苦荞（Fagopyrum tataricum）是一种优质的药食两用谷物资源[1-2]，其植株适应性强，种植范围广，是医药和食品的优质谷物来源[3-4]。黄酮类化合物是苦荞中最重要的生物活性成分，具有抗氧化、抗糖尿病和降胆固醇等多种功效[5-6]。苦荞中淀粉含量高，占总干质量的70%左右[5]，是发酵酿造的理想原料。
苦荞因其丰富的营养物质及生物活性成分，受到国内外学者的广泛关注[7]。在食品和医药方面，都有不少的加工产品，苦荞馒头、苦荞面和苦荞茶等常见于日常生活中[8-10]。其中以苦荞作为发酵原料酿造的醋[9]、啤酒[11]、酸奶[12]等产品兼具有苦荞特征性风味及高营养价值[13]。作为小曲酒酿造研究国之一，我国学者已在苦荞小曲酒酿造方面进行了许多研究，万萍等[14]通过对酒曲和打量水的用量及粮糠比和发酵时间的研究对固态法酿造苦荞酒的工艺进行了初探；李园园[15]以苦荞米为原料，采用液态法对糖化及发酵工艺进行优化，使淀粉转化率和酒精度得以提高。但鲜有人研究半固态发酵工艺酿造苦荞小曲酒。
本研究以苦荞为原料，采用半固态发酵方法酿造苦荞小曲酒，并采用单因素试验及正交试验从不同料水比、发酵温度和发酵时间对苦荞小曲酒半固态发酵工艺进行研究，确定最优工艺条件，并采用气质联用法（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）测定苦荞小曲酒挥发性风味成分。以期为今后苦荞小曲酒的研究和生产提供一定的数据支撑。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
苦荞：四川省凉山彝族自治州；小曲：重庆市合川区鑫星曲药厂；酒石酸钾钠、五水硫酸铜、氢氧化钠、葡萄糖、亚铁氰化钾、盐酸、邻苯二甲酸氢钾、硫酸、无水乙醇（均为分析纯）：成都市科隆化学品有限公司。
1.2 仪器与设备
HWS-12电热恒温水浴锅：上海齐欣科学仪器有限公司；H01-1数显恒温磁力搅拌器：上海梅颖浦仪器仪表制造有限公司；DL-1电子万用炉：北京市永光明医疗仪器有限公司；DHG-9140A电热恒温鼓风干燥箱：上海一恒科技有限公司；GZ-250-S生化培养箱：韶关市广智科技设备有限公司；AR1140电子天平：奥豪斯国际贸易（上海）有限公司；Thermo 868 pH计：热电（上海）科技仪器有限公司；TSQ8000气相色谱-质谱联用（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）仪：美国Thermo公司。
1.3 试验方法
1.3.1 苦荞小曲酒的酿造工艺流程及操作要点
操作要点：
原料处理、泡粮：选择颗粒饱满，无霉粒的优质苦荞，苦荞按料水比1∶3（g∶mL），以先水（水温60 ℃）后粮的顺序加入泡粮容器中，由边缘先内部翻拌苦荞一次，刮平，过程中不再搅拌，避免产酸，浸泡4 h。
蒸粮、出甑：将浸泡好的苦荞沥去水分，倒入甑内，圆气后加盖蒸40 min，蒸熟的苦荞饱满，手捏软绵，无硬心。
摊晾、拌小曲：将蒸熟的苦荞取出放于摊晾盘中，摊凉至40 ℃左右加入苦荞质量0.6%的小曲。
培菌糖化：将拌好小曲的粮醅置于白瓷盘中盖上纱布，于30 ℃条件下糖化25 h。在2 h内完成摊晾、拌曲和上箱，以防止杂菌的感染，以免影响培菌。
半固态发酵：糖化完成后，将粮醅装入5 L白酒发酵罐封口发酵，按料水比1∶1.5（g∶mL）加水混合均匀，于28 ℃恒温发酵9 d。
蒸馏：采用液态蒸馏法，保证摘酒温度维持在25 ℃以下，掐头去尾接酒，得到原酒。
1.3.2 苦荞小曲酒半固态发酵工艺优化单因素试验
通过出酒率、总酸含量、总酯含量及感官评分进行判定，分别考察料水比（1.0∶0.5、1.0∶1.0、1.0∶1.5、1.0∶2.0、1.0∶2.5（g∶mL）），发酵时间（5 d、7 d、9 d、11 d、13 d），发酵温度（24 ℃、26 ℃、28 ℃、30 ℃、32 ℃）3个因素对苦荞小曲酒品质的影响，探究最佳酿造工艺条件。
