蓝莓属于杜鹃花科（Ericaceae）越橘属（Vaccinium spp.），是世界上稀有的蓝色小浆果，全世界有400多个品种[1-3]。蓝莓果肉细软皮薄，略带涩感，水分充足，没有果核，种子细小，可以直接食用[4]。蓝莓果实除了含有丰富的食用纤维以及维生素C、维生素A、维生素B族、维生素E等外，还有丰富的矿物质元素以及熊果苷、花青苷和超氧化歧化酶（superoxide dismutase，SOD）[5-6]等。根据相关的研究发现，定期食用蓝莓鲜果具有保护视力、增强机体免疫和延缓人体记忆力衰退等功效[7-8]。我国蓝莓种植面积及产量总体呈逐年增长态势，2020年贵州地区产量为8.50万t，占全国总产量的24%，位居全国第一[9]。蓝莓果渣作为一种蓝莓相关产品加工过程中的副产品，仍然保持着较丰富的营养成分，且果渣中保留着香味成分[10]。
白兰地是水果经过发酵酿造、蒸馏、陈酿而得到的水果蒸馏酒，酒精度通常在36%vol以上[11-12]。白兰地通常指的是葡萄白兰地，也有一些其他白兰地是以不同水果为原料酿制而成的，在白兰地前冠以该水果名称，如杏白兰地和山楂白兰地等[13-15]。目前富含营养成分的果渣大多未得到有效利用，仅有少部分作为提取功能成分的原料，另外还有部分作为饲料，但大部分作为废弃物抛弃，不仅污染环境，还极大浪费了可以综合利用的资源。为了充分利用水果的副产物果渣，已有学者开展了猕猴桃皮渣及威代尔皮渣生产白兰地的研究[16-17]，近年来随着贵州省蓝莓种植面积的增大，蓝莓加工产生的果渣也不断增加，由于蓝莓果渣保持着丰富的营养成分，且果渣中保留着香味成分。为了实现对蓝莓果渣的综合利用[18-19]，有必要开展蓝莓果渣酿造白兰地的研究，对延伸产业链、推动蓝莓产业的发展具有一定的现实意义。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
蓝莓果渣：贵州茅台（集团）生态农业产业发展有限公司；白砂糖：山东星光糖业有限公司；葡萄酒活性干酵母：安琪酵母股份有限公司；果胶酶（2.25×104 U/g）：法国SASSOFRALAB公司；偏重亚硫酸钾（分析纯）：天津天利化学试剂有限公司。
1.2 仪器与设备
LY05-100恒温恒湿箱：上海龙跃仪器设备有限公司；BSG-24电热恒温水浴锅：上海一恒科学仪器有限公司；DK-98-Ⅱ电子调温万用电炉：天津市泰勒斯特仪器有限公司；DGG-9240B电热恒温鼓风干燥箱：上海森信实验仪器有限公司；WYT-15糖度计：山东辰信机械设备有限公司；CJM-2630酒精计：宿迁宇之婷电子商务有限公司；FA2204电子天平：上海菁海仪器有限公司；STARTER-3100酸度计：奥豪斯仪器（上海）有限公司。
1.3 方法
1.3.1 蓝莓果渣白兰地发酵工艺流程及操作要点
原料处理：蓝莓果渣经剔除异物，100 ℃、灭菌30 min后，冷却摊凉。
酶解：将灭菌后的蓝莓果渣与水按照质量比1∶2混合，并添加0.25%的果胶酶，在酶解温度60 ℃条件下酶解2.5 h。
添加SO2：加入0.25 g/L的偏重亚硫酸钾，以达到杀菌防腐、抗氧化的作用。
调整糖度、pH值：添加白砂糖调整初始糖度，用柠檬酸调节发酵液pH为3.5[20]。
接种酵母：以蓝莓果渣酶解液为基准，加入0.8%葡萄酒活性干酵母（在加入前要先将酵母加入10倍体积的10 g/L蔗糖水，搅拌摇匀36 ℃恒温条件下静置20 min，使酵母充分活化）。
发酵：发酵容器密封并在28 ℃的恒温恒湿培养箱里进行发酵，在发酵前3 d内，定时充分搅拌，以保证酵母正常发酵所需的氧气。
蒸馏：将发酵液进行压榨得到过滤酒液，采用蒸馏装置进行第一次蒸馏和第二次蒸馏，在蒸馏过程中要去掉前10mL酒头和部分酒尾，防止甲醇超标。第一次蒸馏的酒液为原酒。
人工陈酿：向第二次蒸馏的白兰地中放入酒液质量2%的重度烘焙的橡木片，将陈酿容器密封放入55 ℃的烘箱中加热0.5 h使其酒液温度达到55 ℃，密封保存2周以上[21]，在加热时将陈酿容器密封，防止加热过程中酒中易挥发的芳香物质损失及乙醇蒸发导致口感变化和酒精度降低[22]。
过滤：陈酿完成后用纱布滤去橡木片，再于200目的过滤机上过滤，即得蓝莓果渣白兰地。
