大曲清香型白酒具有清亮透明，清香纯正，陈香粮香，醇厚绵甜的特点[1-2]，是以粳高粱为原料，谷糠、稻壳为辅料，大曲为糖化发酵剂，通过“清蒸二次清，地缸固态发酵，甑桶蒸馏”工艺生产而成的。微生物是白酒发酵的核心，也是影响白酒中风味物质形成的重要因素[3-4]。在各种微生物的共同作用下，通过开放式固态“双边效应”的发酵方式，边糖化边发酵[5-6]。
有研究表明，清香型白酒最重要的气味特征是果香、甜香和花香，而这些香气主要由酯类物质所提供，其中包括乙酸乙酯、乳酸乙酯、己酸乙酯、丁酸乙酯、戊酸乙酯等酯类物质[7]。乙酸乙酯作为大曲清香白酒的核心风味物质之一，在形成大曲清香型白酒独特的风味特征上具有重要的贡献[8-9]。近年来，武金玲等[10]对浓香型白酒发酵过程中的配料比、窖泥乙酸菌活性、大曲贮存时间等条件进行改进，增加了浓香型白酒中的乙酸乙酯含量，优质品率提升8.5%；宋瑞滨等[11]在浓香白酒机械化、自动化和智能化酿造生产条件下，从出池、入池、摘酒工艺进行改进，降低了白酒中乙酸乙酯的含量。
目前，大曲清香型白酒发酵过程中采用的是开放式发酵方式，使得外界环境（如发酵温度）对酒醅中乙酸乙酯的形成有一定的影响，从而影响大曲清香型白酒酒质[12-15]。研究恒温条件下，大曲清香型白酒的最佳生产工艺对于清香型白酒可控发酵生产具有重要意义[16-17]。因此，本研究以大曲清香型白酒大米查酒糟为底物，在恒温条件下进行二米查酒醅发酵。通过单因素试验筛选对酒醅中乙酸乙酯含量影响显著的环境因子，并结合响应面试验进一步优化大曲清香型白酒二米查恒温发酵条件，以提高大曲清香型白酒中乙酸乙酯含量，使白酒更加柔和爽净，优化其口感风味。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
1.1.1 材料
大米查酒糟（经过一次摘酒后的酒糟）、低温大曲（清茬曲、红心曲、后火曲的混合生产用曲）、谷糠、稻壳：山西某酒厂。
1.1.2 试剂
乙腈、乙酸乙酯（均为色谱纯）：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；无水乙醇、磷酸二氢钾（均为分析纯）：天津市风和化学试剂科技有限公司。其他试剂均为国产分析纯。
1.2 仪器与设备
Agilent 1260高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）仪、ZORBAX SB-C18色谱柱（4.6 mm×150 mm，5 μm）：安捷伦科技有限公司；85-2A磁力搅拌器：精凿科技（上海）有限公司；ST2100 pH计：常州奥豪斯仪器有限公司；SCAA-104有机相尼龙针式滤器：上海安谱实验科技股份有限公司。
1.3 方法
1.3.1 大曲清香型白酒二米查酒醅的恒温发酵工艺[18]
取大米查酒糟（水分添加量50%），待其冷却至室温后，拌入红糁（高梁粉碎后的原粮）干质量9%的辅料（谷糠∶稻壳=1∶1，高温蒸煮30 min），再拌入红糁干质量10%的大曲，28 ℃恒温发酵28 d。
1.3.2 大曲清香型白酒二米查酒醅恒温发酵工艺优化
（1）单因素试验
以大曲清香型白酒大米查酒糟为发酵底物，二米查酒醅中乙酸乙酯含量和酒精度为评价指标，分别考察发酵时间（0、3 d、7 d、15 d、17 d、21 d、24 d、28 d）、发酵温度（24 ℃、26 ℃、28 ℃、30 ℃、32 ℃、34 ℃）、大曲添加量（2%、4%、6%、8%、10%、12%、14%、16%）、辅料添加量（3%、6%、9%、12%、15%、18%）和水分添加量（10%、30%、50%、70%、90%、110%）对大曲清香型白酒二米查酒醅中乙酸乙酯含量及酒精度的影响。
（2）响应面试验设计
