黑米属于糯米类，颜色呈黑色或褐色，其营养丰富，其粒型有“粳、籼”2种，粒质包含非糯性和糯性[1-2]。黑米具有降低胆固醇，预防心脑血管疾病，健脾开胃，促进儿童骨骼增长、大脑发育等功效[3-4]。小米是一种无麸质、营养丰富的全谷物食品，含有多种维生素、矿物质和高水平的蛋白质[5]。黑玉米又称为黑糯玉米、紫玉米，含有丰富的蛋白质、维生素、花青素，具有良好的抗氧化作用和抗癌的功效[6-7]。牛奶富含钙、优质蛋白质和维生素，适量摄入能提高人的健康水平[8]。
风味发酵乳是以牛奶为主要原料，通过灭菌冷却后添加乳酸菌发酵剂，添加或不添加谷物、果蔬等，经恒温发酵制得一种发酵乳制品[9-10]。其中，谷物发酵乳中含有较多的益生菌、膳食纤维、B族维生素，能优化肠道菌群，对肠道疾病、便秘具有良好的预防和治疗作用[11-12]，对于平衡膳食具有不可代替的作用。已有以谷物为原料制作功能性发酵饮料，如大麦发酵乳、玉米发酵乳、小麦发酵乳以及多种谷物发酵乳[13]。蒋雅馨等[14]以糜米、玉米碎、大米为主要原料，植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）为发酵剂，确定了谷物乳酸菌发酵饮料的最佳制备工艺和配方。闫丽丽等[15]以糜米为原料，以2株乳酸菌作为发酵菌株，确定了糜米乳酸菌发酵饮料的预处理条件和发酵工艺，该产品可在4 ℃保存28 d。陈娟等[16]以燕麦、黑米、糙米为原材料，经过超微粉碎、液化、糖化接种混合发酵剂，确定了谷物发酵饮料的生产工艺和配方。然而，国内外研究开发的谷物发酵产品多以谷物与发酵剂进行发酵，营养较单一，因此，开发不同风味的谷物发酵乳对丰富乳制品的营养价值具有重要意义。
本研究以谷物黑米、小米、黑玉米与牛奶为主要原料，制备谷物牛奶复合发酵乳，采用单因素试验及响应面试验对其发酵工艺条件进行优化，对其品质进行评价，并确定产品保质期，旨在为谷物类和乳类农产品的深加工提供理论依据和数据支持，丰富乳品市场开辟新的途径，满足人们对酸乳产品口味多样化和营养健康的需求。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
黑米、小米、黑玉米、白砂糖、牛奶：市售；酸奶发酵剂：昆山佰生优生物科技有限公司；纯净水：华润怡宝饮料有限公司；羧甲基纤维素钠（carboxyl methyl cellulose，CMC）（分析纯）：孟州市华兴生物化工有限责任公司；MRS培养基、MC培养基：青岛高科技工业园海博生物技术有限公司。
1.2 仪器与设备
HH·BII·421-BS型电热恒温培养箱：上海跃进医疗机械厂；KDN-08B（05B）型定氮仪：上海洪纪仪器设备有限公司；YX-280A型高压灭菌锅：上海申安医疗器械厂；FSH-2A型均质机：宁波新芝科技股份有限公司；DJ12B-A10型九阳破壁机：杭州九阳豆业有限公司；WFF-26A食品发酵箱：广州市泓锋食品机械有限公司。
1.3 方法
1.3.1 谷物牛奶复合发酵乳加工工艺流程及操作要点
操作要点：
谷物预处理：黑米、小米、黑玉米去杂质、淘洗，控干谷物表面水分。
打浆：黑米、小米、黑玉米按质量比1∶1∶1，放入破壁机中，按照料液比1∶15（g∶mL）加纯净水，在料液保持微沸下打浆20 min，冷却至40 ℃左右。
均质：将0.4%CMC与6%白砂糖混合均匀后溶解于纯牛奶中[17-18]，并与20%谷物浆液混合均匀，置于均质机中，在15 MPa、65 ℃条件下均质。
灭菌：混合物料于85 ℃条件下杀菌20 min，冷却至40 ℃[19]。
发酵、搅拌：接种0.4%酸奶发酵剂[20]，在42 ℃条件下发酵6 h[21]，待发酵罐内发酵乳呈凝固的非流体状态，发酵完成，在无菌条件下用玻璃棒破乳搅拌均匀。
灌装、后熟：无菌环境下，灌装至无菌玻璃包装容器中，封盖，于2～4 ℃条件下，后熟10 h[22]，即得谷物牛奶复合发酵乳。
1.3.2 谷物牛奶复合发酵乳发酵条件优化单因素试验
