白酒是我国的国酒[1]，是中国特有的蒸馏酒[2]。根据风格的不同，可将白酒划分为清香型、浓香型、酱香型、米香型等香型[3]，其中，由于清香型白酒具有“清香纯正，绵甜爽净，醇甜柔和”的风格[4-5]，深受国内外广大消费者的喜爱。清香型白酒是以高粱为原料，以大曲为糖化发酵剂，采用“清蒸二次清，地缸固态发酵，甑桶蒸馏”工艺生产而成的白酒，其主要的风味物质为乙酸乙酯[6-9]。乙酸乙酯的含量影响着白酒的品质及风格[10]。由于清香型白酒的发酵过程是“物系、酶系、菌系”及发酵条件动态变化过程[11-12]。乙酸乙酯的形成因受外界环境影响，具有一定的波动性[13]。因此，研究发酵条件对清香型白酒中乙酸乙酯形成的影响，对于调控清香型白酒中乙酸乙酯的形成，稳定和进一步提升清香型白酒中乙酸乙酯的含量，助推清香型白酒向可控化、智能化方向发展具有重要意义[14-17]。该研究以清香型白酒大米查发酵工艺为基础，通过恒温发酵的方式，采用单因素试验，探究水添加量、大曲添加量、发酵温度、发酵时间等因素对清香型白酒发酵过程中乙酸乙酯形成影响，并在单因素试验基础上，以乙酸乙酯产量为评价指标，采用响应面试验优化高产乙酸乙酯的发酵工艺条件，为清香型白酒品质稳定和提升提供技术支撑。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
高粱（晋杂22号）、低温大曲（精米查曲、红心曲、后火曲的混合生产用曲）：山西某酒厂提供。
乙酸乙酯（分析纯）、磷酸（分析纯）、乙腈（色谱纯）：上海阿拉丁科技公司；无水乙醇、磷酸二氢钾（均为分析纯）：天津市风和化学试剂科技有限公司。
1.2 仪器与设备
BS2010S电子天平：北京赛多利斯天平有限公司；Agilent 1260高效液相色谱（high-performance liquid chromatogra phy，HPLC）仪、Agilent ZORBAX SB-C18色谱柱（4.6 mm×150 mm，5 μm）：安捷伦科技有限公司；85-2A磁力搅拌器：精凿科技（上海）有限公司；ST2100 pH计：常州奥豪斯仪器有限公司；Top Pette移液枪：济南东仪试验室设备有限公司；SCAA-104有机相尼龙针式滤器：上海安谱实验科技股份有限公司。
1.3 方法
1.3.1 清香型白酒的加工工艺流程及操作要点
操作要点：参考《清香型白酒生产技术》[18]。
1.3.2 分析检测
酒精度的测定：参考国标GB 5009.225—2016《食品安全国家标准酒中乙醇浓度的测定》[19]中的酒精计法；乙酸乙酯含量的测定：参考魏志阳等[20]的高效液相色谱法，略有修改。高效液相色谱分析条件：ZORBAX SB-C18色谱柱（4.6 mm×150 mm，5 μm）；流动相为乙腈-0.05 mol/L KH2PO4（8∶92，V/V）；流速1.0mL/min；进样量20μL；检测波长210nm。
1.3.3 发酵工艺优化
（1）单因素试验
将粉碎后的高粱，在不同发酵时间（0、3 d、7 d、15 d、17 d、21 d、28 d）、发酵温度（24 ℃、26 ℃、28 ℃、30 ℃、32 ℃、34 ℃）、大曲添加量（2%、4%、6%、8%、10%、12%）、水添加量（80%、100%、120%、140%、160%）的条件下进行发酵。分别测定酒醅酒精度和乙酸乙酯含量，探究以上各因素对清香型白酒发酵大米查酒醅中乙酸乙酯形成的影响。
（2）响应面试验
根据单因素试验，确定影响清香型白酒发酵大米查酒醅中乙酸乙酯形成的三个显著因素，以大曲添加量（A）、发酵温度（B）、水添加量（C）为评价因素，以酒醅中乙酸乙酯含量（Y）作为响应值，设计响应面试验，响应面试验的因素与水平见表1。
表1 发酵工艺优化响应面试验设计因素与水平
Table 1 Factors and levels of response surface experiments design for fermentation process optimization
1.3.4 数据处理
利用Origin 8.5软件绘图，Design Expert 10.0.7进行响应面试验数据分析。