在单因素试验基础上，确定影响大曲清香型白酒二米查酒醅中乙酸乙酯含量及酒精度的显著因素。以酒醅中乙酸乙酯含量为响应值，以大曲添加量（A）、辅料添加量（B）、发酵温度（C）及水分添加量（D）为考察因素，采用Design-Expert 12软件设计响应面试验，试验因素与水平见表1。
表1 大曲清香型白酒二米查酒醅恒温发酵工艺优化响应面试验因素与水平
Table 1 Factors and levels of response surface tests for constant temperature fermentation process optimization of Ercha fermented grains of Daqu light-flavor Baijiu
1.3.3 分析检测
乙酸乙酯含量的测定：参考魏志阳等[19]的高效液相色谱法，略加修改。HPLC条件：ZORBAXSB-C18色谱柱（4.6mm×150 mm，5 μm）；流动相为乙腈-0.05 mol/L KH2PO4（8∶92，V/V）；流速1.0 mL/min；进样量20 μL；检测波长210 nm。
酒精度的测定：参考国标GB 5009.225—2016《食品安全国家标准酒中乙醇浓度的测定》[20]中的酒精计法。
1.3.4 数据处理及分析
利用Design Expert 12软件设计响应面试验；利用Origin Pro2021软件绘制单因素分析图；采用SPSS20.0软件进行单因素方差分析。
2 结果与分析
2.1 大曲清香型白酒二米查酒醅发酵工艺优化单因素试验结果与分析
2.1.1 发酵时间对酒醅中乙酸乙酯含量及酒精度的影响
发酵时间对酒醅中乙酸乙酯含量及酒精度的影响见图1。由图1可知，随着发酵时间的延长，酒醅中乙酸乙酯含量呈先升高后下降的趋势，酒精度呈先升高后趋于稳定的趋势，分析原因可能是发酵初期酒醅中产酯酵母生长代谢旺盛，产酯速率较高，发酵后期营养物质被消耗，乙醇含量增加，合成乙酸乙酯逆反应加速[21-22]，因此酯类物质含量呈下降趋势。当发酵时间为21 d时，乙酸乙酯含量最高，为（0.46±0.02）g/kg，酒精度为（8.00±0.20）%vol；当发酵时间为17 d时，酒醅中酒精度最高，为（8.10±0.25）%vol，而此时乙酸乙酯的含量为（0.44±0.02）g/kg。综合考虑，确定最佳发酵时间为21 d。
图1 发酵时间对酒醅中乙酸乙酯含量及酒精度的影响
Fig.1 Effect of fermentation time on ethyl acetate content and alcohol content in fermented grain
2.1.2 发酵温度对酒醅中乙酸乙酯含量及酒精度的影响
传统大曲清香型白酒发酵过程中，发酵酒醅受微生物代谢及外界保温散热条件的影响，酒醅中乙酸乙酯含量随温度的改变，发生动态变化[23-24]。发酵温度对酒醅中乙酸乙酯含量及酒精度的影响见图2。由图2可知，随着发酵温度的升高，酒醅中酒精度和乙酸乙酯含量均呈先升高后下降的趋势。当发酵温度为28 ℃时，酒醅中乙酸乙酯的含量最高，为（0.52±0.01）g/kg，酒精度为（8.10±0.2）%vol；当发酵温度为26 ℃时，酒醅中的酒精度最高，为（8.30±0.15）%vol，乙酸乙酯含量为（0.48±0.02）g/kg。综合考虑，确定最佳发酵温度为28 ℃。
图2 发酵温度对酒醅中乙酸乙酯含量及酒精度的影响
Fig.2 Effect of fermentation temperatures on ethyl acetate content and alcohol content in fermented grain
2.1.3 大曲添加量对酒醅中乙酸乙酯含量及酒精度的影响