1.3.3 苦荞小曲酒半固态发酵工艺优化正交试验
在单因素试验结果的基础上，以出酒率为评价指标，采用3因素3水平L9（33）正交试验对料水比（A）、发酵时间（B）和发酵温度（C）进行优化，确定苦荞小曲酒的最佳半固态发酵条件，正交试验因素与水平见表1。
表1 苦荞小曲酒半固态发酵条件优化正交试验因素与水平
Table 1 Factors and levels of orthogonal experiment for semi-solid fermentation conditions optimization of tartary buckwheat Xiaoqu Baijiu
1.3.4 理化指标测定
总固形物含量的测定：参照《酿酒分析与检测》[16]中的方法；酒精度的测定：参考GB/T 10345—2007《白酒分析方法》[17]中的酒精计法；总酸、总酯的测定：参考GB/T 10345—2007《白酒分析方法》[17]中的指示剂法。
1.3.5 原料出酒率的计算
1.3.6 感官评定
由12位前期经过白酒品评训练的专业人员依据DBS52/005—2014《小曲清香型白酒》[18]进行感官评定，感官评分标准见表2，取12人的平均分，满分100分。
表2 苦荞小曲酒的感官评分标准
Table 2 Sensory scoring standards of tartary buckwheat Xiaoqu Baijiu
1.3.7 苦荞小曲酒挥发性风味成分分析
苦荞小曲酒中挥发性风味成分测定采用GC-MS法。分析条件设定见参考文献[19]。挥发性产物的定性、定量分析参照文献[20]。
2 结果与分析
2.1 苦荞小曲酒半固态发酵工艺优化单因素试验
2.1.1 料水比对苦荞小曲酒品质的影响
不同料水比对苦荞小曲酒出酒率和感官评价的影响见图1。由图1可知，随着料水比的变化，苦荞小曲酒出酒率和感官评分呈先升高后降低的趋势，料水比为1.0∶1.5（g∶mL）时出酒率和感官评分均为最高，分别为（57.54±0.30）%、（82.37±0.50）分。这可能是因为水分太少会抑制酵母的生产繁殖，以致于出酒率不高、而水分含量太高，则会稀释酒精度，从而降低出酒率。因此，选取料水比为1.0∶1.5（g∶mL）为宜。
图1 不同料水比对苦荞小曲酒出酒率和感官评分的影响
Fig.1 Effect of different material and water ratios on the liquor yield and sensory score of tartary buckwheat Xiaoqu Baijiu
不同字母表示差异显著（P＜0.05）。下同。
不同料水比对苦荞小曲酒总酸和总酯含量的影响见图2。由图2可知，随着料水比的减小，苦荞小曲酒总酸、总酯含量整体呈先略微上升后下降的趋势。当料水比在1.0∶0.5～1.0∶1.5（g∶mL）范围内变化时，总酸、总酯含量变化不显著（P＞0.05），在料水比＜1.0∶1.5（g∶mL）后，总酸、总酯含量下降显著（P＜0.05）；因此，选取料水比为1∶1.5（g∶mL）为宜。
图2 不同料水比对苦荞小曲酒总酸和总酯含量的影响
Fig.2 Effect of different material and water ratios on total acids and total esters content of tartary buckwheat Xiaoqu Baijiu
综合上述分析，确定料水比为1.0∶1.5（g∶mL）。
2.1.2 发酵时间对苦荞小曲酒品质的影响
