高粱[Sorghum bicolor（L.）Moench]是禾本科高粱属作物，是酿造中国白酒的主要原料[1]。以往研究显示，不同品种高粱可能因理化成分（支链淀粉、单宁、脂肪等）含量的不同而导致白酒香味物质的组成出现差异，影响酒质。如WU Q等[2]将酿酒酵母接种到高粱浸提液中，发现发酵液的醇、酯含量与高粱的脂肪和单宁含量呈负相关（P＜0.05）。通过模拟酿造试验，有研究发现当高粱单宁含量＜1.94%时，其含量与酒体乙酸乙酯、辛酸乙酯的含量呈正相关，与乳酸乙酯呈负相关（P＜0.05）[3]。然而，目前针对不同高粱酿造酒质差异的解析主要依赖实验室发酵实验进行[4-8]，大生产条件下的酒质差异及其与理化品质的关系还未被充分揭示[9-13]，导致白酒企业在选择酿酒原料时无据可依，也阻碍了对白酒发酵机制的深入认识。
清香型白酒是中国白酒的主要香型之一，其酿造周期较短、工艺相对简单[14]，是评价原料酿酒效果的理想模型。本研究以四川酒类企业广泛应用的3种高粱为材料，揭示它们酿造清香型白酒的香味物质差异及其与理化品质的关系，以期为优质酿酒高粱的选育改良及其推广应用提供科学依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
泸州红1号高粱（粗蛋白9.38%、粗脂肪3.37%、粗淀粉73.00%、单宁1.70%、支链淀粉93.00%）和金糯梁1号高粱（粗蛋白9.70%、粗脂肪3.54%、粗淀粉74.23%、单宁1.31%、支链淀粉92.40%）：由本研究所选育而成；澳洲AZ高粱（粗蛋白11.19%、粗脂肪4.96%、粗淀粉78.42%、单宁0.48%、支链淀粉81.22%）：由开展酿酒试验的酒厂提供。
内标以及香味物质的标准品（均为色谱纯）：美国Sigma-Aldrich公司；高粱理化成分分析所需的常规理化试剂：生工生物工程（上海）股份有限公司；酿造试验所用的小曲（发酵剂）：四川省彭州华西曲药厂。
1.2 仪器与设备
Clarus 500气相色谱（gas chromatography，GC）仪配有火焰离子化检测器（flame ionization detector，FID）：美国PerkinElmer 公司；CP-Wax 57 CB色谱柱（50 m×0.25 mm×0.2 μm，酸性）：美国Agilent公司；XPR205D5/AC电子分析天平：瑞士Mettler Toledo公司；HH-M8恒温水浴锅：江苏新春兰科学仪器有限公司；H03-B磁力搅拌器：上海梅颖浦仪器仪表制造有限公司。
1.3 方法
1.3.1 高粱理化成分分析
粗蛋白、粗脂肪、粗淀粉、支链淀粉和单宁含量：参照文献[15]的方法测定。
1.3.2 酒样发酵
清香型白酒酿造试验在四川省泸州市的某两个酒厂（LHK、JGB）同时进行。在LHK酒厂，除澳洲AZ用3个地缸发酵外，另两种高粱为6个地缸；在JGB酒厂，每种高粱用3个地缸发酵。每个地缸投入高粱、小曲和糠壳的质量分别为800 kg、4 kg和64 kg。各酒厂的酿造生产由同一批工人操作，发酵期7 d。发酵结束后，每个地缸取出的酒醅分为2甑蒸馏。蒸馏结束后，将每甑酒样混合后取100 mL混合酒样供试，共24份酒样。
1.3.3 酒样香味物质分析
用无菌蒸馏水将酒样的酒精度稀释为60.5%vol后，采用气相色谱仪检测香味物质的含量，用2-甲基-2-丁醇、乙酸戊酯和2-乙基丁酸作内标进行定量，色谱反应条件参见文献[16]。
1.3.4 酒样感官评价
由泸州老窖、金雁酒业等白酒企业的7名国家级酒质评委对酒样进行感官品评，描述酒样的总体风味特征。
1.3.5 数据统计
