酸奶是指以新鲜牛奶或复原乳为原料，经过均质、巴氏杀菌后添加发酵剂，发酵后再冷却灌装而成的一种乳制品[1]。酸奶的整个凝乳过程形成了一个三维的凝胶网络结构，将脂肪、乳清、酪蛋白、乳酸菌包含其中，是一个最有代表性的酸促凝胶过程[2]。酸奶品类根据生产方式和凝块结构的不同，通常分为凝固型酸奶和搅拌型酸奶[3]；搅拌酸奶是以新鲜牛乳为原料，经发酵、破乳、冷藏后熟、搅打充气、灌装而成的凝固型酸奶[4]。凝固型酸奶通常具有黏度低、质地粗糙、口感差和乳清沉淀等问题，影响了消费者对凝固型酸奶的接受程度[5-6]。很多消费者对酸奶的营养需求越来越高，而且对于蛋白质含量高的食品也有很大需求，因此研制高蛋白酸奶产品有很大的发展前景[7-9]。为了应对这一需求，结合搅拌型酸奶的优点，在现有酸奶生产工艺的基础上，通过对生产配方优化，研发一款新型酸奶[10-11]，通过对酸奶样品的品质分析，确定原料添加对酸奶品质的影响，并通过气相色谱-离子迁移谱（gas chromatography-ion mobility spectrometry，GC-IMS）技术对酸奶中的风味物质进行鉴定和分析，旨在对新型酸奶的研制提供借鉴意义。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
新鲜牛奶：昆明生物制造研究院有限公司；浓缩牛奶蛋白粉：丹麦阿拉食品原料有限公司；白砂糖：昆明多悦多工贸有限公司；复配乳化增稠剂：丹尼斯克（中国）有限公司；稀奶油：雀巢（中国）有限公司；明胶：河南博洋生物科技有限公司；复合菌种：丹麦科汉森公司；来思尔裸酸奶：云南皇氏来思尔乳业有限公司。
1.2 仪器与设备
JJ-6A-6H六联电动恒温搅拌器：常州智博瑞仪器制造有限公司；DH2500A电热恒温鼓风干燥箱：杭州川一仪器有限公司；GYB60-6S高压均质机：上海东华高压均质机厂；HPX-9272ME恒温培养箱：杭州汇尔仪器公司；S-LD150电动打蛋器：九阳股份有限公司；BreathSpec
气相色谱-离子迁移谱仪（GC-IMS）：烟台海能仪表科技有限公司。
1.3 试验方法
1.3.1 高蛋白搅拌酸奶制备工艺流程及操作要点
化料：将鲜牛乳预热至45 ℃，加入白砂糖与蛋白粉、复配乳化增稠剂等干粉混合物，900 r/min剪切搅拌10 min，再加入明胶和稀奶油继续900 r/min剪切搅拌15 min。
均质、灭菌：65 ℃、30 MPa压力条件下均质5 min后，85 ℃灭菌15 min。
冷却、接种、发酵：温度冷却至43～45 ℃，添加0.5‰菌种，43 ℃发酵5.5 h。
破乳、后熟：将发酵完成的产品用长勺破乳5 min，放于4 ℃冰箱后熟8～10 h。
搅拌、灌装、冷藏：手持电动打蛋器高速（5档）搅拌5 min充气后，灌装后4 ℃冷藏8 h即为高蛋白搅拌酸奶成品。
1.3.2 搅拌时间对酸奶品质的影响
以高蛋白搅拌酸奶质地为评价指标，研究搅拌时间（0 min、1 min、5 min、10 min）对高蛋白搅拌酸奶品质的影响。
1.3.3 高蛋白搅拌酸奶配方优化
（1）单因素试验
以高蛋白搅拌酸奶感官评价为指标，分别研究稀奶油添加量（2%、3%、4%、5%、6%）、明胶添加量（0.6%、0.7%、0.8%、0.9%、1.0%）、浓缩牛奶蛋白粉添加量（4%、5%、6%、7%、8%）对高蛋白搅拌酸奶品质的影响。
（2）响应面试验
在单因素试验结果的基础上，选取稀奶油添加量（A）、浓缩牛奶蛋白粉添加量（B）、明胶添加量（C）为考察因素，以高蛋白搅拌酸奶感官评分（Y）为响应值，设计3因素3水平响应面试验优化高蛋白搅拌酸奶生产配方，响应面试验因素及水平见表1。
表1 高蛋白搅拌酸奶配方优化响应面试验因素与水平
Table 1 Factors and levels of response surface tests for formula optimization of high-protein stir yogurt