大曲作为白酒发酵过程中主要的微生物来源，是传统清香白酒的糖化发酵剂[25]。大曲添加量对酒醅中乙酸乙酯含量及酒精度的影响见图3。由图3可知，随着大曲添加量的增加，酒醅中乙酸乙酯的含量及酒精度先增高后趋于稳定，分析原因可能是因为大曲添加量的增加，提高了高粱原料的利用率，淀粉大量转化为乙醇、乙酸，进而合成乙酸乙酯。但是二米查酒醅中淀粉等营养物质一定，随着大曲添加量的增加，酒醅中微生物作用逐渐缓慢，合成乙酸乙酯减少。当酒醅中大曲添加量为12%时，酒醅中乙酸乙酯含量最高达到（0.51±0.02）g/kg，酒精度最高达到（9.20±0.10）%vol。故综合考虑，确定最佳大曲添加量为12%。
图3 大曲添加量对酒醅中乙酸乙酯含量及酒精度的影响
Fig.3 Effect of Daqu addition on ethyl acetate content and alcohol content in fermented grain
2.1.4 辅料添加量对酒醅中乙酸乙酯含量及酒精度的影响
大曲清香型白酒大米查发酵为纯粮发酵，二米查发酵为纯槽发酵[18]。二米查发酵添加一定量的辅料有助于酒醅中产酯酵母产酯，促进酒醅中乙酸乙酯的合成[26]。辅料一般采用质量比为1∶1混合的谷糠和稻壳，提前24 h高温蒸30 min，以减少辅料中单宁物质及辅料本身的谷糠味对大曲清香型白酒品质的影响[26-27]。辅料添加量对酒醅中乙酸乙酯含量及酒精度的影响见图4。由图4可知，随着辅料添加量的增加，酒醅中的乙酸乙酯含量及酒精度均呈先升高后下降的趋势，分析原因可能是辅料添加过多酒醅中淀粉含量降低，透气性增加，二米查酒醅中乙醇的生成变缓，不利于乙酸乙酯的合成[26]。当辅料添加量为9%时，酒醅中乙酸乙酯含量达到最高，为（0.54±0.01）g/kg，酒精度为（7.90±0.10）%vol；当辅料添加量为6%时，酒醅中酒精度达到最高，为（8.05±0.25）%vol，此时，酒醅中乙酸乙酯含量为（0.48±0.01）g/kg。综合考虑，确定最佳辅料添加量为9%。
图4 辅料添加量对酒醅中乙酸乙酯含量及酒精度的影响
Fig.4 Effect of auxiliary material additions on ethyl acetate content and alcohol content in fermented grain
2.1.5 水分添加量对酒醅中乙酸乙酯含量及酒精度的影响
物料的入缸水分添加量会影响酒醅的发酵程度和白酒中风味物质，通过在蒸煮物料时控制水分添加量，进而控制物料的入缸水分。水分添加量对酒醅中乙酸乙酯含量及酒精度的影响见图5。由图5可知，随着水分添加量的逐渐升高，乙酸乙酯和酒精度均呈先升高后降低的趋势，分析原因可能是入缸水分增加导致淀粉转化为乙酸，酒醅中酸度增加，乙酸乙酯合成逆反应加速，乙酸乙酯增加缓慢[28-29]。当水分添加量为50%时，酒醅中的乙酸乙酯含量及酒精度均达到最高，分别为（0.57±0.02）g/kg、（8.55±0.25）%vol。综合考虑，确定最佳水分添加量为50%。
图5 水分添加量对酒醅中乙酸乙酯含量及酒精度的影响
Fig.5 Effect of water addition on ethyl acetate content and alcohol content in fermented grain
2.2 大曲清香型白酒二米查酒醅发酵工艺优化响应面试验
2.2.1 响应面法试验结果及方差分析
根据单因素试验结果，筛选出4个影响酒醅中乙酸乙酯含量的显著因子，以乙酸乙酯含量（Y）为响应值，通过响应面试验进一步确定大曲清香型白酒二米查高产乙酸乙酯恒温发酵工艺条件，试验设计及结果见表2，方差分析结果见表3。
表2 大曲清香型白酒二米查酒醅发酵工艺优化响应面试验设计及结果
Table 2 Design and results of response surface tests for constant temperature fermentation process optimization of Ercha fermented grains of Daqu light-flavor Baijiu
续表