采用主成分分析（principal component analysis，PCA）和双因素置换多元方差分析（Two-way PERMANOVA）揭示酒样香味物质的结构组成及其差异；利用曼特尔检验（Mantel test）揭示香味物质和高粱理化成分的Pearson相关性，香味物质和理化成分的矩阵分别用Bray-Curtis 和Euclidean 距离表征。以上分析通过PAST 3软件[17]完成。采用偏最小二乘法-判别分析（partial least squares-discriminant analysis，PLS-DA）筛查不同品种高粱酒样的差异香味物质，筛查标准：变量权重值（variableimportantinprojection，VIP）≥1且含量倍数变化（fold change，FC）≥1.2 或≤0.83。PLS-DA和韦恩（Venn）分析通过R软件完成。酒样香味物质含量的单因素方差分析、高粱理化成分和香味物质含量的Pearson相关性分析以及多元线性回归分析（进入法）均由SPSS 20.0完成。图片制作通过GraphPad Prism（8.0）完成。
2 结果与分析
2.1 酒样香味物质的含量差异
白酒香味物质以醇、醛、酸、酯为主，其组成决定酒质的优劣[18]。由表1可知，3种高粱酒样中不同香味物质的含量差异在不同酒厂的表现形式有一定差异。澳洲AZ高粱酒样的酯、醛、酸类物质含量在两个酒厂均处于较低水平；不同之处包括多个方面，如澳洲AZ酒样的醇类含量在JGB酒厂显著高于泸州红1号和金糯粱1号，在LHK酒厂却显著低于金糯粱1号（P＜0.05）。
表1 不同品种高粱酿造酒样的挥发性香味物质含量
Table 1 Flavor compound contents of Baijiu samples brewed from different sorghum varieties
注：同列数值标注不同字母表示差异显著（P＜0.05）。
2.2 酒样香味物质的结构差异
由图1可知，3种高粱酒样检测出36种香味物质，包括8种醇、9种酸、6种醛、11种酯和2种酮类。3种高粱酒样在LHK酒厂均以乙酸乙酯、3-甲基丁醛和异丁醇为主，在JGB酒厂的优势香味物质有差异，如金糯粱1号酒样以乙酸乙酯、3-甲基丁醛和乙酸为主，泸州红以乙酸乙酯、亚油酸乙酯和3-甲基丁醛为主，澳洲AZ酒样则以乙酸乙酯、亚油酸乙酯和异丁醇为主。
图1 不同品种高粱酿造酒样香味物质的结构组成
Fig.1 Structural composition of flavor compound of Baijiu samples brewed from different sorghum varieties
注：红色边框标注前三位优势香味物质；JNL、LZH、AZ分别代表金糯粱1号、泸州红1号、澳洲AZ。下同。
酒样香味物质的PCA结果见图2。由图2可知，主成分1（PC1）和主成分2（PC2）的累计方差贡献率为92.80%，说明已提取到原始数据的绝大部分信息。Two-wayPERMANOVA分析结果表明，酒样香味物质的结构组成受到酒厂、高粱品种以及两者交互作用的显著影响（P＜0.05）。
图2 不同品种高粱酿造酒样香味物质的主成分分析
Fig.2 Principal component analysis of Baijiu samples brewed from different sorghum varieties
2.3 酒样差异香味物质的筛查
因酒样香味物质的结构组成具有酒厂差异，分别以区分和不区分酒厂的两种方式筛查不同高粱酒样的差异香味物质以确定两者之间的交集。若某一物质在两种筛查方式中均被获得，且品种间的含量倍数变化一致，说明其受酒厂因素的影响较小，是酒样中较可靠的差异香味物质。如图3所示，两个酒厂筛查出的差异香味物质数量及其种类具有显著差异，其中共有11个不同的差异香味物质稳定存在于不同高粱的酒样之间，并且在两种筛查方式中的含量变化趋势一致（表2）。由表2可知，金糯粱1号酒样的甲酸乙酯、乙酸乙酯、乙醛、乙缩醛和3-甲基丁醛以及泸州红1号酒样的甲酸乙酯、乙酸乙酯、乳酸乙酯、乙酸、己酸和辛酸含量显著高于澳洲AZ酒样；金糯粱1号酒样的甲酸乙酯和亚油酸乙酯含量显著低于泸州红1号，但异戊酸含量显著高于泸州红1号。
