高温堆积是酱香型白酒酿造的独特工艺之一，是耗氧发酵的重要环节，为窖内发酵提供必要的微生物群落与代谢前体物质。堆积效果的质量与轮次基酒的产质量直接相关，是酱香型白酒生产的“二次制曲”。
张春林等[1]开展酱香型白酒二轮次堆积酒醅微生物群落与理化指标相关性研究，解析了淀粉、总酸、温度等与微生物多样性的相关性。路虎等[2]剖析酱香型白酒糙沙轮次成熟糖化堆，发现堆积发酵能进一步网罗环境中微生物，同时产生大量香味物质。但因糖化堆体积较大，当糖化堆达到入窖条件时，不同部位的理化指标、微生物种类和数量以及酒醅放香程度等差异较大。李小东等[3]研究了芝麻香型白酒堆积发酵对入窖发酵过程及原酒品质的影响，发现堆积发酵结束时，表层酒醅微生物菌群数量巨大，单独取表层酒醅入窖后，酒醅升酸快，尤其是乙酸量迅速增加，酵母菌下降迅速，且在不同的堆积温度条件下，堆积发酵结束时微生物菌群构成不同，最终影响原酒的质量和酒体风格。万清徽等[4]研究两种堆积醅对芝麻香型白酒发酵特性和香气品质的影响，解析了芝麻香堆积结束时表层及中层醅中微生物数量和糖化酶活力的规律。韩兴林等[5]从酱香型白酒堆积酒醅中定性检出挥发性风味化合物83种，表明堆积过程在富集微生物的同时，产生了大量酒体风味物质。冯海燕等[6]检测分析了堆积结束入窖醅中乙醇、乳酸的含量，并建立标准。
堆积发酵是酱香型白酒质量控制极为重要的一个环节，为建立堆积评价效果的客观标准，了解堆积对基酒风味物质成分的贡献，本实验探究酱香型白酒二轮次堆积发酵过程中不同空间位置酒醅各项理化指标及风味成分的差异，以期为堆积发酵过程的质量控制提供有效取样方法及控制指标，为指导生产实践提供理论基础。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
酒醅：贵州仁怀某酱香型酒厂即将入窖第二轮次堆积酒醅。
2-辛醇（色谱纯）：天津光复精细化工厂；氢氧化钠、酚酞（均为分析纯）：天津市科密欧化学试剂有限公司；无水葡萄糖、亚甲基蓝（均为分析纯）：天津市永大化学试剂有限公司；酒石酸钾钠、亚铁氰化钾（均为分析纯）：成都金山化学试剂有限公司；五水合硫酸铜（分析纯）：广东光华科技股份有限公司。
1.2 仪器与设备
DHH-9240A电热恒温鼓风干燥箱：上海森信实验仪器有限公司；LQ-C10002电子天平：昆山优科维特电子科技有限公司；NH-4恒温水浴锅：常州润华电器有限公司制造；TST-RO-20（超）纯水机：石家庄泰斯特仪器设备有限公司；顶空瓶：爱吉人科技股份有限公司；顶空针（萃取头）：美国Supelco公司；HMS-14磁悬浮力搅拌器：上海泰坦科技股份有限公司；7890B-5977A气相色谱-质谱联用（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）仪：安捷伦科技（中国）有限公司。
1.3 方法
1.3.1 取样方法
从酒堆的不同空间位置进行取样[4]，取样位点见图1。第一个样为酒堆的最顶部，记为位点W1；第二个样为酒堆顶部到酒堆中部之间等距离位置，记为位点W2；第三个样为堆积中心位置，记为位点W3；第四个样为酒堆中部至底部之间等距离位置，记为位点W4；第五个样为酒堆底部中间，记为位点W5；第6～9个样为酒堆中部从外到里依次记为位点W6、位点W7、位点W8、位点W9。所有样品置于4 ℃冰箱冷藏保存。
图1 酒醅堆积发酵取样位点示意图
Fig.1 Schematic diagram of sampling site of fermented grains stacking fermentation
1.3.2 分析检测
（1）理化指标的测定
理化指标检测方法均参考安徽省地方标准DB 34/T 2264—2014《固态发酵酒醅分析方法》，其中酸度的检测：酸碱中和滴定法；淀粉含量的检测：葡萄糖标准溶液反滴定法；酒精度的检测：酒精计法；水分含量的检测：恒温干燥法；还原糖含量的检测：葡萄糖标准溶液反滴定法。
（2）挥发性风味物质的测定
挥发性风味物质检测采用GC-MS法。