2 结果与分析
2.1 发酵工艺优化单因素试验
2.1.1 发酵时间对清香型白酒酒醅中乙酸乙酯形成的影响
由图1可知，随着发酵时间在0～21 d范围内的增加，清香型白酒发酵酒醅中乙酸乙酯含量及酒精度均呈现先增加后略有降低的趋势，发酵初期酒醅中乙酸乙酯含量快速上升；当发酵时间达到21 d时，发酵酒醅中乙酸乙酯含量达到最高，为（0.71±0.020）g/kg；当发酵时间达到17 d时，酒精度最高，为（11.8±0.20）%vol；发酵时间在21～28 d时，酒醅中乙酸乙酯含量略微降低。发酵时间在17～28 d时，酒精度略有降低。发酵后期，酒醅中营养物质被消耗，微生物代谢缓慢，产酯能力下降。因此，选择最适发酵时间为21 d。
图1 发酵时间对酒醅中乙酸乙酯含量及酒精度的影响
Fig.1 Effect of fermentation time on ethyl acetate contents and alcohol content of fermented grains
2.1.2 发酵温度对清香型白酒酒醅乙酸乙酯形成的影响
低温发酵有利于养醅，防止酒醅生酸过快[21]，可以提高出酒率；并且低温发酵酒甜，绵柔爽净；高温发酵的酒苦，后味苦涩、杂味大[22]。
由图2可知，当发酵温度在24～28 ℃范围内的升高，酒醅中酒精度和乙酸乙酯含量随之增加；当发酵温度为28 ℃时，酒醅中乙酸乙酯含量、酒精度达到最高，分别为（0.75±0.02）g/kg、（11.9±0.21）%vol；当发酵温度在28～34 ℃时，酒醅中酒精度和乙酸乙酯含量随之下降。通过与室温发酵对比发现，在一定的温度范围内，当酒醅发酵温度恒定，有利于酒醅发酵中乙酸乙酯和乙醇的形成。因此，选择最适发酵温度为28 ℃。
图2 发酵温度对酒醅中乙酸乙酯含量及酒精度的影响
Fig.2 Effect of fermentation temperature on ethyl acetate contents and alcohol content of fermented grains
2.1.3 大曲添加量对清香型白酒酒醅乙酸乙酯形成的影响大曲
作为重要的糖化剂和发酵剂[23]，是引起酒醅发酵的微生物及其代谢产物的主要来源[24]。大曲的品质和质量在清香型白酒发酵过程中尤其重要[25]。
由图3可知，当大曲添加量在2%～12%范围内的增加，酒醅中乙酸乙酯含量、酒精度随之升高；当大曲添加量为12%时，酒醅中乙酸乙酯含量、酒精度最高，分别达到（0.81±0.01）g/kg、（11.8±0.15）%vol；随着大曲添加量在2%～12%范围内的增加，酒醅中酯化酶作用加快，加速了酒醅中淀粉的转化，乙酸乙酯合成速率加快，所以酒醅中乙酸乙酯含量快速增加。因此，选择最适大曲添加量为12%。
图3 大曲添加量对酒醅中乙酸乙酯含量及酒精度的影响
Fig.3 Effect of Daqu addition on ethyl acetate contents and alcohol content of fermented grains
2.1.4 水添加量对清香型白酒酒醅乙酸乙酯形成的影响
白酒发酵过程中除了发酵温度和发酵时间等因素，水添加量也会在一定程度上影响到酒体的成分和品质[26]。
由图4可知，随着水添加量在80%～120%范围内的增加，酒醅中的乙酸乙酯含量和酒精度随之增加；当水添加量为120%时，酒醅中乙酸乙酯含量达到最高，为（0.86±0.01）g/kg；当水添加量为140%时，酒醅中酒精度最高，为（11.4±0.15）%vol；当水添加量＞120%之后，乙酸乙酯含量有所下降；当水添加量＞140%之后，酒精度稍有降低。因此，选择最适水添加量为120%。
图4 水添加量对酒醅中乙酸乙酯含量及酒精度的影响
Fig.4 Effect of water addition on ethyl acetate contents and alcohol content of fermented grains
2.2 发酵工艺优化响应面试验
2.2.1 响应面试验结果及方差分析