表2 不同品种高粱酿造酒样的差异香味物质
Table 2 Differential flavor compounds of Baijiu samples brewed from different sorghum varieties
注：“INF”表示在LHK酒厂生产的泸州红1号酒样中未检出异戊酸。
图3 不同品种高粱酿造酒样差异香味物质的韦恩图
Fig.3 Venn diagrams of differential flavor compounds of Baijiu samples brewed from different sorghum varieties
2.4 酒样香味物质和高粱理化成分的相关性分析
由表3可知，酒样香味物质与高粱的粗蛋白、粗脂肪、粗淀粉、单宁和支链淀粉含量均显著相关（P＜0.05）。以酒样香味物质PCA的PC1数值为因变量，高粱理化成分为自变量构建多元线性回归模型，结果见表4。由表4可知，单宁和支链淀粉含量对PC1的数值具有显著影响（P＜0.05），说明它们是影响酒样香味物质组成结构的主要因子。基于回归模型，建立了基于单宁（X4）和支链淀粉（X5）预测PC1数值的回归方程：PC1=-28.178-3.261X4+0.359X5。回归方程的R2为0.337，表明对PC1 数值变化的解释度为33.70%。
表3 不同品种高粱酿造酒样香味物质和高粱理化成分的Pearson相关性分析结果
Table 3 Pearson correlation analysis results of flavor compound of Baijiu samples brewed from different sorghum varieties and physicochemical properties of sorghum
表4 高粱理化成分对酒样香味物质主成分1数值的多元线性回归分析
Table 4 Multiple linear regression analysis of physicochemical properties of sorghum and principal component 1 of flavor compounds of Baijiu samples
注：粗蛋白、粗脂肪和粗淀粉在回归分析中是排除变量，表5同。
2.5 酒样差异香味物质和高粱理化成分的相关性分析
由图4可知，甲酸乙酯、乙酸乙酯和乙缩醛的含量与粗蛋白、粗脂肪和粗淀粉的含量呈显著负相关（P＜0.05），与单宁和支链淀粉的含量呈显著正相关（P＜0.05）。以酒样差异香味物质为因变量，高粱理化成分为自变量构建多元线性回归模型见表5。由表5可知，有6个差异香味物质的含量受到高粱理化成分的显著影响（P＜0.05）。其中，亚油酸乙酯、乙醛和3-甲基丁醛的含量受单宁和支链淀粉的共同影响，甲酸乙酯和异戊酸含量受单宁影响，乙缩醛受支链淀粉的影响。建立了基于单宁和支链淀粉预测以上差异香味物质含量的回归方程，相关系数R2为0.292～0.663，表明对预测变量的解释度为29.20%～66.30%。
图4 酒样差异香味物质和高粱理化成分间的Pearson相关性分析结果
Fig.4 Pearson correlation analysis results between differential flavor compounds of Baijiu samples and physicochemical properties of sorghum
红色和蓝色表示P＜0.05，白色表示P＞0.05。
表5 高粱理化成分对酒样差异香味物质的多元线性回归分析
Table 5 Multiple linear regression analysis of physicochemical properties of sorghum on differential flavor compounds of Baijiu samples