样品前处理：取10 g酒醅样品放入250 mL三角瓶中，同时加入20 mL的去离子水，混匀，静置30 min后，吸取8 mL混合液体于装有3 g氯化钠的25 mL顶空瓶中，再加入10 μL的内标物2-辛醇（10 mg/L），放置磁力加热搅拌器上加热萃取50 min后，萃取完毕后将顶空针取出，插入气相色谱进样口热解吸2 min用于气相色谱-质谱法（GC-MS）分析，2 min后取出顶空针[5]。
GC条件：VF-WAX色谱柱（60 m×250 μm×0.5 μm），进样口温度为250 ℃，载气为高纯氦气（He），流速2 mL/min，升温程序为50 ℃保持2 min，以6 ℃/min速率升温至230 ℃，并保持15 min。MS条件：电子电离（electronic ionization，EI）源，电子能量70 eV，离子源温度230 ℃，扫描范围35～350 amu。
定性定量方法：参考周靖等[7]的方法。
2 结果与分析
2.1 不同空间堆积位点酒醅理化指标分析
酱香型白酒的堆积是耗氧与厌氧代谢共同进行的过程，在实际堆积过程中存在酵母、霉菌的富集繁殖，糖化作用，乙醇生成及产酸代谢等。酱酒生产及发酵是非均一性的固态发酵。酱酒的堆积从起堆开始分几次加料，在2～3 d的时间完成丢堆。微生物繁殖与代谢过程从起堆就开始发生，不同时间段加入的酒醅，发酵进度是不一致的。因而至堆积发酵结束，不同空间位点的酒醅的各项指标具有一定差异。酒醅堆积取样位点理化指标分析结果分别见图2和图3。
图2 酒醅堆积发酵取样位点酸度、酒精度及淀粉含量测定结果
Fig.2 Determination results of acidity,alcohol contents and starch contents of sampling site of fermented grains stacking fermentation
图3 酒醅堆积发酵取样位点水分及还原糖含量测定结果
Fig.3 Determination results of water and reducing sugar contents of sampling site of fermented grains stacking fermentation
由图2可知，酒醅酸度从酒堆上部到底部（从位点W1到位点W5），呈现先上升后下降的趋势，堆心的位置（位点W3）酸度最高。从位点W4到位点W9，酸度变化不明显。说明越到酒堆内部，越利于生酸。该部位酒醅溶氧量最低，酵母、霉菌的富集繁殖受到抑制，产酸细菌代谢较为活跃。因而位点W3可以作为评价堆积酸度生成的最佳取样位点。酒精度从位点W1～W4及W6～W9均呈显著上升趋势，位点W9酒精度最高，位点W5酒精度最低。位点W5处的酒醅是起堆时的第一批次酒醅，该处酒醅受到底部起堆时所洒曲粉的影响，水分含量最低，淀粉含量最高，酿酒酵母富集繁殖不足，乙醇代谢最低。相反，位点W9位于酒堆中部偏内的位置，该处的酒醅在前期（刚上堆时）处于外层，溶氧量充足，酵母霉菌均得到较好的富集繁殖，在后期（丢堆后）处于中部偏内的位置，酿酒酵母在耗氧代谢结束后，进入乙醇代谢，导致其酒精度最高。因而位点W9可以作为评价堆积乙醇生成的最佳取样位点。
由图2和图3可知，酒醅的淀粉含量在位点W5处出现峰值，在位点W7处出现最低值。说明W7位点的酒醅的淀粉消耗最大。该位点处于酒堆的外部略靠内的位置，酵母霉菌繁殖代谢最为活跃，发酵温度也较高，因而淀粉消耗最高，水分含量也较高。位点W7可以作为检测酒堆淀粉、水分含量的最佳取样位点，淀粉、水分的物质含量在一定程度上反映了堆积发酵状态，可作为堆积终点判断的有效指标。
由图3可知，还原糖的含量在位点W5、W7、W9处均出现峰值，在位点W2处含量最低。W5处的酒醅直接接触底部曲粉，该处的糖化力偏高，是受到大曲糖化酶的影响，产生一定量的还原糖。结合上文分析，位点W7处酒醅霉菌代谢较为活跃，从而生成较多糖化酶，糖化酶将淀粉转化为还原糖，酵母、霉菌利用还原糖进行进一步的繁殖，因而该处还原糖含量较高。位点W9处的酒醅在前期酵母、霉菌富集繁殖时，代谢生成较多还原糖，后期由于溶氧量降低，还原糖未得到有效利用，因而在该处出现最高值。位点W9可以作为评价堆积还原糖含量的最佳取样位点，该处的还原糖过高，说明堆积过程糖化代谢过于活跃，发酵力不足，会导致窖内发酵异常。因而根据监控堆积过程的还原糖含量，可以有效判断堆积发酵状态，位点W9的还原糖含量可以作为评价堆积发酵终点的理化评价指标之一。