通过单因素试验，筛选出了3个影响清香型白酒大米查发酵酒醅中乙酸乙酯含量及酒精度变化的显著因子，以大曲添加量（A）、发酵温度（B）、水添加量（C）为自变量，酒醅中乙酸乙酯含量（Y）作为响应值，进行响应面优化试验设计，结果见表2，方差分析结果见表3。
表2 响应面试验设计与结果
Table2 Design and results of response surface experiments
表3 回归模型方差分析
Table 3 Variance analysis of regression model
续表
注：“**”表示对结果影响极显著（P＜0.01），“*”表示对结果影响显著（P＜0.05）。
应用Design Expert 10.0.7软件分析了大曲添加量（A）、发酵温度（B）、水添加量（C）3因素对清香型白酒中乙酸乙酯含量的影响，得出酒醅中乙酸乙酯含量（Y）的二次回归方程为：Y=+0.90+0.008 75A+0.031B+0.018C-0.005AB+0.012AC+0.002 5BC-0.097A2-0.097B2-0.13C2。
根据表3可知，建立的酒醅发酵产乙酸乙酯的回归模型P值＜0.000 1，表明此响应面回归模型极显著。乙酸乙酯失拟项P值=0.123 4＞0.05，不显著，说明试验误差较小，响应面模型预测的结果可靠。回归方程决定系数R2为0.997 6，校正决定系数R2adj为0.994 5，表明多元回归关系显著，此试验设计可靠，因此可以利用该回归方程预测上述因素对清香型白酒中乙酸乙酯含量的影响。由P值可知，一次项B、C及二次项A2、B2、C2对酒醅中乙酸乙酯含量影响均极显著（P＜0.01），一次项A及交互项AC对酒醅中乙酸乙酯含量的影响显著（P＜0.05）。由F值可知，3因素对酒醅中乙酸乙酯含量的影响顺序为发酵温度＞水添加量＞大曲添加量。
2.2.2 各因素对清香型白酒酒醅中乙酸乙酯形成影响的响应面分析
大曲添加量（A）、发酵温度（B）、水添加量（C）三个因素交互作用对清香型白酒大米查酒醅中乙酸乙酯含量（Y）影响响应面及等高线见图5。根据各因素之间的三维响应面图形观察各因素间交互作用的强弱，也可以反映出各个交互作用对响应值的影响强弱。等高线图中曲线越陡，影响越显著；曲线越平顺，影响越微弱。三维响应面图的形状变化表示响应值的变化。
图5 大曲添加量、发酵温度和水分添加量间交互作用对乙酸乙酯含量影响的响应曲面及等高线
Fig.5 Response surface plots and contour lines of effects of interaction between Daqu addition,fermentation temperature and water addition on ethyl acetate contents
由图5可知，各因素间交互作用对结果影响的响应面曲线走势较陡，等高线呈椭圆形，说明AB、AC、BC之间存在交互作用，乙酸乙酯含量随着大曲添加量（A）、水添加量（C）两者交互作用响应面较为陡峭，等高线椭圆程度较为明显，对乙酸乙酯含量的影响显著（P＜0.05）。
2.2.3 响应面验证试验
通过Design-Expert 10.0.8软件得到最优工艺参数为大曲添加量12.17%，发酵温度28.31 ℃，水添加量118.52%。为了便于实际操作，将清香型白酒大米查最优发酵工艺条件修正为：大曲添加量12.2%，发酵温度28 ℃，水添加量118%，在此优化条件下，进行3次平行验证试验，乙酸乙酯含量实际值为（0.91±0.02）g/kg，与预测值0.901 g/kg基本保持一致，故该模型可行。
3 结论
通过单因素及响应面试验，确定了高产乙酸乙酯清香型白酒的最优发酵条件为大曲添加量12.2%，发酵温度28℃，水添加量118%。在此最佳条件下，酒醅中乙酸乙酯含量达到最高，为（0.91±0.02）g/kg。本研究为提高清香型白酒酒醅中乙酸乙酯的含量及促进清香型白酒向智能化、可控化方向发展提供技术支撑。
[1]孙宝国.国酒[M].北京：化学工业出版社，2019：4-25.