不同发酵时间对苦荞小曲酒出酒率和感官评价的影响见图3。由图3可知，随着发酵时间的延长，苦荞小曲酒出酒率呈先升高后降低的趋势，发酵时间9 d时出酒率最高，为（58.56±0.26）%；这可能是因为9 d后酵母进入停滞或衰退期，不再合成酒精，导致出酒率降低。同时，随着发酵时间的延长，感官评分呈先上升后逐渐趋于平稳的趋势，发酵时间＞9 d后，变化不显著（P＞0.05）。因此，选择发酵时间9 d为宜。
图3 不同发酵时间对苦荞小曲酒出酒率和感官评分的影响
Fig.3 Effects of different fermentation time on the liquor yield and sensory score of tartary buckwheat Xiaoqu Baijiu
不同发酵时间对苦荞小曲酒总酸和总酯含量的影响见图4。由图4可知，随发酵时间的延长，苦荞小曲酒总酸、总酯含量先逐渐增加，发酵时间＞9 d后趋于平稳，变化不显著（P＞0.05）。这可能由于在发酵过程中随着微生物的生长繁殖都会产生各种有机酸类物质。因此，选择发酵时间9 d为宜。
图4 不同发酵时间对苦荞小曲酒总酸和总酯的影响
Fig.4 Effects of different fermentation time on total acids and total esters of tartary buckwheat Xiaoqu Baijiu
综合上述分析，确定发酵时间为9 d。
2.1.3 发酵温度对苦荞小曲酒品质的影响
不同发酵温度对苦荞小曲酒出酒率及感官评价的影响见图5。由图5可知，随着发酵温度的升高，苦荞小曲酒出酒率和感官评价均先升高后降低的趋势。发酵温度为28 ℃时出酒率和感官评分均为最高，分别为（58.52±0.4）%、（84.75±0.37）分；这是由于过低的温度使酵母的生长和代谢较缓慢，使其产酒率低，温度过高使酵母利用还原糖代谢产出酒精的能力下降。因此，选择发酵温度28 ℃为宜。
图5 不同发酵温度对苦荞小曲酒出酒率和感官评分的影响
Fig.5 Effects of different fermentation temperature on the liquor yield and sensory score of tartary buckwheat Xiaoqu Baijiu
不同发酵温度对苦荞小曲酒总酸和总酯含量的影响见图6。由图6可知，随着发酵温度的升高，苦荞小曲酒总酸、总酯含量而逐渐增加，当发酵温度达到28 ℃后则无明显变化（P＞0.05）。因此，选择发酵温度28 ℃为宜。
图6 不同发酵温度对苦荞小曲酒总酸和总酯的影响
Fig.6 Effects of different fermentation temperature on total acids and total esters of tartary buckwheat Xiaoqu Baijiu
综合上述分析，确定发酵温度为28 ℃。
2.2 苦荞小曲酒半固态发酵工艺优化正交试验结果
苦荞小曲酒半固态发酵条件优化正交试验结果与分析见表3，方差分析见表4。
表4 正交试验结果方差分析
Table 4 Variance analysis of orthogonal tests results
注：F0.05（2，2）=19，F0.01（2，2）=99，“*”表示对结果影响显著（P＜0.05），“**”表示对结果影响极显著（P＜0.01）。
由表3可知，3个因素对出酒率高低的影响顺序为料水比（A）＞发酵温度（C）＞发酵时间（B）。通过极差分析得到半固态发酵工艺最佳条件组合为A2B2C2，即料水比1.0∶1.5（g∶mL）、发酵时间9 d、发酵温度28 ℃。
表3 苦荞小曲酒半固态发酵条件优化正交试验结果与分析
Table 3 Results and analysis of orthogonal experiments for semi-solid fermentation conditions optimization of tartary buckwheat Xiaoqu Baijiu
