个试验因素对铁皮石斛保健黄酒感官评分影响的主次顺序为A＞B＞D＞C，即铁皮石斛添加量＞主发酵温度＞接种量＞主发酵时间；铁皮石斛黄酒最佳主发酵工艺条件为A2B2C2D1，即铁皮石斛添加量9%、主发酵温度26 ℃、主发酵时间7 d和接种量0.4%。在最佳发酵工艺条件下进行3次平行验证试验，铁皮石斛黄酒感官评分为92.1分。
2.3 铁皮石斛保健黄酒的理化指标
对最佳发酵条件酿制的铁皮石斛保健黄酒的理化指标及主要活性成分多糖进行测定，结果见表8。
由表8可知，铁皮石斛保健黄酒的总糖、总酸含量、酒精度及氨基酸态氮含量均满足GB/T 13662—2018《黄酒》中半干型黄酒（优级）标准。铁皮石斛含有对人体健康有益的活性成分主要为多糖物质[11，25-28]，将铁皮石斛与糯米为原料制成铁皮石斛保健黄酒，测定其多糖含量为12.12 g/L，同时对未加铁皮石斛的糯米黄酒测定多糖含量为8.24 g/L，说明在黄酒制作过程中添加铁皮石斛可增加产品的保健功效。
表8 铁皮石斛保健黄酒理化指标测定结果
Table 8 Determination results of physicochemical indexes for Dendrobium officinale health Huangjiu
2.4 铁皮石斛保健黄酒主发酵过程中理化成分的变化规律
对铁皮石斛保健黄酒主发酵过程中的总糖、总酸、氨基酸态氮含量及酒精度进行测定，结果见图1。
图1 铁皮石斛保健黄酒主发酵过程中总糖含量和酒精度（A）、总酸和氨基酸态氮含量（B）的变化
Fig.1 Changes of total sugar contents and alcohol content (A),total acid and amino acid nitrogen contents (B) of Dendrobium officinale health Huangjiu during main fermentation
由图1A可知，随着发酵时间在1～4 d范围内增加，总糖含量呈快速增加趋势；当发酵时间为4 d，总糖含量达到最高，为16.82 g/L；当发酵时间＞4 d，总糖含量缓慢下降。其原因可能是，发酵初期酒曲中微生物代谢分泌的淀粉酶和糖化酶将原料中的淀粉快速转化为糖类物质，因而糖类物质含量会快速增加，发酵后期，酒曲中酵母菌的旺盛代谢消耗掉部分前期产生的糖类物质，因而总糖含量开始下降[12]。铁皮石斛保健黄酒酒精度在发酵的前2 d缓慢增加；在2 d后迅速上升，当发酵时间为7 d时，酒精度为14.99%vol。其原因是发酵初期，发酵液中酵母菌生长代谢缓慢，进行酒精代谢速度低，因而发酵液中酒精含量缓慢上升，发酵4 d后，在酒曲中快速生长的酵母菌的作用下，糖类物质快速转化为酒精，因而酒精含量快速上升[6]。
由图1B可知，随着发酵时间在1～5 d范围内增加，铁皮石斛保健黄酒总酸及氨基酸态氮含量呈快速上升趋势；发酵时间＞5 d，总酸和氨基酸态氮含量呈稳定趋势；当发酵时间为5 d时，总酸及氨基酸态氮含量分别为8.50 g/L、0.58 g/L。其原因可能是，发酵前5 d，酒曲中乳酸菌和醋酸菌生长使得发酵液中的总酸含量上升，5 d后，发酵液的酸性环境和酒精环境又抑制了乳酸菌和醋酸菌生长，因而总酸含量基本不再变化[32]。黄酒中氨基酸态氮含量主要来源于原料中蛋白质的分解[33]，发酵前5 d，酒曲蛋白酶作用于原料，氨基酸态氮含量不断增加，5 d后，原料中蛋白质基本降解完毕，因而黄酒中氨基酸态氮此时也基本稳定。
3 结论
以铁皮石斛和糯米为主要原料制备铁皮石斛保健黄酒，通过单因素试验及正交试验优化后铁皮石斛保健黄酒的最佳主发酵条件为：铁皮石干粉斛添加量9%，主发酵温度26 ℃，主发酵时间7 d，接种量0.4%。在此优化条件下，铁皮石斛保健黄酒感官评分为92.1分，总糖含量为15.52 g/L、总酸含量为8.51 g/L、酒精度为15.02%vol、氨基酸态氮含量为0.60 g/L、活性多糖含量为12.12 g/L。随发酵时间的推移，总糖含量先增多后减少，在第4天时达到最高值为16.82 g/L；酒精度主发酵时间内一直呈上升趋势；总酸和氨基酸态氮含量呈先增加后稳定的趋势，发酵第5天时达到稳定，其含量分别为8.50 g/L、0.58 g/L。铁皮石斛保健黄酒开发不仅可增加保健黄酒种类，也可为铁皮石斛产业深加工注入新活力。测定铁皮石斛保健黄酒酿制过程中各成分的变化规律，可为铁皮石斛保健黄酒的规模化生产提供理论依据，同时推动石斛和黄酒相关产业发展。
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