[2]ZHENG X W,HAN B Z.Baijiu(白酒),Chinese liquor:history,classification and manufacture[J].J Ethnic Foods,2016,3(1):19-25.
[3]国家市场监督管理总局，国家标准化管理委员会.GB/T 17204—2021饮料酒术语和分类[S].北京：中国标准出版社，2021.
[4]中华人民共和国国家市场监督管理总局，中国国家标准化管理委员会GB/T 10781.2—2006 清香型白酒[S].北京：中国标准出版社，2006.
[5]相里加雄，曹苗文，杨凯环，等.清香型白酒不同酿造工艺下环境微生物群落结构差异[J].酿酒，2022，49（1）：118-123.
[6]韩英，李惠源，贾丽艳，等.库德毕赤酵母FJZ固态发酵产乙酸乙酯工艺的优化[J].酿酒科技，2021（9）：131-135，140.
[7]沈怡方.白酒生产技术全书[M].北京：中国轻工业出版社，2009：332.
[8]刘鑫，王耀，庹先国，等.白酒检测技术在生产中的应用研究进展[J].中国酿造，2022，41（3）：6-12.
[9]贾丽艳，田宇敏，荆旭，等.清香风味导向的酿酒酵母Y2的分离鉴定及生物学特性研究[J].中国食品学报，2020，20（1）：230-236.
[10]FAN G,SUN B,XU D,et al.Isolation and identification of high-yield ethyl acetate-producing yeast from Gujinggong Daqu and its fermentation characteristics[J].J Am Soc Brew Chem,2018,76(2):117-124.
[11]李兵，张超，王玉霞，等.白酒大曲功能微生物与酶系研究进展[J].中国酿造，2019，38（6）：7-12.
[12]LI Z,FAN Y,HUANG X,et al.Microbial diversity and metabolites dynamic of light-flavor Baijiu with stacking process[J].Fermentation,2022,8(2):67.
[13]庞晓娜.环境微生物对清香型白酒特征风味物质的影响[D].北京：中国农业大学，2018.
[14]PANG X N,CHEN C,HUANG X N,et al.Influence of indigenous lactic acid bacteria on the volatile flavor profile of light-flavor Baijiu[J].LWTFood Sci Technol,2021,147:111540.
[15]王雪山.不同环境清香类型白酒发酵微生物种群结构比较及溯源解析[D].无锡：江南大学，2018.
[16]SUN Y L,MA Y,CHEN S,et al.Exploring the mystery of the sweetness of Baijiu by sensory evaluation,compositional analysis and multivariatedata analysis[J].Foods,2021,10(11):2843.
[17]贾丽艳，郭晋田，刘帅，等.清香型白酒发酵过程中微生物及理化指标的变化规律[J].中国食品学报，2020，20（8）：162-167.
[18]康明官.清香型白酒生产技术[M].北京：化学工业出版社，2005：28-29.
[19]中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会.GB 5009.225—2016食品安全国家标准酒中乙醇浓度的测定[S].北京：中国标准出版社，2016.
[20]魏志阳，李秋志，邢爽，等.HPLC法同时测定清香类酒醅中主要酸和酯类物质[J].中国酿造，2018，37（8）：167-171.
[21]王元太.清香型白酒酿造技术[M].北京：中国轻工业出版社，2009：127-147.
[22]余培斌，陈丙友，陈建新.白酒地缸发酵过程中酒醅温度及理化指标分析[J].食品与发酵工业，2019，45（10）：48-53.
[23]王柏文，吴群，徐岩，等.中国白酒酒曲微生物组研究进展及趋势[J].微生物学通报，2021，48（5）：1737-1746.
[24]尉嘉眙，常强，蒋超，等.大曲理化性质与白酒产品风味的相关性分析[J].食品工业科技，2020，41（18）：244-251.
[25]贾丽艳，田宇敏，王晓勇，等.传统清香型白酒发酵过程中真菌群落结构及其动态演替[J].中国食品学报，2020，20（10）：303-308.
[26]吕雅娟.不同发酵期清香型白酒对比分析[J].酿酒，2021，48（3）：41-43.