1.3.2 蓝莓果渣白兰地发酵工艺优化单因素试验
发酵时间：在发酵温度为28 ℃，酵母添加量为0.8%，初始糖度为26 °Bx的条件下，设置发酵时间分别为10 d、11 d、12 d、13 d、14 d。然后将发酵酒液过滤蒸馏得到白兰地原酒，分析发酵时间对其酒精度、总酸、感官评分的影响。
酵母添加量：在发酵温度为28 ℃，发酵时间为12 d，初始糖度为26°Bx的条件下，设置酵母添加量分别为0.50%、0.65%、0.80%、0.95%、1.10%。然后将发酵酒液过滤蒸馏得到白兰地原酒，分析酵母添加量对其酒精度、总酸、感官评分的影响。
初始糖度：在发酵温度为28 ℃，酵母添加量为0.8%，发酵时间为12 d的条件下，设置初始糖度分别为22 °Bx、24°Bx、26°Bx、28°Bx、30°Bx。然后将发酵酒液过滤蒸馏得到白兰地原酒，分析初始糖度对其酒精度、总酸、感官评分的影响。
1.3.3 蓝莓果渣白兰地发酵工艺优化响应面试验
以单因素试验结果为基础，采用3因素3水平的响应面试验对蓝莓果渣白兰地发酵工艺进行优化，响应面试验因素与水平见表1。
表1 蓝莓果渣白兰地发酵工艺优化响应面试验因素与水平
Table 1 Factors and levels of response surface experiments for blueberry pomace brandy fermentation process optimization
1.3.4 蓝莓果渣白兰地原酒的感官评价
参照GB/T11856—2008《白兰地》设计感官评分标准，选择10名专业人员为参评人员，根据感官评分标准对蓝莓果渣白兰地进行感官评分，采用百分制，结果取平均值，蓝莓果渣白兰地的感官评分标准见表2。
表2 蓝莓果渣白兰地感官评分标准
Table 2 Sensory evaluation standard of blueberry pomace brandy
续表
1.3.5 理化指标检测方法
总酸含量的测定：参考GB 12456—2021《食品中总酸的测定》中的方法；酒精度的测定：参考GB 5009.225—2016《酒中乙醇浓度的测定》中的方法；总糖、总酯含量测定：参考GB/T 11856—2008《白兰地》中的方法；固形物含量的测定：参考GB/T 10345—2007《白酒分析方法》中的方法；甲醇含量的测定：参考GB/T15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》中的方法。
1.3.6 数据处理
采用Microsoft Excel 2016软件进行数据分析和作图，采用Design-Expert11.1.2软件进行响应面试验设计和结果分析。
2 结果与分析
2.1 发酵条件优化单因素试验
2.1.1 发酵时间对蓝莓果渣白兰地品质的影响
在发酵温度为28 ℃，酵母添加量为0.8%，初始糖度为26°Bx的条件下，考察不同发酵时间对白兰地原酒酒精度、总酸、感官评分的影响见图1。
图1 发酵时间对蓝莓果渣白兰地品质的影响
Fig.1 Effect of fermentation time on the quality of blueberry pomace brandy
果酒发酵最主要环节是在酵母作用下，葡萄糖通过糖酵解途径生成丙酮酸，并在无氧条件下生成乙醛，乙醛再由乙醛脱氢酶还原成乙醇的过程[23]。由图1可知，随着发酵时间的延长，糖转化为酒精，蓝莓果渣白兰地的酒精度逐渐升高，但是随着时间的延长糖逐渐被消耗，酒精度的升高趋势逐渐变得平缓，可能是发酵末期酵母活力下降。当发酵时间为13 d时，酒精度为9.0%vol，总酸含量为3.6 g/L，感官评分最高为82.2分。随着发酵的进行，酒精发酵和苹果酸-乳酸发酵同时进行，糖除了被乳酸菌利用产生苹果酸外，还有可能形成乳酸、醋酸，导致酸度呈现不断升高的趋势，另外蓝莓果渣中的单宁等物质进入酒中，从而致使蓝莓果渣白兰地的口感失调，破坏了白兰地的风味，感官评分下降。综合考虑，选择最适发酵时间为13 d。
2.1.2 酵母添加量对蓝莓果渣白兰地品质的影响
在发酵温度为28 ℃，发酵时间为12 d，初始糖度为26 °Bx的条件下，考察不同酵母添加量对白兰地原酒酒精度、总酸、感官评分的影响见图2。
