贵州省遵义市余庆县盛产苦丁茶，是全国苦丁茶的核心产区[1]。其成品茶清香有苦味、回味甘凉[2]。苦丁茶含有类黄酮、维生素C、氨基酸、多种微量元素、三萜皂甙类等多种有益成分，具有一定的抗氧化[3-4]、降血糖[5-6]、降血脂、抗肿瘤、调节免疫的功能[7-9]。但苦丁茶产品竞争力不强，经济效益不高，目前对苦丁茶的相关产品开发还处于比较滞后的水平。通过深加工开发一些新产品，可以改变目前的这种消费现状，拓宽产品销售渠道[10]。把苦丁茶深加工成茶酒，将贵州的两张名片有机结合，是提高苦丁茶经济效益的一种切实可行的方法。目前，国内大部分的茶酒大部分是以浸泡的方式制得，即将酒和茶汤原汁混合，或用白酒泡制而成，也有将蔗糖和茶叶混合加入酿酒酵母，但是这类方法制得的茶酒酒精度高、易上头[11]，因此，探索采用固态发酵法研制茶酒的方法和条件显得格外的重要。
我国传统米酒是利用固态法发酵而成的酸甜可口、酒香醇厚的饮品，风味特征是带有水果香和花香，并伴有醇香和青草香[12-13]。在比较浸泡时茶叶的形态、苦丁茶浸提液的温度、茶叶浸泡方式的选择、苦丁茶的浸提时间、苦丁茶与浸提液的比例、蒸饭的方式等预试验的基础上，通过在米酒发酵过程中添加适量的苦丁茶制得茶酒，同时兼顾酒与茶的风味，其入口柔软，后味回甜又伴有淡淡的茶香，其口味广受大众的喜爱，不乏是一款很好的保健饮料酒[14]。本研究以贵州本地特产苦丁茶和大米为原料制备苦丁茶米酒，通过对苦丁茶米酒发酵工艺的优化，得到适宜的发酵条件，研发出一种新的保健型米酒类饮品，以期为贵州地区苦丁茶的开发提供了新思路。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
1.1.1 原料
苦丁茶：贵州省遵义市余庆县；大米：黑龙江秋然米业有限公司；安琪甜酒曲：安琪酵母股份有限公司。
1.1.2 化学试剂
七水合硫酸亚铁（分析纯）：国药集团化学试剂有限公司；四水合酒石酸钾钠、磷酸氢二钠（均为分析纯）：天津市科密欧化学试剂有限公司；磷酸二氢钾（分析纯）：南京化学试剂股份有限公司；胰蛋白胨（生化试剂）：京全隆生物技术有限公司；酵母浸膏（生化试剂）、葡萄糖（分析纯）：北京奥博星生物技术有限责任公司；琼脂粉（生化试剂）：天津永大化学试剂有限公司；无水乙醇（分析纯）：天津市富宇化工有限公司。
1.1.3 培养基
月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤培养基、煌绿乳糖胆盐肉汤培养基：上海博微生物科技有限公司。
1.2 仪器与设备
YXQ-LS-100Sll立式压力蒸汽灭菌锅：上海博讯医疗股份有限公司；DHG-9140A电热恒温鼓风干燥箱：常州润滑电器有限公司；SW-CJ-2D双人单面垂直净化工作台：苏州净化设备有限公司；SPX-150B-Z恒温培养箱：上海森信试验仪器有限公司；FA1204N电子分析天平：上海箐海仪器有限公司；UV-5100紫外分光光度计：上海元析仪器有限公司；WZS 80糖度计：上海仪电物理光学仪器有限公司。
1.3 试验方法
1.3.1 苦丁茶米酒加工工艺流程及操作要点[15-16]
大米→洗净→浸泡→沥干→蒸饭→冷却→加入苦丁茶汤→加酒曲搅拌→恒温发酵→抽滤→精滤→装瓶→杀菌→苦丁茶米酒成品
苦丁茶汤的制备：在1 000 mL水中加入40 g苦丁茶茶叶，100 ℃浸提70 min。
大米饭的制备：将大米洗至无白色浑浊，室温条件下浸泡2 h，然后于高压灭菌锅中将大米蒸熟至松软无白心，置于超净灭菌台上，灭菌冷却30 min，冷却至室温后备用。