1.3.4 测定方法
（1）高蛋白搅拌酸奶的感官评价
参考中国乳制品工业行业规范RHB 104—2020《发酵乳感官评鉴细则》和乌雪岩[12]的评价方法略加修改，组织12位品评员从色泽、气味、滋味、组织状态4个方面对高蛋白搅拌酸奶进行感官评价，满分为100分，高蛋白搅拌酸奶感官评分标准见表2。
表2 高蛋白搅拌酸奶感官评分标准
Table 2 Sensory evaluation standards of high-protein stir yogurt
（2）高蛋白搅拌酸奶的质构评价
参考乌雪岩[12]的评价方法略加修改，根据酸奶的胶感、硬度、弹性、粘附性和整体认可度，对酸奶的质构进行评价，每项满分为9分，分数越高程度越强，高蛋白搅拌酸奶质构评分标准见表3。
表3 高蛋白搅拌酸奶质构评分标准
Table 3 Evaluation standards of texture of high-protein stir yogurt
（3）持水力及膨化率的测定
持水力的测定：参考梅芳等[13]的方法，以离心管取待测样品30 mL，精确称量并记录质量W0，3 000 r/min离心20 min后，取出离心管，静置10 min后，除去上清液，测残余物的质量W。计算酸奶的持水力，其计算公式如下：
膨化率的测定：参考尤宏[14]的方法测定膨化率，其计算公式如下：（4）挥发性风味物质的测定
蛋白质、脂肪、酸度、乳酸菌、致病菌的测定：参照GB 19302—2010《食品安全国家标准发酵乳》。
乳糖的测定：参照GB 5009.8—2016《食品安全国家标准食品中果糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖的测定》。
挥发性风味成分分析：参照GUO X Y等[15]的方法并加以修改，取酸奶样品5 g置于20 mL顶空瓶中，40 ℃孵育15 min后使用85 ℃的进样针头自动将顶部气体吸入，氮气（99.999%）用作载气与漂移气体，流速为2 mL/min，保持2 min；18 min内线性升至150 mL/min，保持20 min，分析时间为20 min，期间IMS温度为45 ℃，色谱柱柱温60 ℃。选择高蛋白搅拌酸奶作为实验样品（JD），来思尔裸酸奶作为对照样品（PT）。
1.3.5 数据处理
用SPSS23.0对试验数据进行平均值及方差计算，利用Design-Expert 8.0.6对试验工艺参数进行响应面分析，采用TBtools及Origin 2021进行绘图。
2 结果与分析
2.1 搅拌时间对高蛋白搅拌酸奶质构及膨化率的影响
搅拌时间对高蛋白搅拌酸奶质构的影响见图1。由图1（a）可知，对于胶感指标，搅打1 min样品因搅打时间过短，质地光滑，胶感较强，而搅拌10 min样品因为时间过长导致消泡，胶感很弱。所以胶感评分从强到弱依次为：未搅拌＞搅拌1 min＞搅拌5 min＞搅拌10 min。对于硬度指标，当品评者用门牙咬断酸奶样品时，根据搅拌时间的不同，参评人员们认为搅拌1 min的样品硬度偏大，而搅拌10 min的样品硬度又太小，搅拌5 min的样品硬度较为适中，绵密口感最佳。所以硬度评分从大到小依次为未搅拌＞搅拌1 min＞搅拌5 min＞搅拌10 min。对于弹性指标，搅拌1 min的样品具有较大弹性，而搅拌10 min后的酸奶弹性处于较小的程度。弹性评分从大到小依次为未搅拌＞搅拌1 min＞搅拌5 min＞搅拌10 min。对于黏附性指标，搅拌酸奶口感如同慕斯，绵密松软，黏附性相对更大。黏附性评分从大到小依次为：搅拌5 min＞搅拌10 min＞搅拌1 min＞未搅拌。从整体认可度可知，参评人员对于4个样品的整体认可度依次为：搅拌5 min＞搅拌10 min＞搅拌1 min＞未搅拌。仅对于搅拌酸奶而言，搅拌5 min的样品整体认可度最高，这就说明搅拌时间为5 min时，酸奶的胶感、硬度、弹性、黏附性的大小、强弱程度都较为合适。搅打时间过长或过短，都会影响搅打酸奶的口感和质地，从而影响大众接受度。