酱香传统的堆积结束常规评价指标主要有堆积温度、酸度、水分、还原糖、淀粉等，除堆积温度外，酸度、水分、还原糖、淀粉等检测指标的所检样品的取样均采用五点取样混匀的方式。该方法较为粗放，不利于生产的精细化控制。本研究明确酸度、水分、淀粉、还原糖的取样位点，并增加乙醇作为堆积终点评价指标之一，可以更加精准控制堆积发酵过程，有效评价堆积发酵终点。
2.2 不同空间堆积位点酒醅风味物质分析
2.2.1 酸类、酯类及醇类物质分析
传统酱香生产堆积终点的判断，一方面根据堆积升温情况，一方面依据有经验的酒师感官判断风味生成情况。为了解不同空间堆积位点酒醅的风味物质构成，利用气相色谱-质谱分析酒醅酸类、酯类及醇类物质，结果见表1，酒醅酸类、酯类及醇类物质总量分析结果见图4。
图4 酒醅堆积发酵取样位点酸类、酯类及醇类总量分析结果
Fig.4 Analysis results of total acids,esters and alcohols contents of sampling site of fermented grains stacking fermentation
表1 酒醅堆积发酵取样位点酸类、酯类及醇类含量测定结果
Table 1 Determination results of acids,esters and alcohols contents of sampling site of fermented grains stacking fermentation
续表
注：“-”表示未检出。
由表1可知，共检出异丁酸、辛酸、己酸、丁酸、醋酸、丙基丙二酸、N-苄氧羰基-L-精氨酸、L-胱氨酸、D-环丝氨酸等总计14种酸类物质；共检出棕榈酸乙酯、正己酸乙酯、油酸乙酯、乙酸异戊酯、乙酸糠酯、乙酸苯乙酯、亚油酸乙酯、辛酸乙酯、辛基癸酸酯、戊酸乙酯、乳酸乙酯、丁酸乙酯、苯乙酸乙酯等总计19种酯类物质；共检出仲辛醇、异丁醇、糠醇、环辛醇、丙二醇、苯乙醇、3-呋喃甲醇、2,3-丁二醇、1,2-丙二醇总计9种醇类物质。由图4可知，酸类、酯类、醇类均在W2位点出现峰值。该位点处于酒堆的中上部，酒醅酸度、乙醇、淀粉、水分、还原糖含量均较低，酵母、霉菌均未得到较好的富集繁殖，有一定的溶氧量，产酸代谢不活跃，在大曲本身有益微生物的作用下，风味物质成分得到有效的生成，酸酯醇的总体含量较高。
2.2.2 醛类、吡嗪类、酚类、酮类及其他类物质分析
利用气相色谱-质谱分析酒醅醛类、吡嗪类、酚类、酮类及其他类物质，结果见表2，酒醅醛类、吡嗪类总量分析结果见图5。
由表2和图5可知，气相色谱-质谱分析共检出乙酸糠醛、桃醛、壬醛、糠醛、癸醛、反-2-辛烯醛、苯乙醛、苯甲醛、2-庚醛、戊醛等总计11种醛类物质。堆积酒醅中醛类成分含量较低，说明堆积过程醛类生成较少。共检出仲辛酮、环戊基苯、3-羟基-2-丁酮、2-甲基-1,3-二戊烷、2,4-二叔丁基苯酚、2,3-环氧-4-甲基戊烷、2,3,5-三甲基吡嗪、2,3,5,6-四甲基吡嗪等总计9种其他类物质。其中2,4-二叔丁基苯酚、2,3,5,6-四甲基吡嗪含量较高，均可达到20 μg/g以上。醛类、吡嗪类物质均在W2位点出现峰值。该处酒醅酸度、乙醇、淀粉、水分、还原糖含量均较低，酵母、霉菌均未得到较好的富集繁殖，有一定的溶氧量，产酸代谢不活跃，在大曲本身有益微生物的作用下，风味物质成分得到有效的生成，醛类、吡嗪类物质的总体含量较高。
表2 酒醅堆积发酵取样位点醛类、吡嗪类、酚类、酮类及其他类物质测定结果
Table 2 Determination results of aldehydes,pyrazines,phenols,ketones and others contents of sampling site of fermented grains stacking fermentation
图5 酒醅堆积发酵取样位点醛类、吡嗪类总量分析结果