固定基本条件为：以1 000 g纯牛奶为基准称取其他原料或辅料，CMC添加量为0.4%、发酵剂添加量为0.4%，白砂糖添加量为6%，谷物浆添加量为20%，在42 ℃下发酵6 h。采用单因素轮换法分别考察料水比（1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25（g∶mL））、发酵剂添加量（0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%）、发酵温度（38 ℃、40 ℃、42 ℃、44 ℃、46 ℃）、发酵时间（5 h、6 h、7 h、8 h、9 h）、白砂糖添加量（5%、6%、7%、8%、9%）、谷物浆添加量（10%、20%、30%、40%、50%）对谷物牛奶复合发酵乳感官评分及酸度的影响。
1.3.3 谷物牛奶复合发酵乳发酵条件优化响应面试验
以单因素试验结果为依据，选取对结果影响较大的因素发酵剂添加量（A）、发酵温度（B）、发酵时间（C）、料水比（D）为自变量，以感官评分为响应值（Y），进行响应面试验设计，采用4因素3水平的Box-Behnken试验对谷物牛奶复合发酵乳的发酵条件进行优化，试验设计因素与水平表1。
表1 发酵条件优化响应面试验因素及水平
Table 1 Factors and levels of response surface tests for fermentation conditions optimization
1.3.4 谷物牛奶复合发酵乳的感官评价
依据GB 19302—2010《食品安全国家标准发酵乳》[9]和相关文献[23-24]，制定谷物牛奶复合发酵乳的感官评价标准，具体评价标准见表2，邀请10位专业人员从气味、色泽、滋味及组织状态对谷物牛奶复合发酵乳进行感官评价，满分为100分。
表2 谷物牛奶复合发酵乳感官评价标准
Table 2 Sensory evaluation standards of grain-milk compound fermented milk
1.3.5 谷物牛奶复合发酵乳产品贮存期间的品质变化
谷物牛奶复合发酵乳饮料在2～4 ℃条件下保藏25 d，每隔3 d测定其pH值、持水力、乳酸菌活菌数、酸度变化情况，并进行感官评价。
1.3.6 分析检测
（1）理化指标测定
pH 值的测定：采用pH 计；酸度的测定：按照GB 5009.239—2016《食品安全国家标准食品酸度的测定》[25]，蛋白质含量的测定：按照GB 5009.5—2016《食品安全国家标准食品中蛋白质的测定》[26]；黏度的测定：采用旋转式黏度计[27-28]。
持水力的测定：取10 g样品，将样品离心20 min，将乳清倒出来后称其质量，计算持水力，其计算公式如下：
花青素含量的测定：用pH示差法[32]测定谷物牛奶复合发酵乳在发酵前后花青素含量的变化，计算花青素含量，其计算公式如下：
式中：ΔA表示谷物复合发酵饮料提取液中花青素的总吸光度值；A520nm表示样品在波长520 nm处测得的吸光度值，A700nm表示样品在波长700 nm处测得的吸光度值，DF表示样品稀释倍数；M表示矢车菊素-3-葡萄糖苷的相对分子质量为449.2 g/mol；ε表示矢车菊素-3-葡萄糖苷的吸光系数为26 900 L/（mol·cm）；L表示光程长度为1 cm[33]；Wt表示产品的质量，g；V表示最终体积，mL。
（2）微生物指标测定
菌落总数的检测：按照GB/T 4789.2—2016《食品安全国家标准食品微生物学检验菌落总数测定》的平板菌落计数法[29]；大肠菌群的检测：按照GB/T 4789.3—2016《食品安全国家标准食品微生物学检验大肠菌群计数》[30]；乳酸菌落数的测定：按照GB 4789.35—2016《食品安全国家标准食品微生物学检验乳酸菌活菌数测定》[31]。
1.3.7 数据处理
利用SPSS26.0软件和Origin8.0对数据进行处理，同时利用Design Expert 10.0.3对试验进行设计并进行数据建模处理。
2 结果与分析