由图1（b）可知，搅拌时间对高蛋白搅拌酸奶膨化率有较大影响，随着搅拌时间的增加，膨化率先升高后降低。搅拌时间为5 min时，膨化率最高，为25.72%；搅拌时间＞5min之后，膨化率开始呈下降趋势，酸奶持泡性能逐渐变差，口感过于绵软。膨化率与口感的好坏还是存在着较大的联系，只有找到了适合的膨化率，才能找出最优口感[18-19]。综合上述可知，搅拌时间选择5 min最适，此时酸奶口感最佳，质感最好。
图1 搅拌时间对高蛋白搅拌酸奶质构（a）及膨化率（b）的影响
Fig.1 Effect of stirring time on texture (a) and expansion rate (b) of high-protein stir yogurt
2.2 高蛋白搅拌酸奶生产配方优化
2.2.1 高蛋白搅拌酸奶生产配方优化单因素试验
由图2（a）可知，随着稀奶油添加量的增加，高蛋白搅拌酸奶的感官评分呈先升高后降低的趋势。稀奶油添加量较少时，高蛋白搅拌酸奶的打发率低、成型性不佳。稀奶油的添加还会提高酸奶的脂肪含量，稀奶油添加量越大时其脂肪含量也越来越高。此外稀奶油也会影响高蛋白搅拌酸奶的成型率和酸奶的口感风味[16]。在稀奶油添加量为4%时高蛋白搅拌酸奶的感官评分为91.3分，脂肪含量为6.02%。因此稀奶油添加量选择4%最适。明胶作为稳定剂在高蛋白搅拌酸奶中影响酸奶的硬度、胶着性、内聚性、打发率、成型率等因素。由图2（b）可知，随着明胶添加量的增加，高蛋白搅拌酸奶感官评分呈先升高后降低的趋势。明胶可以提高凝固型酸奶的凝固效果，改善其组织状态口感，持水力也明显增加，但是添加量过多会使得高蛋白搅拌酸奶的凝固强度太大，导致质地变硬，口感变差，感官品质降低[17]，酸奶的口感会偏硬。在明胶添加量为0.8%时高蛋白搅拌酸奶的感官评分最高达到86.8分，持水力为90.9%。因此明胶添加量选择0.8%最适。由图2（c）可知，随着浓缩牛奶蛋白粉添加量的增加，高蛋白搅拌酸奶的感官评分呈先升高后降低的趋势，但总体影响效果不大。蛋白粉添加量在6%时，感官评分为89.6分，蛋白质含量为5.8%，高蛋白搅拌酸奶黏稠度、口感及风味较好、具有浓厚口感，因此浓缩牛奶蛋白粉添加量选择6%最适。
图2 稀奶油添加量（a）、明胶添加量（b）及浓缩牛奶蛋白粉添加量（c）对高蛋白搅拌酸奶品质的影响
Fig.2 Effect of dilute cream addition (a),gelatin addition (b) and concentrated milk protein powder addition (c) on the quality of high-protein stir yogurt
2.2.2 高蛋白搅拌酸奶配方优化响应面试验
在单因素试验的基础上，采用Box-Behnken中心组合设计原理，选取稀奶油添加量（A）、浓缩牛奶蛋白粉添加量（B）、明胶添加量（C）为考察因素，以高蛋白搅拌酸奶感官评分（Y）为响应值，进行3因素3水平响应面试验分析，响应面试验设计与结果见表4，回归模型方差分析的结果见表5。
表4 高蛋白搅拌酸奶配方优化响应面试验设计与结果
Table 4 Design and results of response surface tests for formula optimization of high-protein stir yogurt
表5 回归模型方差分析
Table 5 Variance analysis of regression model
注：“*”表示对结果影响显著（P＜0.05）；“**”表示对结果影响极显著（P＜0.01）。