添加酒曲：在降至室温的大米饮中添加苦丁茶汤和打量水，在温热饭粒中加入一定量的安琪甜酒曲，使其与大米饭和茶汤均匀混合。
恒温发酵：30 ℃恒温发酵一定时间。
过滤、杀菌：发酵完成后经4层纱布过滤，巴氏杀菌（68 ℃、30 min），即得苦丁茶米酒。
1.3.2 苦丁茶米酒发酵工艺优化单因素试验
以大米饭为发酵基质，分别进行发酵时间、料液比、酒曲添加量对苦丁茶米酒品质影响的单因素试验[17-18]，确定较为适合的各个因素的最佳参数。
在发酵时间、料液比、酒曲添加量、发酵温度分别为120 h、1∶0.6（g∶mL）、0.8%、30 ℃的基本条件下，保持其他因素不变，只改变一个因素，分别考察发酵时间（48 h、72 h、96 h、120 h、144 h）、料液比（1.0∶0.2、1.0∶0.4、1.0∶0.6、1.0∶0.8、1.0∶1.0（g∶mL））、酒曲添加量（0.4%、0.5%、0.6%、0.7%、0.8%）对苦丁茶米酒茶多酚含量、糖度和感官评分的影响。每组单因素试验做3组平行。
1.3.3 苦丁茶米酒发酵工艺优化响应面试验
在单因素试验的基础上，固定发酵温度为30 ℃，设计响应面试验[19，21]，考察酒曲添加量（A）、料液比（B）、发酵时间（C）对苦丁茶米酒的影响，以苦丁茶米酒的感官评分（Y）为响应值，确定其最佳发酵工艺参数，响应面试验因素与水平见表1。
表1 苦丁茶米酒发酵工艺优化响应面试验因素与水平
Table 1 Factors and levels of response surface tests for fermentation process optimization of Chinese bitter tea rice wine
1.3.4 检测方法
感官评分：参考相关茶酒的质量标准和文献，结合苦丁茶米酒的特色制定感官评定方法[22-23]，由贵州省评委老师带队的10位品评人员组成的品酒团队对试验结果进行感官品质评分，满分100分，感官评分标准见表2。
表2 苦丁茶米酒的感官评分标准
Table 2 Sensory evaluation standards of Chinese bitter tea rice wine
理化指标：酒精度的检测采用酒精计法[24]、糖度的检测采用糖度计法、茶多酚含量的检测采用酒石酸亚铁比色法[25]。
微生物指标：菌落总数按照GB 4789.2—2022《食品安全国家标准食品微生物学检验菌落总数测定》，大肠菌群按照GB 4789.3—2016《食品安全国家标准食品微生物学检验大肠菌群计数》。
2 结果与分析
2.1 发酵工艺优化单因素试验结果分析
2.1.1 发酵时间对苦丁茶米酒品质的影响
分别考察发酵时间（48 h、72 h、96 h、120 h、144 h）对苦丁茶米酒茶多酚含量、糖度和感官评分的影响，结果见图1。由图1可知，茶多酚含量、糖度、感官评分都随着发酵时间在48～144 h的增加呈现先升高后降低的趋势。当发酵时间48～96 h时，茶多酚的含量、感官评分随着发酵时间的增加而增加，由于发酵时间较短苦丁茶米酒为淡米白色，酵母未完全发酵，整体香味虽浓，但酒精味偏淡；当发酵时间为96 h时，苦丁茶米酒均呈透明淡绿色，有酒味，茶多酚含量、感官评分最高，分别为0.832 mg/mL、85分；当发酵时间＞96 h之后，茶多酚含量、感官评分呈现下降趋势，色泽暗沉。随着发酵时间的延长，糖度的变化也不大，因此，最适发酵时间为96 h。
图1 发酵时间对苦丁茶米酒品质的影响
Fig.1 Effect of fermentation time on the quality of Chinese bitter tea rice wine