Fig.5 Analysis results of total aldehydes and pyrazines contents of sampling site of fermented grains stacking fermentation
2.3 不同空间堆积位点酒醅挥发性风味物质主成分分析
将W1至W9 9个位点的风味物质成分利用SIMCA 14.1软件进行主成分分析（principal component analysis，PCA），结果见图6。由图6可知，位点W2与其他位点明显分为两类。位点W2处酒醅酸度、乙醇、淀粉、水分、还原糖含量均较低，酵母、霉菌均未得到较好的富集繁殖，有一定的溶氧量，产酸代谢不活跃，在大曲本身有益微生物的作用下，风味物质成分得到有效的生成，酸酯醇类、醛类、吡嗪类的总含量较高，酸酯类、醇类、醛类、吡嗪类均在W2位点出现峰值。因此，位点W2可以作为评价堆积过程风味物质生成的最佳取样位点。
图6 酒醅堆积发酵取样位点风味物质主成分分析结果
Fig.6 Principal component analysis results of flavor components of sampling site of fermented grains stacking fermentation
2.4 不同空间堆积位点酒醅挥发性风味物质偏最小二乘法判别分析
将W2作为类别1，将其他位点作为类别2，进行偏最小二乘法判别分析（partial least squares discriminant analysis，PLS-DA），并计算变量重要性投影（variable importance in the projection，VIP）值，结果见图7。由图7可知，异丁酸、己酸、棕榈酸乙酯、丙基丙二酸、乳酸乙酯等13种物质是区分W2位点与其他位点的主要因素（VIP＞1）。这13种物质可以拟定为堆积发酵终点判断的参考指标。
图7 酒醅堆积发酵取样位点风味物质成分偏最小二乘法判别分析结果
Fig.7 Partial least squares discriminant analysis results of flavor components of sampling site of fermented grains stacking fermentation
酱香型白酒的堆积发酵是极为复杂的过程，堆积温度结合感官评价依然是堆积终点判断最为快速的方式，不同理化指标对应不同的取样位点，以W2位点作为风味检测的取样位点，建立理化结合风味检测的评价方式，更加科学客观，也能够更加精准评价堆积发酵终点。由于数据有限，本研究并未明确各指标的控制范围，后期将持续收集数据，建立各指标详细的数据标准。
3 结论
酒堆不同空间位置酒醅的理化参数及风味物质成分存在显著差异性，堆心的位置（W3）酸度最高。该位点酒醅溶氧量最低，酵母、霉菌的富集繁殖受到抑制，产酸细菌代谢较为活跃，可以作为评价堆积酸度生成的最佳取样位点。位点W9处的酒醅在前期酵母、霉菌富集繁殖时，代谢生成较多还原糖，后期由于溶氧量降低，酿酒酵母开始生成乙醇，因而乙醇含量最高，还原糖未得到充分利用，在该处出现最峰值。因而位点W9可以作为评价乙醇生成及堆积还原糖含量的最佳取样位点。位点W7处于堆子的外部略靠内的位置，酵母霉菌繁殖代谢最为活跃，发酵温度也较高，因而淀粉消耗最高，水分含量也较高，可以作为检测堆子淀粉、水分含量的最佳取样位点。酸度、乙醇、淀粉、水分、还原糖的物质含量在一定程度上反映了堆积发酵状态，可作为堆积终点判断的有效指标。
风味成分检测结果显示酸类、酯类、醇类、醛类、吡嗪类等均在位点W2处出现峰值。该位点处于堆子的中上部，酒醅酸度、乙醇、淀粉、水分、还原糖含量均较低，酵母、霉菌均未得到较好的富集繁殖，有一定的溶氧量，产酸代谢不活跃，在大曲本身有益微生物的作用下，风味物质成分得到有效的生成，酸、酯、醇类、醛类、吡嗪类等物质总体含量较高。PLS-DA分析显示异丁酸、己酸、棕榈酸乙酯、丙基丙二酸、乳酸乙酯等13种物质是区分W2位点与其他位点的主要因素（VIP＞1），因此这13种物质成分可以拟定为堆积发酵终点判断的参考指标。
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