图2 酵母添加量对蓝莓果渣白兰地品质的影响
Fig.2 Effect of yeast addition on the quality of blueberry fruit residue brandy
由图2可知，随着酵母添加量的增加，蓝莓果渣白兰地的酒精度先缓慢上升，当酵母添加量达到0.80%之后，酒精度逐渐下降，由于酵母添加量影响着发酵周期和发酵进程，酵母添加量过少，无法保证酒精积累；当酵母添加量过多，酵母大量繁殖，一方面自身养分需求消耗大量营养物质，导致生成酒精底物减少，酒精产量降低；感官评分和酒精度的变化相似。总酸也随着酒精度的变化而变化，进而影响其感官评分。另一方面，代谢的大量副产物影响发酵过程，增强“酵母”味，并且还会存在过量添加导致发酵提前终止及不利风味物质的形成[24]。酵母添加量为0.80%时，蓝莓果渣白兰地一次蒸馏的酒精度为9.1%vol，此时的白兰地口感最好，感官评分最高为85.4分、总酸含量为3.24 g/L。当酵母添加量达到发酵液质量的1.10%时，酒精度会大幅度降低，为5.9%vol。综合考虑，选择最佳酵母添加量为0.80%。
2.1.3 不同初始糖度对蓝莓果渣白兰地品质的影响
在发酵温度为28 ℃，酵母添加量为0.8%，发酵时间为12 d的条件下，考察不同的初始糖度对白兰地原酒酒精度、总酸、感官评分影响见图3。
由图3可知，初始糖度是蓝莓果渣白兰地发酵中影响酒精度的关键因素。随着初始糖度的增加，酒精度和感官评分相应的上升，初始糖度较低时酒精度和感官评分较低，可能是由于发酵周期较短，当糖度增加酒精度也在增加，但总酸也在增加，对蓝莓果渣白兰地的品质产生一定的影响。糖是酒精发酵和酯类物质的基质原料，也是酵母存活的能源物质，初始糖含量过低达不到预期酒精度，也会造成酒体过于单薄。初始糖含量过高，会抑制酵母的繁殖代谢，导致残糖量较高，出现以胶体形式存在于酒体中的营养组分，产生酒体浑浊和沉底的现象；初始糖含量过高也会因发酵醪黏度较高出现CO2和热量释放缓慢，造成醋酸菌的大量繁殖，使挥发酸增加，酸化酒体[24]。当初始糖度达到28 °Bx时，蓝莓果渣白兰地的口感最好，感官评分达到了86.5分，酒精度为10.4%vol，总酸含量为3.56 g/L。综合考虑，选择最佳初始糖度为28°Bx。
图3 初始糖度对蓝莓果渣白兰地品质的影响
Fig.3 Effect of initial sugar content on the quality of blueberry pomace brandy
2.2 发酵工艺优化响应面试验
2.2.1 试验设计与结果
在单因素试验结果的基础上，通过软件Design-Expert 11.1.2设计3因素3水平响应面优化试验，选择发酵时间（A）、酵母添加量（B）和初始糖度（C）为影响因子，由于总酸变化相对较小，选择酒精度（Y1）和感官评分（Y2）为响应值，对蓝莓果渣白兰地发酵工艺参数进行优化[25-26]，试验设计及结果见表3。
表3 蓝莓果渣白兰地发酵工艺优化Box-Behnken试验设计结果
Table 3 Design and results of Box-Behnken experiments for blueberry pomace brandy fermentation process optimization
续表
2.2.2 回归模型的建立及方差分析
使用Design-Expert11.1.2软件对表3中的17组数据进行回归分析，建立蓝莓果渣白兰地酒精度（Y1）和感官评分（Y2）对发酵工艺参数的多元二次回归拟合方程：
对回归模型进行方差分析，结果见表4和表5。
表4 以酒精度为评价指标的回归模型方差分析
Table 4 Variance analysis of regression model with alcohol content as evaluation index
注：“**”表示对结果影响极显著（P＜0.01）；“*”表示对结果影响显著（P＜0.05）。下同。
表5 以感官评分为评价指标的回归模型方差分析
Table 5 Variance analysis of regression model with sensory score as evaluation index