2.1 发酵工艺优化单因素试验结果
2.1.1 料水比的确定
料水比对谷物牛奶复合发酵乳感官评分和酸度的影响见图1。
由图1可知，随着料水比在1∶5～1∶25（g∶mL）范围内变化，酸度变化不明显。当料水比在1∶5、1∶10、1∶15（g∶mL）范围内时，感官评分逐渐增加；当料水比为1∶15（g∶mL）时，感官评分达到最大值，为84分；当料水比为1∶15、1∶20、1∶25（g∶mL）时，感官评分逐渐下降。因此，最适料水比为1∶15（g∶mL）。
图1 料水比对谷物牛奶复合发酵乳感官评分和酸度的影响
Fig.1 Effect of solid and water ratio on sensory quality and acidity of grain-milk compound fermented milk
2.1.2 发酵剂添加量的确定
酸奶发酵剂的添加量对谷物牛奶复合发酵乳感官评分和酸度的影响见图2。
图2 酸奶发酵剂添加量对谷物牛奶复合发酵乳感官评分和酸度的影响
Fig.2 Effect of yogurt starter addition on sensory quality and acidity of grain-milk compound fermented milk
由图2可知，随着酸奶发酵剂添加量在0.2%～0.6%范围内的增加，酸度上升。当发酵剂添加量在0.2%～0.4%范围内增加，感官评分逐渐增加；当酸奶发酵剂添加量为0.4%时，感官评分达到最大值，为85分；当酸奶发酵剂添加量＞0.4%时，感官评分逐渐下降。当酸奶发酵剂添加量＜0.4%时，产品发酵状态不佳，风味产生不足；当酸奶发酵剂添加量为0.4%时，感官评分最高，产品口感细腻，酸甜适中，组织状态均匀；当酸奶发酵剂添加量＞0.4%时，产品酸味明显，口感不协调，出现分层和乳清析出现象[34]。因此，最适发酵剂添加量为0.4%。
2.1.3 发酵温度的确定
发酵温度对谷物牛奶复合发酵乳感官评分和酸度的影响见图3。由图3可知，随着发酵温度在38～46 ℃范围内的升高，酸度呈上升趋势。当发酵温度在38～42 ℃范围内的增加，感官评分逐渐增加；当发酵温度为42 ℃时，感官评分达到最大值，为88分；当发酵温度高于42 ℃时，感官评分逐渐下降。发酵温度偏低，产品的发酵风味不足，凝乳状态较差；当发酵温度达到42 ℃时，组织状态细腻，酸甜适口，凝乳状态较好；当发酵温度高于44 ℃时，部分乳酸菌因为温度过高失活，发酵风味不足。因此，最适发酵温度为42 ℃。
图3 发酵温度对谷物牛奶复合发酵乳感官品质和酸度的影响
Fig.3 Effect of fermentation temperature on sensory quality and acidity of grain-milk compound fermented milk
2.1.4 发酵时间的确定
发酵时间对谷物牛奶复合发酵乳感官品质和酸度的影响见图4。由图4可知，随着发酵时间在5～9 h范围内的增加，酸度呈上升趋势。随着发酵时间在5～6 h范围内的增加，感官评分呈上升趋势；当发酵时间为6 h时，感官评分达到最大值，为85分；当发酵时间＞6 h时，感官评分呈下降趋势。当发酵时间过短，乳酸菌发酵产酸及风味不足，口感较甜；当发酵时间为6 h时，谷物牛奶复合发酵乳酸甜可口，发酵风味突出；当发酵时间过长，酸味明显，同时有异味产生。因此，最适发酵时间为6 h。
图4 发酵时间对谷物牛奶复合发酵乳品质和酸度的影响
Fig.4 Effect of fermentation time on sensory quality and acidity of grain-milk compound fermented milk
2.1.5 白砂糖添加量的确定
白砂糖添加量对谷物牛奶复合发酵乳感官评分和酸度的影响见图5。由图5可知，随着白砂糖添加量在5%～9%范围内的增加，酸度呈缓慢上升趋势。当白砂糖添加量在5%～6%时，谷物牛奶复合发酵乳感官评分逐渐增加；当白砂糖添加量为6%时，感官评分最高，为85分，谷物牛奶复合发酵乳产酸甜可口，黏稠度适中，口感细腻；当白砂糖添加量＞6%时，感官评分有所下降。因此，最适白砂糖添加量为6%。