2.1.2 料液比对苦丁茶米酒品质的影响
考察不同料液比（1.0∶0.2、1.0∶0.4、1.0∶0.6、1.0∶0.8、1.0∶1.0（g∶mL））对苦丁茶米酒茶多酚含量、糖度和感官评分的影响，结果见图2。由图2可知，当料液比为1.0∶0.2～1.0∶0.8（g∶mL）时，茶多酚的含量、感官评分随着苦丁茶浸提液添加的增加而增加；当料液比为1.0∶0.8（g∶mL）时，茶多酚的含量、感官评分最高，分别为0.861 mg/mL、86分，此时大部分苦丁茶浸提液已经发酵完全，酒液呈淡绿色，清透微亮且有光泽，酒汁酸甜适宜，有米酒的新鲜伴随着苦丁茶浸提液发酵的浓厚口感，酒香和茶香怡人；当料液比为1.0∶1.0（g∶mL）时，由于苦丁茶浸提液的增多，发酵被抑制，整体风味也较差，苦丁茶浸提液过度发酵使酒液颜色加深，苦味被释放，香气不足，口感较差。茶多酚的含量、感官评分均有所下降，糖度变化不大。因此，确定最适料液比为1.0∶0.8（g∶mL）。
图2 料液比对苦丁茶米酒品质的影响
Fig.2 Effect of solid and liquid ratio on the quality of Chinese bitter tea rice wine
2.1.3 酒曲添加量对苦丁茶米酒的影响
考察不同酒曲添加量（0.4%、0.5%、0.6%、0.7%、0.8%）对苦丁茶米酒茶多酚含量、糖度和感官评分的影响，结果见图3。由图3可知，随着酒曲添加量在0.4%～0.8%范围内的增加，感官评分和茶多酚含量均呈现为先上升后下降的趋势，而糖度则是随着酒曲添加量的增加而降低。当酒曲添加量为在0.4%～0.6%时，茶多酚的含量、感官评分随着酒曲添加量的增加而增加，这是因为曲的增加促进了大米与苦丁茶浸提液的发酵。当酒曲添加量达到0.6%时，苦丁茶米酒茶多酚含量、感官评分最高，分别为0.859 mg/mL、86分，此时酒液呈微黄绿色，酸甜可口，米酒的香气和茶香混合使得香气丰富，风味较好。当酒曲添加量＞0.6%之后，茶多酚的含量、感官评分随着酒曲添加量的增加而降低，此时酒体酸涩味逐渐加重，感官评价较差。因此，确定最适酒曲添加量为0.6%。
图3 酒曲添加量对苦丁茶米酒品质的影响
Fig.3 Effect of Jiuqu addition on the quality of Chinese bitter tea rice wine
2.2 苦丁茶米酒发酵工艺优化响应面试验
在单因素试验基础上，通过Design-Expert 11.0.3对酒曲添加量（A）、茶汁料液比（B）、发酵时间（C）3个自变量，并以感官评分（Y）为响应值，进行响应面试验，结果见表3。
表3 发酵条件优化响应面试验设计及结果
Table 3 Design and results of response surface tests for fermentation process optimization
2.2.1 响应面回归模型的分析
运用Design-Expert 11.0.3软件，对表3的数据进行了分析，得出方差分析结果见表4。以酒曲添加量（A）、茶汁料液比（B）、发酵时间（C）为自变量，以苦丁茶米酒的感官评分（Y）为响应值，经过回归拟合后，得出回归方程如下：
表4 回归模型方差分析
Table 4 Variance analysis of regression model
注：“**”表示对结果影响极显著（P＜0.01）；“*”表示对结果影响显著（P＜0.05）。