利用Design-Expert8.0.6软件对表4试验结果进行多元回归分析，得到对高蛋白搅拌酸奶感官评分影响的回归方程为：
由表5可知，回归模型P＜0.000 1，说明二次多元回归模型极显著（P＜0.01）；失拟项P=0.828 6，不显著（P＞0.05）。回归模型决定系数R2=0.983 5，调整决定系数R2Adj=0.979 4，变异系数（coefficient of variation，CV）值为0.70%，表明回归模型拟合度良好，试验误差小，能准确预测高蛋白搅拌酸奶的感官评分，表明试验操作可信度高，具有实践指导意义[20]。在所取因素水平范围内，试验所选因素对高蛋白搅拌酸奶感官评分影响的强弱次序为明胶添加量（C）＞稀奶油添加量（A）＞浓缩牛奶蛋白粉添加量（B）。
经优化之后由Design-Expert 8.06软件得到高蛋白搅拌酸奶的最佳配方为稀奶油添加量4.11%，浓缩牛奶蛋白粉添加量5.98%，明胶添加量0.77%。在此条件下，高蛋白搅拌酸奶感官评分理论值为88.15分；为方便实际操作，修改高蛋白搅拌酸奶最优工艺配方为稀奶油添加量4%，浓缩牛奶蛋白粉添加量6%，明胶添加量0.8%。在此条件下，高蛋白搅拌酸奶的感官评分实际值为88.35分，接近理论值。
2.3 理化指标检测结果
由表6可知，高蛋白搅拌酸奶的理化指标、乳酸菌数及致病菌均符合GB 19302—2010《食品安全国家标准发酵乳》要求。其中蛋白质含量近限量标准的两倍，进而赋予了产品更高的营养价值。
表6 高蛋白搅拌酸奶理化指标及微生物指标测定结果
Table 6 Determination results of physicochemical and microbiological indexes of high-protein stir yogurt
2.4 高蛋白搅拌酸奶挥发性风味物质分析
2.4.1 高蛋白搅拌酸奶样品的指纹图谱
指纹谱图是通过Gallery plot插件将GC-IMS谱图中的所有谱峰进行重新构建而成，并识别出了其特征峰区域[21]。高蛋白搅拌酸奶样品的Gallery Plot指纹图谱见图3。由图3可知，JD样品中癸醛、苯乙醛、壬醛、3-甲基-2-丁烯醛（单体、二聚体）、乙缩醛、3-甲基丁醛、丁醛、2-壬酮、苯乙酮、6-甲基-5-庚烯-2-酮、环戊酮、4-甲基-3-戊烯-2-酮、3-羟基-2-丁酮、2,3-戊二酮、2-丙酮、2-乙基己醇、1-己醇、4-甲基-1-戊醇、异丁醇、乙醇、丁酸异丁酯、乙酸丁酯（单体、二聚体）、丙酸丁酯、乙酸乙酯、乙酸甲酯、2-甲基丁酸、3-甲基丁酸、丁酸、甲基吡嗪29种风味物质的含量较高，构成了JD样品的特征峰区域；PT样品中2-庚酮（单体、二聚体）、2-己酮、2-戊酮（单体、二聚体）、2-丁酮（单体、二聚体）、羟基丙酮、1-庚醇、1-戊醇、1-辛烯-3-醇、苯甲醛、2-甲基丁醛、辛醛、庚醛、己醛（单体、二聚体）、戊醛、E-2-庚烯醛、E-2-己烯醛、2-己烯醛、二甲基硫醚、2-甲基丙酸、月桂烯20种物质的含量较高，构成了PT样品的特征峰区域。这些特征峰区域使得不同的高蛋白搅拌酸奶样品具有了不同的风味特征。
图3 高蛋白搅拌酸奶样品挥发性风味成分的Gallery Plot图（指纹图谱）
Fig.3 Gallery Plot (fingerprint) of volatile flavor compounds of high-protein stir yogurt samples
图中每一行代表一个样品中选取的全部信号峰，每一列代表同一挥发性有机物在不同样品中的信号峰，部分物质后面有-M、-D，是同一个物质的单体（Monomer）与二聚体（Dimer），数字编号的是未鉴定出的峰。
2.4.2 基于指纹识别数据的挥发性有机物的聚类分析
采用热图和聚类方法等统计方法对获得的挥发性有机物指纹的相似性进行评价[22]。对在2个酸奶样本中的挥发性有机物进行了分析和垂直聚类，结果见图4。
