细菌纤维素（bacterial cellulose，BC）是一种由β-1,4葡萄糖苷键连接而成的生物高分子聚合物。BC与植物纤维结构相似，因其具有高纯度、高聚合度、高结晶度、高持水性、高抗张强度和生物相容性好等特点[1]，已被广泛应用于食品[2-3]、造纸[4]、生物医药[5-6]和纺织品[7-8]等领域。常见的细菌纤维素发酵菌属有醋酸菌属（Acetobacter）[9]、根瘤菌属（Rhizobium）[10]和土壤杆菌属（Agrobacterium）[11]等。目前，已有大量文献采用优良菌株选育[12-14]、发酵工艺优化[15]、生物合成调控[16]等方法来提高细菌纤维素产量，但细菌纤维素产量仍然偏低，生产成本较高，难以满足工业化生产的要求，而静态培养法有培养方法简单、产品性能优异、产品形状可控等优点，是细菌纤维素制备的首选方法[17]。
我国的烟叶种植面积超过100万hm2，年均产生的烟草废弃物（低次烟叶、茎秆、杈烟等）多达400万t[18]，其处理方式大多为随意丢弃或者集中焚烧销毁，造成了较大的环境污染和资源浪费[19]。因此，开发利用废弃烟末进行细菌纤维素生产，对其培养基组分及发酵条件进行优化是提高细菌纤维素产量、降低生产成本的有效途径[20]。张婷婷等[21]开发了利用废弃烟末发酵制备细菌纤维素的技术，并对接种量、温度、pH和发酵时间等条件进行优化。由烟草废弃物制备细菌纤维素虽然已经实现，但烟草原料中烟碱等物质对菌体生长及BC合成有一定的抑制作用，使其产量较低，烟草废弃物的利用率仅为2%左右。因此，提高烟草废弃物的利用率，对环境保护具有重要意义。
本研究以木醋杆菌（Acetobacter xylinum）为试验菌株，采用静态发酵的方式，对烟草废弃物进行发酵制备细菌纤维素，通过单因素试验和Box-Behnken试验对烟草发酵培养基组分进行优化，以期提高细菌纤维素产量，为后续细菌纤维素的放大生产奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
1.1.1 菌株与材料
木醋杆菌（Acetobacter xylinum）ATCC 23767：由郑州轻工业大学食品与生物工程学院生物催化与转化实验室保藏；烟末废弃物：由贵州中烟工业有限公司提供。
1.1.2 试剂
酵母浸粉（生化试剂）：北京奥博星生物技术有限责任公司；无水葡萄糖（分析纯）：天津市致远化学试剂有限责任公司；无水乙醇、乳酸（均为分析纯）：天津市富宇精细化工有限责任公司；蛋白胨（生化试剂）、水杨酸、草酸、苹果酸、延胡索酸（均为分析纯）：上海麦克林生化科技有限公司；氢氧化钠、硫酸铵、硝酸铵、柠檬酸（均为分析纯）：天津市登科化学试剂有限公司。
1.1.3 培养基
种子培养基：葡萄糖70 g/L、酵母粉10 g/L、磷酸二氢钾1 g/L，115 ℃灭菌20 min，冷却后添加1%（V/V）无水乙醇。
烟草发酵培养基：烟末100 g，以固液比为1∶10（g∶mL）加水，60 ℃浸提1.5 h后过滤，取滤液，于121 ℃灭菌20 min。
1.2 仪器与设备
SW-CJ-ID超净工作台：苏州净化有限公司；UV-1800PC型紫外可见分光光度计：上海美谱达仪器有限公司；GR85DA高压蒸汽灭菌锅：致微（厦门）仪器有限公司；ZQWY-200S卧式全温振荡培养箱：上海知楚仪器有限公司；SHP-150生化培养箱：上海森信实验仪器有限公司。
1.3 方法
1.3.1 细菌纤维素的制备
从-80 ℃冰箱中取保藏的菌液100 μL，接种至装液量为50 mL/250 mL的种子培养基中，于30 ℃、200 r/min条件下培养24 h，制成种子液。将种子液以10%（V/V）的接种量接种于装液量为150 mL/500 mL的烟草发酵培养基中，30 ℃恒温静置培养7 d后即可制得细菌纤维素膜。
1.3.2 细菌纤维素的纯化处理
将静置发酵7 d后获得的BC膜取出，浸泡至0.1 mol/L的NaOH溶液中，于沸水浴加热1 h，以除去残留在纤维素膜表面的菌体及发酵液，然后用蒸馏水反复洗涤至BC膜至中性。经过纯化处理的BC用于产量测定及持水性能分析。
1.3.3 发酵培养基组分优化单因素试验
以细菌纤维素产量为评价指标，分别选择培养基的氮源种类（蛋白胨、酵母粉、硫酸铵和硝酸铵）及氮源添加量（0、1 g/L、2 g/L、3 g/L和4 g/L）、乙醇体积分数（0、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、3.0%和4.0%）、有机酸种类（柠檬酸、水杨酸、草酸、苹果酸、延胡索酸、乳酸）及有机酸添加量（0、0.25 g/L、0.50 g/L、0.75 g/L、1.00 g/L和1.25 g/L）进行单因素试验优化。培养基组分优化单因素试验中，所有试验因素空白组均为未添加该因素的烟草发酵培养基，试验组为添加该因素的烟草发酵培养基。