由表4可知，模型P值＜0.000 1，该回归模型极显著。失拟项的P值=0.959 3，说明不显著，证明该模型的拟合效果良好。根据回归系数的显著性表明，交互项AB、AC、BC和二次项A2、C2对酒精度影响不显著（P＞0.05）；一次项A和二次项B2对酒精度的影响极显著（P＜0.01）。一次项B和C对酒精度的影响显著（P＜0.05）。通过分析可知发酵时间、酵母接种量、初始糖度对酒精度的影响程度由大到小依次为A＞B＞C。校正决定系数R2adj=0.944 5，说明94.45%的响应值都可通过该模型解释。综上，该模型拟合度高，试验误差较小，可以用于对蓝莓果渣白兰地酒精度进行分析和预测。
由表5可知，模型P值＜0.000 1，表明该模型极显著；失拟项P值=0.247＞0.05，不显著，说明该模型拟合效果良好。因此可以利用该回归方程进行分析。一次项A、B、C，二次项A2、B2、C 2以及交互项AC、BC对感官评分影响极显著（P＜0.01），说明发酵时间、酵母接种量、初始糖度对蓝莓果渣白兰地酿造过程中的感官评分影响较大。交互项AB对感官评分影响不显著（P＞0.05）。3种因素对感官评分的影响大小排序依次为A＞C＞B。校正决定系数R2adj=0.971 3，说明该模型能解释97.13%的感官评分响应值的变化，说明该回归模型的拟合度较高，试验误差较小，可以用于对蓝莓果渣白兰地感官评分的影响进行分析和预测。
2.2.3 响应面分析及优化
通过Design-Expert11.1.2软件对回归模型进行响应面优化，得到发酵时间、酵母接种量、初始糖度3个因素交互影响对蓝莓果渣白兰地酒精度和感官评分的响应曲面及等高线，结果见图4。
图4 各因素间交互作用对蓝莓果渣白兰地感官评分和酒精度影响的响应面及等高线
Fig.4 Response surface plots and contour lines of effects of interaction between each factor on sensory score and alcohol content
由图4可知，在感官评分模型中，AC和AB交互形成的曲面坡度较大，说明对感官评分的影响较大。与方差分析结果一致。通过Design-Expert11.1.2软件对试验得到的数据进行分析处理，综合考虑酒精度和感官评分两个响应值，优化出蓝莓果渣白兰地发酵的工艺参数为发酵时间12.129 d，酵母添加量0.701%，初始糖度26.441°Bx，在此条件下发酵蓝莓果渣白兰地原酒的酒精度预测值为8.732%vol，感官评分预测值为76.266分。
2.3 响应面验证试验
考虑到实际操作，将发酵工艺调整为发酵时间12 d，酵母添加量0.7%，初始糖度26°Bx。在该条件下进行验证试验，得到蓝莓果渣白兰地原酒的酒精度为9.2%vol，感官评分为79.5分，与回归模型预测值接近，表明该模型是可靠的。通过采用响应面分析方法来优化蓝莓果渣白兰地发酵工艺参数是可行的，具有一定的参考价值。
2.4 蓝莓果渣白兰地产品的理化指标
取蓝莓果渣白兰地进行理化指标测定，结果表明，蓝莓果渣白兰地的酒精度为38%vol、总酸含量为1.53 g/L、总酯含量为3.03 g/L、固形物含量为0.22 g/L、总糖含量为1.52 g/L、甲醇含量为1.20 g/L（≤2.0 g/L），其理化指标符合GB/T 11856—2008《白兰地》的要求。
3 结论
通过单因素和Box-Behnken响应面试验对蓝莓果渣白兰地发酵工艺进行优化。结果表明，蓝莓果渣白兰地的最佳发酵工艺为发酵时间12 d，酵母添加量0.7%，初始糖度26°Bx。在此条件下得到成品蓝莓果渣白兰地酒体金黄透亮、口感醇厚、入口甘冽，具有蓝莓果渣白兰地明显的风格。其产品的酒精度为38%vol、总酸含量为1.53 g/L、总酯含量为3.03 g/L、固形物含量为0.22 g/L、总糖含量为1.52 g/L、甲醇含量为1.20 g/L（≤2.0 g/L），其理化指标符合国家标准GB/T 11856—2008《白兰地》的要求。
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