图5 白砂糖添加量对谷物牛奶复合发酵乳感官品质和酸度的影响
Fig.5 Effect of sugar addition on sensory quality and acidity of grain-milk compound fermented milk
2.1.6 谷物浆添加量的确定
谷物浆添加量对谷物牛奶复合发酵乳感官评分和酸度的影响见图6。由图6可知，随着谷物浆添加量在10%～50%范围内的增加，酸度呈上升趋势。当谷物浆添加量在10%～20%范围内增加时，感官评分逐渐增加；当谷物浆添加量为20%时，感官评分最高，为88分；当谷物浆添加量＞20%时，感官评分逐渐下降。谷物浆添加量＜20%时，谷物自然香气不明显，色泽较浅；谷物浆添加量为20%时，谷物牛奶复合发酵乳色泽呈淡紫色，口感细腻适口，组织状态均匀；当谷物浆添加量＞20%时，口感稍酸，组织状态不均匀，产品稍稀薄。因此，最适谷物浆添加量为20%。
图6 谷物浆添加量对谷物牛奶复合发酵乳感官品质和酸度的影响
Fig.6 Effect of grain pulp addition on sensory quality and acidity of grain-milk compound fermented milk
2.2 发酵工艺优化响应面试验
2.2.1 响应面试验结果与方差分析
在单因素试验的基础上，固定白砂糖添加量为6%，谷物浆添加量为20%，选择发酵剂添加量（A）、发酵温度（B）、发酵时间（C）、料水比（D）为自变量，以感官评分为（Y）为响应值，进行4因素3水平的响应面试验设计，试验设计及结果见表3，方差分析结果见表4。
表3 发酵工艺优化响应面试验设计及结果
Table 3 Design and results of response surface experiments for fermentation process optimization
利用Design Expert 10.0.3软件对表3结果进行回归拟合，建立二次多项式回归方程为：Y=89.58+1.06A+2.59B+1.70C+1.10D+1.00AB-0.57AC-1.40AD-1.98BC+2.05BD-2.15CD-4.01A2-4.91B2-6.95C2-7.32D2。
由表4可知，该模型极显著（P＜0.000 1），失拟项不显著（P=0.056 8＞0.05），表明该回归模型合理且模型拟合度高，回归方程的决定系数R2=0.966 2，调整决定系数R2adj=0.932 3。可见，该模型中93.23%的感官评分变化来自自变量A、B、C和D，该模型可以很好地反映试验真实值，因此该方程可以用于试验结果的分析。由P值可知，一次项B、C、交互项CD、二次项A2、B2、C2和D2对谷物牛奶复合发酵乳的感官评分影响极显著（P＜0.01）。一次项A、D、交互项BC、BD对谷物牛奶复合发酵乳的感官评分影响显著（P＜0.05），交互项AB、AC和AD对谷物牛奶复合发酵乳的感官评分影响不显著（P＞0.05）。由F值可知，影响感官评分的因素顺序为：发酵温度（B）＞发酵时间（C）＞料水比（D）＞发酵剂添加量（A）。
表4 回归模型方差分析
Table 4 Variance analysis of regression model
注：“**”表示对结果的影响极显著（P＜0.01）；“*”表示对结果的影响显著（P＜0.05）。
2.2.2 响应面分析
各因素间交互作用对谷物牛奶复合发酵乳感官评分影响的响应曲面及等高线见图7。
3D曲面较为直观地反映了各因素之间的交互作用对感官评分的影响，3D曲面越陡峭、倾斜度越高，表明因素间的交互作用对响应值影响越大[35]。由图7可知，当发酵剂添加量（A）、发酵温度（B）、发酵时间（C）、料水比（D）两两交互时，对产品感官评分均有影响，BC、BD、CD的响应曲面较陡峭，且等高线图呈椭圆形，表明交互作用较为显著，这与方差分析结果一致。