1.3.4 发酵培养基组分优化Box-Behnken试验
在单因素试验的基础上，选择硫酸铵添加量（A）、乙醇体积分数（B）和苹果酸添加量（C）3个对细菌纤维素产量影响明显的因素为自变量，以细菌纤维素产量（Y）为响应值，采用Design Expert 10.0.8软件设计3因素3水平的Box-Behnken试验，试验因素及水平见表1。
表1 培养基组分优化Box-Behnken试验因素与水平
Table 1 Factors and levels of Box Behnken tests for medium components optimization
1.3.5 细菌纤维素产量计算及持水性能的测定
纯化处理后的BC膜经4 000 r/min离心20 min，定义为湿膜，记为W湿；将80℃下烘干至恒质量的细菌纤维素膜定义为干膜，记为W干；在常温环境下将干膜浸入去离子水中，浸泡48h后用滤纸吸干表面水分，所得膜定义为复水膜，记为W复。
按公式（1）计算BC的产量，分别按公式（2）～（4）计算BC的含水率、复水率和溶胀率。
式中：R为细菌纤维素产量，g/L；V为发酵液体积，L；C1为湿膜含水率，%；C2为干膜复水率，%；C3为溶胀率，%。
1.3.6 数据处理
所有试验均重复3次，数据采用SPSS19.0和Origin2019进行分析和作图。
2 结果与分析
2.1 发酵培养基组分优化单因素试验结果
2.1.1 氮源种类及添加量对细菌纤维素产量的影响
氮源是菌体合成蛋白质、氨基酸及核酸等含氮物质的来源。菌株发酵生产细菌纤维素的过程中，充足的氮源不仅能够为菌体生长提供氮元素，还能够作为细菌纤维素合成相关酶的辅助因子[22]。本试验考察了外源添加蛋白胨、酵母粉、硫酸铵和硝酸铵4种氮源对细菌纤维素产量的影响，氮源种类及添加量对细菌纤维素产量的影响见图1。
图1 氮源种类（A）及硫酸铵添加量（B）对细菌纤维素产量的影响
Fig.1 Effect of nitrogen sources (A) and ammonium sulfate addition(B) on bacterial cellulose production
由图1A可知，硫酸铵对细菌纤维素的产量提升效果最明显，细菌纤维素产量为16.09g/L。因此，选择硫酸铵为最佳氮源。由图1B可知，随着硫酸铵添加量在0～3 g/L范围内不断增加，细菌纤维素产量逐渐上升；当硫酸铵添加量达到3 g/L时，细菌纤维素产量最高，为23.44 g/L；随着硫酸铵添加量在3～4 g/L范围继续增加，细菌纤维素产量降低。因此，选择硫酸铵的最适添加量为3 g/L。
2.1.2 乙醇体积分数对细菌纤维素产量的影响
在添加乙醇的情况下，乙醇作为额外碳源，会使微生物对葡萄糖的消耗减少，使得更多的葡萄糖可以用于BC的合成[23]，从而提高BC的产量。许燕娜等[24]认为，木醋杆菌可以将乙醇转化为乙酸，再将乙酸分解为二氧化碳和水，从而提高三磷酸腺苷水平，进而提高细菌纤维素的产量。乙醇体积分数对细菌纤维素产量的影响见图2。
图2 乙醇体积分数对细菌纤维素产量的影响
Fig.2 Effect of ethanol volume fraction on bacterial cellulose production
由图2可知，随着乙醇体积分数在0～2%范围内的增加，细菌纤维素产量逐渐增加；当乙醇体积分数为2%时，细菌纤维素产量达到最大值，达到20.58 g/L，促进效果较为明显；但当乙醇体积分数继续增加，细菌纤维素产量降低。因此，选择最佳乙醇体积分数为2%。
2.1.3 有机酸种类及添加量对细菌纤维素产量的影响
有机酸种类及添加量对细菌纤维素产量的影响见图3。
图3 有机酸种类（A）及苹果酸添加量（B）对细菌纤维素产量的影响
Fig.3 Effect of types of organic acids (A) and malic acid addition (B)on bacterial cellulose production