续表
注：X4和X5分别表示单宁和支链淀粉。
2.6 酒样感官品评
不同品种高粱酿造酒样的感官品评结果见表6。由表6可知，泸州红1号和金糯粱1号酒样的感官风味相似，均优于澳洲AZ酒样。
表6 不同品种高粱酿造酒样的感官品评结果
Table 6 Sensory evaluation results of Baijiu samples brewed from different sorghum varieties
3 讨论
3.1 酒样香味物质的结构组成
以往研究解析了不同品种高粱的大生产酿造酒质差异[9-13]，但相关试验仅在一个酒厂开展。本研究结果表明，除高粱品种外，酒样香味物质的结构组成还因酒厂的不同而具有显著差异。同一原料酿造酒质具有的酒厂差异可能与多种因素有关。研究表明，白酒香味物质的形成受酿酒原料、生产工艺、气候环境等因素的影响[19-21]。虽然本研究保证了高粱品种和酿酒工艺的一致，生产也由同一批工人操作，但仍无法完全消除外部因素的影响。如在长期的酿酒生产中，不同酒厂的环境中可能会形成独特的酿酒微生物区系[22]，影响白酒发酵，造成相同原料出现不同的酿造效果。因此，要准确评价不同原料的酿造酒质差异必须以多酒厂、多批次的酿造试验为基础。已往生产经验虽已总结出“相同原料的酿造酒质具有酒厂差异”，但本研究为这一生产经验提供了强有力的数据支撑。
3.2 酒样的差异香味物质
乙酸乙酯是清香型白酒的主体香味物质，其含量对酒质具有重要影响[14]。本研究发现，泸州红1号和金糯梁1号酒样的乙酸乙酯含量显著高于澳洲AZ，这可能是它们小曲清香风格更为纯正的原因之一。乙醛是白酒的主要醛类物质，味甜带涩，含量过高可能造成酒体刺鼻、口感辛辣[23]。本研究发现，金糯梁1号酒样的乙醛含量虽显著高于澳洲AZ，但其口感无明显辛辣味。造成此现象的原因可能包括两方面：一是金糯梁1号酒样的乙醛含量虽高，但仍处于可接受的范围；二是其他物质产生的味觉刺激可能对乙醛引起的辛辣味具有消除作用。风味物质之间具有相互作用，除绝对含量外，风味物质在食品中的分布情况对人体的感知强度也具有重要影响[24]。目前研究从不同香型白酒中检测出上千种香味物质[18]，其结构组成对酒质口感的影响亟待进一步破解。
3.3 高粱理化成分和香味物质的相关性
高粱富含淀粉、蛋白和单宁等理化成分，含量具有品种差异，是指导品种选育的核心指标[1，25]。作为中国白酒的主产区，四川已将培育“绿色高效酿酒专用粮重大新品种”列入十四五重大科技专项，解析高粱理化成分和白酒香味物质间的关系可为新品种的培育提供明确的性状选育方向。基于实验室发酵试验，有研究发现，高粱的单宁和脂肪与白酒香味物质的含量变化显著相关[2-3]。基于大生产酿造，本研究发现酒样香味物质的结构组成与粗蛋白、粗脂肪、粗淀粉、单宁和支链淀粉的含量均相关，其中单宁和支链淀粉对差异香味物质的形成具有显著影响，提示新品种的选育工作应重点关注这两个指标。目前研究尚未阐明高粱理化成分影响白酒香味物质形成的作用机制，但有研究发现在酿酒过程中，不同单宁含量酒醅的优势菌群存在显著差异[26-27]，提示原料理化成分含量的差异对微生物种群具有选择作用。那么，由高粱理化成分含量差异引起的菌群结构及其功能差异对理化成分的代谢流向产生了什么影响，又是如何导致酒体差异香味物质的形成等科学问题还需进一步研究。
4 结论
本研究探明了3种高粱酿造清香型白酒的差异香味物质，明确了单宁和支链淀粉是影响香味物质结构组成的主要因子，初步建立了以单宁和支链淀粉为自变量预测酒样差异香味物质含量的多元回归方程。本研究还证明了白酒香味物质的结构组成受到高粱品种和酿造酒厂的交互影响，后续研究将系统性开展多酒厂、多批次酿造试验，进一步优化和完善相关回归模型来指导酿酒生产。
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