由表4可知，料水比对半固态发酵过程中出酒率有极显著影响（P＜0.01），发酵温度对半固态发酵过程中出酒率有显著影响（P＜0.05），发酵时间对半固态发酵过程中出酒率影响不显著（P＞0.05）。
将正交试验中由直观分析所得的最优组合A2B1C2（对照组）和理论最优组合A2B2C2（验证组）同时进行5次重复验证试验。结果发现，组合A2B1C2出酒率为（58.28±0.26）%，组合A2B2C2出酒率为（58.96±0.39）%，两组出酒率有显著性差异（P＜0.05），且理论最优组较高。故选择最优半固态发酵工艺条件为A2B2C2，即料水比1∶1.5（g∶mL）、发酵时间9 d、发酵温度28 ℃。
2.3 苦荞小曲酒部分理化指标分析
对最佳工艺条件下酿造的苦荞小曲酒进行质量评价，结果见表5。由表5可知，苦荞小曲酒酒精度为（52.70±0.92）%vol；出酒率为（58.06±0.65）%；总酸和总酯的含量分别为（0.69±0.07）g/L和（2.18±0.19）g/L，总酸和总酯比例协调；经测定基酒中的总固形物含量为（0.09±0.01）g/L；感官评分为（85.33±0.58）分，且每批次酿造出的苦荞小曲酒的酒体都清亮透明且香味协调，具有乙酸乙酯为主体的协调性复合香气且伴有苦荞特有的清香。苦荞小曲酒的各项理化指标均符合GB/T 26761—2011《小曲固态法白酒》[21]要求。
表5 苦荞小曲酒部分理化指标分析结果
Table 5 Analysis results of some physicochemical indexes of tartary buckwheat Xiaoqu Baijiu
2.4 苦荞小曲酒挥发性风味成分分析
采用GC-MS检测最优工艺条件下生产的苦荞小曲酒的挥发性风味成分，结果见表6。
表6 苦荞小曲酒挥发性风味成分GC-MS分析结果
Table 6 Results of volatile components in tartary buckwheat Xiaoqu Baijiu analysis by GC-MS
续表
注：“ND”表示未查阅到相关资料。
由表6可知，利用GC-MS从苦荞小曲酒中共检出53种挥发性风味成分，包括23种醇类物质、19种酯类物质、5种酸类物质、2种醛类物质、3种烃类物质、1种其他类物质。其中酯类化合物和芳香族化合物是最突出的化合物。其中对酒体的主要香型和风格影响最大的就是酯类化合物。它们主要以乙酯的形式存在，赋予小曲酒以果香和花香的感官特征[22]。乙酸乙酯和乳酸乙酯在苦荞小曲酒中的含量最高。苦荞小曲酒中的酯类香气成分主要来自微生物的代谢和生化反应，还有少数是通过酯化反应产生的[23]。醇类化合物中，除乙醇外含量较高的是异戊醇、异丁醇、正丙醇、2-甲基丁醇、正戊醇、乙偶姻、异丁醇。其中异丁醇、异戊醇是杂醇油的主要成分，含量过高会使人头痛、头晕等[24]。乙酸是苦荞小曲酒中含量最高的酸类化合物，达870.95 mg/L，酸类化合物具有维持酯类香气的作用[25]。
3 结论
本试验以苦荞为原料，以小曲为糖化发酵剂，采用半固态发酵法酿造苦荞小曲酒，采用单因素及正交试验优化得到最优半固态发酵工艺为料水比1.0∶1.5（g∶mL）、发酵时间9 d、发酵温度28 ℃。在此条件下发酵的苦荞小曲酒酒精度为52.7%vol；出酒率为58.06%；总酸和总酯的含量分别为0.69 g/L、2.18 g/L；总固形物含量为0.09 g/L；感官评分为85.33分。采用GC-MS从苦荞小曲酒中共检出挥发性成分53种，其中23种醇类物质、19种酯类物质、5种酸类物质、2种醛类物质、3种烃类物质、1种其他类物质。本研究为后续半固态法酿造苦荞小曲酒的生产和研发提供理论依据和技术参考。
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