由图3A可知，添加有机酸类物质对木醋杆菌生产BC都有促进作用，其中苹果酸促进作用最强，其BC产量为17.79 g/L。贾青慧等[25]研究发现，发酵过程中葡萄糖酸和乙酸在一定范围内有利于木醋杆菌合成BC；钱子俊等[26]研究发现，柠檬酸对BC产量具有一定促进作用；李珏等[27]研究发现，乙酸代替柠檬酸作为有机酸成分加入发酵培养基时，可提高BC合成量。可见，有机酸是BC合成过程中常见的发酵促进因子，但由于菌种等不同，各种有机酸的效果存在较大差异。由图3B可知，随着苹果酸添加量在0～0.5 g/L范围内增加，细菌纤维素产量逐渐增加；当苹果酸添加量为0.5 g/L时，细菌纤维素产量达到最高值，为19.98 g/L；当苹果酸添加量＞0.5 g/L，细菌纤维素产量逐渐下降。BC的合成过程中需要大量能量，有机酸类物质可通过氧化生成丙酮酸，参与细胞代谢并产生能量，较多的能量可以促进BC的合成[28]。随着苹果酸添加量持续增加，反馈抑制增强，菌体的生长受到抑制，使细菌纤维素产量有所降低[29]。
2.2 发酵培养基组分优化响应面试验结果
2.2.1 响应面试验设计及结果
在单因素试验结果的基础上，以细菌纤维素产量（Y）为响应值，以对细菌纤维素产量有明显影响的3个因素硫酸铵添加量（X1）、乙醇体积分数（X2）和苹果酸添加量（X3）为自变量，采用Design Expert 10.0.8软件进行Box-Behnken试验，试验设计及结果见表2，方差分析结果见表3。
表2 培养基组分优化Box-Behnken试验设计及结果
Table 2 Design and results of Box Behnken tests for medium component optimization
表3 回归模型方差分析
Table 3 Variance analysis of regression model
注：“*”表示对结果影响显著（P＜0.05）；“**”表示对结果影响极显著（P＜0.01）。
运用Design Expert 10.0.8软件对表2的数据进行二次多项拟合，得到响应值与各因素之间的回归方程：Y=33.86+1.21X1+0.29X2+0.22X3+0.18X1X2+0.07X1X3-0.005X2X3-2.61X12-2.73X22-1.92X32
由表3可知，回归模型极显著（P＜0.01）；失拟项不显著（P值=0.7＞0.05），表明该模型具有较高可靠性，与实际情况拟合程度良好。该模型的决定系数R2=0.993 0，调整决定系数R2Adj=0.993 0，表明此模型方程是可靠的，用该方程进行分析和预测，预测值与实际测定值之间相关性较高。由表3亦可知，一次项X1、X2和二次项X12、X22和X32均对细菌纤维素产量有极显著影响（P＜0.01），一次项X3对细菌纤维素产量有显著影响（P＜0.05），其他项对结果影响不显著（P＞0.05）。由F值可知，各因素对细菌纤维素产量影响强弱顺序依次为X1（硫酸铵添加量）＞X2（乙醇体积分数）＞X3（苹果酸添加量）。
2.2.2 验证试验
通过Design Expert 10.0.8软件得到烟草发酵培养基组分的最佳配方为：硫酸铵添加量3.234 g/L，乙醇体积分数2.030%，苹果酸添加量0.515 g/L。在此优化条件下，细菌纤维素产量理论值为33.83 g/L。在实际发酵过程中，考虑到实际操作可行性，将烟草发酵培养基组分的最佳配方调整为：硫酸铵添加量3.2 g/L，乙醇体积分数2.0%，苹果酸添加量0.5 g/L。在此最优发酵培养基组合下进行3次平行试验，细菌纤维素产量实际值为32.27 g/L，实际值与理论值差异不大，充分证明该模型的准确性与实用性，细菌纤维素产量是优化前的2.74倍。
2.3 细菌纤维素的持水性能测定结果
细菌纤维素的持水性能经常用含水率和复水率来表示[30]，将烟草发酵培养基优化前后的细菌纤维素进行持水性能测定，其含水率、复水率和溶胀率结果见表4。
表4 培养基优化前后细菌纤维素的持水性能测定结果
Table 4 Determination results of water holding capacity of bacterial cellulose before and after medium optimization
由表4可知，与优化前培养基相比，优化后培养基的细菌纤维素含水率（94.35%）相差不大，但复水率（40.30%）和溶胀率（673.56%）分别增加了8%和2%。
3 结论
以木醋杆菌（Acetobacter xylinum）为试验菌株，静态发酵烟草废弃物制备细菌纤维素，最佳烟草发酵培养基配方为：硫酸铵添加量3.2 g/L，苹果酸添加量0.5 g/L，体积分数2%的乙醇。在此最佳条件下，细菌纤维素的产量为32.27 g/L，是优化前烟草发酵培养基的2.74倍。优化后烟草发酵培养基制备的细菌纤维素含水率为94.35%，其复水率和溶胀率分别为40.30%和673.56%，与优化前培养基的细菌纤维素相比，含水率相差不大，而复水率和溶胀率均有所增加。
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