由表4可知，该模型F值为82.63，P值＜0.000 1表示该回归模型差异极显著；失拟项P值，0.069 9＞0.05，不显著。模型决定系数R2=0.979 7，校正决定系数R2=0.990 7，说明该回归模型与试验数据拟合程度高，可以用于苦丁茶米酒的工艺优化预测和分析。由P值可知，一次项A，交互项AC，二次项A2、B2、C2对苦丁茶米酒感官评分的影响极显著（P＜0.01）；一次项B，交互项BC对苦丁茶米酒感官评分影响显著（P＜0.05）。由F值可知，各因素对于苦丁茶米酒中感官评分的影响程度为酒曲添加量（A）＞料液比（B）＞发酵时间（C）。
2.2.2 响应面试验交互作用分析
从响应面试验的设计原理上看，三维曲线的弯曲度愈大，说明两个因素之间的相互作用对感官得分的影响愈显著。等高线图为三维曲线在底部的投影，若表现为圆形，则表示两因素间对感官评分的影响不显著；若表现为椭圆，则表明两因素间对感官评分的交互影响显著。各因素及其交互作用对苦丁茶米酒感官评分的影响结果见图4。
图4 各因素间交互作用对苦丁茶米酒感官评分影响的响应面和等高线
Fig.4 Response surface plots and contour lines of effects of interaction between each factors on sensory evaluation of Chinese bitter tea rice wine
据响应面Design-Expert 11.0.3软件分析得出苦丁茶米酒的最佳工艺为酒曲添加量0.61%、发酵时间98.41 h、料液比为1.00∶0.82（g∶mL），感官评分理论值为89.3分。为了试验的可操作性将软件得出的最优发酵工艺条件调整为酒曲添加量0.6%、发酵时间98.0 h、料液比为1.0∶0.8（g∶mL）。在此条件下进行3次平行验证试验，其感官评分平均实际值为89.7分。因此，采用响应面法优化苦丁茶米酒工艺得到的工艺条件准确可行。
2.3 成品指标检测结果与分析
2.3.1 感官分析
苦丁茶米酒产品整体呈淡绿色，呈微透明状，有光泽、甜香，入口有大米和苦丁茶的香味，酒香和茶香协调，后味带点茉莉花香，滋味爽口，其感官评分为89.7分。
2.3.2 理化指标检测
苦丁茶米酒产品酒精度为7.1%vol，糖度为19.7°Bx，茶多酚含量为0.867 mg/mL。
2.3.3 微生物指标
苦丁茶米酒产品菌落总数＜50 CFU/mL，大肠菌群＜3 MPN/100 mL，致病菌未检出。
3 结论
以大米和苦丁茶为主要原料制备苦丁茶米酒，通过单因素试验及响应面试验对苦丁茶米酒发酵工艺主要影响因素进行了优化。结果表明，苦丁茶米酒最佳发酵工艺为发酵时间98 h、料液比1.0∶0.8（g∶mL）、酒曲添加量0.6%、发酵温度30 ℃。在此最佳条件下，成品酒的酒精度为7.1%vol、茶多酚含量为0.867 mg/mL、糖度为19.7°Bx、感官评分为89.7分；产品的理化卫生指标中细菌总数＜70 CFU/mL，大肠菌群＜3.0 MPN/100 mL；产品的形态为淡绿色，透明发亮，甜度适中，富含茶多酚营养成分，入口有大米香味，后味有苦丁茶香味，口感悦人，酸甜适口，有新鲜感，香味纯正，冷藏后饮用更佳。
该产品的开发与研究，为苦丁茶、大米开发出了良好的健康、巨大的市场前景。且该法采用水作为萃取液，充分发挥和保存了茶叶中的活性物质，提高了它的营养价值和保健作用，同时在酿造工艺中，不添加人工色素、香料、化学稳定性，产品能保持6个月以上，达到食品卫生与保健的需要，具有很强的市场竞争力，该方法酿造茶酒工艺简单，操作方便，生产可行。
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