较深的红色或蓝色分别代表高或低的峰值强度[23]。由图4可知，将样本聚类为2个不同的类别。第一类主要包括萜烯和一些化合物，如酮、醇、醛、癸醛、苯乙酮、乙酸乙酯等。这类挥发性有机物表现出乳香和水果果实的香气特性，这些挥发性有机物作为搅拌酸奶的主要风味物质，使其带有更加明显的果香。第二类包括一些酮、醇、醛类，如、2-己酮、2-戊酮、2-丁酮、1-庚醇、1-戊醇、苯甲醛、辛醛、己醛、戊醛、二甲基硫醚、2-甲基丙酸、月桂烯。该簇物质可以产生乳香及青草香气特性[24]。这表明两种酸奶的香气特性具有较大差别，两者除了都有乳制品共有的乳香外，搅拌酸奶带有更多成熟水果的果香而普通酸奶却带有更多青草香的特征。
图4 高蛋白搅拌酸奶样品特征风味物质的热图和聚类分析
Fig.4 Heatmap and cluster analysis of characteristic flavor substances in high-protein stir yogurt samples
每个物质的峰值体积在热图中用不同的颜色标记。红色越深，物质的峰值体积就越大，蓝色越深，峰值体积就越小。
2.4.3 酸奶样品中挥发性风味物质定性分析
通过GC-IMS技术对酸奶中的挥发性风味物质进行鉴定和分析，结果见表7。
由表7可知，采用GC-IMS技术在搅拌酸奶中共检测到29种含量较高的风味物质（相对含量＞0.1%），包括7种醛类、8种酮类、5种醇类、5种酯类、3种酸类和1种杂化类化合物。而裸酸奶中风味物质较搅拌酸奶少，共有20种风味物质，包括9种醛类、5种酮类、3种醇类、1种酸类及2种杂化类化合物。其中，二者共有的化合物类型为醛类、酮类、醇类和酸类。
表7 酸奶样品中挥发性风味化合物定性结果
Table 7 Qualitative results of volatile flavor compounds in yogurt samples
续表
两个酸奶中均存在的丁酸、丙酸等挥发性酸类物质是使酸奶存在独特酸气味的来源。裸酸奶中存在的2-丁酮风味类似于丙酮，呈现清甜的果香味；二甲基硫醚存在于原料乳牛奶本身，是构成牛奶香气的主要成分[25]；月桂烯的存在能赋予酸奶芳香气味。搅拌酸奶中含有的3-羟基-2-丁酮（也称乙偶姻）是常存在于发酵乳中的风味物质，风味类似双乙酰，可赋予酸奶独特的奶油风味[26]；乙醇是酸奶中最重要的醇类风味物质，但具体的风味机理还有待考究[27]；乙酸丁酯（水果味）、丙酸丁酯、乙酸乙酯（菠萝味）、乙酸甲酯等酯类物质的存在能赋予酸奶水果和花香味[28]。此外，根据丹彤等[29]的研究，蛋白质或碳水化合物含量较高的物质中甲基吡嗪含量较高，搅拌酸奶中除了牛乳还添加了牛奶蛋白粉和乳清蛋白粉，含有较高的蛋白质，故检测出甲基吡嗪这一特征风味物质。搅拌酸奶中配料成分比裸酸奶更为丰富，因而检测出的风味物质较多，赋予了酸奶丰富的口感层次，让消费者们在追求健康养生的同时也能兼具味觉盛宴。
3 结论
本实验主要是对高蛋白搅拌酸奶配方中的稀奶油、浓缩牛奶蛋白粉、明胶的添加量进行优化及研究搅拌时间对成品品质的影响。结果表明，高蛋白搅拌酸奶的最优配方为浓缩牛奶蛋白粉添加量6%、明胶添加量0.8%、稀奶油添加量4%，经发酵后破乳，冷藏后熟后搅拌5 min充气，然后进行灌装冷藏。在此工艺条件下，高蛋白搅拌酸奶风味最佳，感官评分为88.35分，蛋白质含量达到5.79 g/100 g。经GC-IMS检测，共检出29种挥发性风味物质，包括7种醛类、8种酮类、5种醇类、5种酯类、3种酸类和1种杂环类化合物，除发酵酸乳特有的酸味外，还赋予酸奶独特的奶油味、清甜的果味和花香味等丰富的口感层次。各项指标均符合国家标准且稳定性好。本产品不仅赋予酸奶更好的营养，也为新型酸奶提供了新的思路。
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