表3 回归模型方差分析
Table 3 Variance analysis of regression model
注：“*”表示对结果影响显著（P＜0.05），“**”表示对结果影响极显著（P＜0.01）。
采用DesignExpert12软件对表3试验结果进行多元二次回归拟合，得到酒醅中乙酸乙酯含量（Y）对大曲添加量（A）、辅料添加量（B）、发酵温度（C）及水分添加量（D）的二次回归方程为：Y=-13.244 35+0.497 938A-0.164 833B-0.728 972C-0.003 047D+0.000 833AB+0.001 250AC+0.000 031AD+0.001 667BC+0.000 083BD+0.000 042CD-0.022 375A2-0.012 722B2-0.013 694C2-0.000 060D2。
由表3可知，回归模型P＜0.000 1，极显著，失拟项P=0.378 2＞0.05，不显著，表明模型与试验结果拟合度较好，回归方程决定系数R2为0.997 3，调整决定系数R2adj为0.994 6。说明乙酸乙酯的实际值与预测值之间的拟合度较高[30]，试验设计可靠。由表4亦可知，一次项A、B、C、D、交互项BC、BD和二次项A2、B2、C2、D2对结果影响极显著（P＜0.01），交互项AC对结果影响显著（P＜0.05），其他项对结果影响不显著（P＞0.05）。
2.2.2 各因素间交互作用的响应面分析
大曲添加量（A）、辅料添加量（B）、发酵温度（C）、水分添加量（D）四因素间交互作用对大曲清香型白酒二米查酒醅中乙酸乙酯含量（Y）影响的响应面及等高线见图6。
图6 大曲添加量、辅料添加量、发酵温度和水分添加量间交互作用对乙酸乙酯含量影响的响应面及等高线
Fig.6 Response surface plots and contour lines of effects of interaction between Daqu addition,auxiliary material addition,fermentation temperature and water addition on ethyl acetate contents
由图6可知，各因素间交互作用对酒醅中乙酸乙酯含量影响的响应曲面呈凸状，存在最高值，其中交互项AC、BC、BD对结果影响的响应曲面较陡，等高线呈椭圆形，说明AC、BC、BD之间存在交互作用，对乙酸乙酯含量的影响显著（P＜0.05），与方差分析结果一致。
2.2.3 最优发酵工艺参数的确定及验证试验
通过Design Expert 12软件对响应面试验回归模型进行最优求解，得到最优发酵工艺参数为大曲添加量12.10%，辅料添加量8.84%，发酵温度27.76 ℃，水分添加量44.44%，在此条件下，模型预测得到的乙酸乙酯含量为0.68 g/kg。为便于实际操作，将最优条件修正为辅料添加量8.8%，大曲添加量12%，发酵温度28 ℃，水分添加量44%，在此发酵工艺条件下，做3次平行验证试验，获得酒醅中乙酸乙酯含量实际值为（0.69±0.01）g/kg，与预测值接近，说明此工艺条件可靠，可用于对大曲清香型白酒二米查恒温发酵最佳环境条件下乙酸乙酯含量的预测。
3 结论
以传统大曲清香白酒大米查酒糟为发酵底物，以乙酸乙酯含量及酒精度为考察指标，采用单因素及响应面试验优化得到大曲清香白酒二米查酒醅的最优恒温发酵工艺条件为大曲添加量12%、辅料添加量8.8%、水分添加量为44%、发酵温度28 ℃、发酵时间21 d，在此优化条件下，酒醅中乙酸乙酯含量达到最高，为（0.69±0.01）g/kg，比优化前（0.392 g/kg）提高了76.9%。本研究为大曲清香型白酒恒温机械化、智能化发酵提供了理论依据和技术支撑。
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