图7 各因素间交互作用对感官评分影响的响应曲面及等高线
Fig.7 Response surface plots and contour lines of effects of interaction between various factors on sensory score
由Design Expert 10.0.3软件预测谷物牛奶复合发酵乳最佳发酵工艺条件为：发酵温度42.49 ℃、发酵时间6.10 h、料水比1∶15.40（g∶mL）、发酵剂添加量0.55%、白砂糖添加量6%，感官评分预测值为90.115 7分。为便于实际生产操作，将发酵工艺条件修正为：发酵温度42 ℃，发酵时间6 h，料水比1∶15（g∶mL），发酵剂添加量0.55%，白砂糖添加量6%。在此优化发酵工艺下进行3次平行验证试验，感官评分实际值为93分，与预测值相差不大，表明响应面优化的工艺条件可行。
2.3 谷物牛奶复合发酵乳理化指标和微生物检测结果
谷物牛奶复合发酵乳的理化和微生物指标见表5。
表5 谷物牛奶复合发酵乳的理化指标和微生物指标
Table 5 Physicochemical and microbiological indexes of grain-milk compound fermented milk
注：“-”表示国家标准对该指标未作规定。
由表5可知，产品的理化和微生物指标均符合GB 19302—2010《食品安全国家标准发酵乳》中风味发酵乳标准要求；发酵前花青素含量为7.68 mg/L，发酵后花青素含量为5.33 mg/L，减少了30%。
2.4 谷物牛奶复合发酵乳贮存期间品质的变化和保质期的确定
发酵乳的理想pH值在4.0～4.6之间[36]。谷物牛奶复合发酵乳在贮存期内品质的变化见图8。
图8 谷物牛奶复合发酵乳贮存期内pH、酸度（a）与持水力、感官评分和乳酸菌活菌数（b）的变化
Fig.8 Change of pH,acidity (a) and water retention,sensory scores,and number of viable lactic acid bacteria (b) during the storage of grain-milk compound fermented milk
由图8（a）可知，随着贮存天数在0～25 d内的延长，pH值逐渐下降，而酸度逐渐增加。当贮存时间为22 d时，pH值为4.15，酸度为90.9°T，谷物牛奶复合发酵乳口感细腻，酸甜基本协调，组织状态均匀。在23～25 d贮存期内，随着pH值的下降，口感稍酸，酸甜不协调，有少量乳清析出。
由图8（b）可知，在产品贮存期间，持水力呈缓慢下降趋势，产品贮存第22天时，持水力＞90%，具有良好的持水能力；乳酸菌活菌数在第3天稍有增加，之后呈下降趋势，第25天时产品的乳酸菌活菌数降至4.5×107 CFU/mL，仍符合国家标准（≥1×106 CFU/mL）规定[9]；感官评分呈缓慢下降趋势，贮存第22天，产品感官评分开始下降。综合考虑，为保证产品品质，保质期为21 d。
3 结论
谷物小米、黑米、黑玉米与牛奶为主要原料制备谷物牛奶复合发酵乳，通过单因素试验和响应面试验获得其最佳发酵工艺条件为：谷物与水按照料水比1∶15（g∶mL）打浆，以牛奶质量为基准，谷物浆添加量20%，发酵剂添加量0.55%、白砂糖添加量6%，在42 ℃条件下发酵6 h。在此优化条件下，谷物牛奶复合发酵乳的感官评分为93分，pH值为4.57，酸度为81.8 °T，持水力为95%，黏度为11.5（Pa·s），蛋白质含量为3.32 g/100 g，花青素含量为5.33 mg/L。该产品营养较为全面，且富含花青素，产品保质期为21 d。本产品的开发为谷物类和乳类农产品的深加工以及丰富乳品市场开辟了新的途径。
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