桑椹（Morus nigra）含有很多营养素和有益健康的生物活性化合物[1]，如褪黑素[2]、多酚化合物[3]、白藜芦醇[4]、类黄酮[5]、花青素[6]和多糖[7]。这些化合物具有多种生物活性，包括抗血栓[8]、抗氧化剂[9]、抗肥胖[10]、抗炎[11]、抗癌[12]和神经保护[13]。因此，桑椹自古以来就被用作传统药物[14]，被中国药典认定为药食同源的食物。新鲜桑椹常被加工成桑椹干、桑椹膏及桑椹酒等，桑椹酒因含有丰富的生物活性物质而深受消费者青睐。
桑椹酒和干红葡萄酒颜色相似，都含有大量花青素[15-16]。但因为原料不同，其营养物质和风味各有不同，两者都含有丰富的抗氧化物，葡萄酒中的胡萝卜素高于桑椹酒，但桑椹酒中的花青素、白藜芦醇、黄酮类化合物、硒元素、维生素E等均要高于葡萄酒[17]。LIU S J等[18]研究表明，适宜的酵母菌株能减少桑椹酒发酵过程中花青素的降解、颜色褐变及抗氧化活性，提高果酒风味和品质。左勇等[19]以酵母A2为菌种酿造桑椹果酒，打浆时添加了适量的水、亚硫酸溶液和葡萄糖，在SO2质量浓度为70 mg/L、糖度为170 g/L，接种量9%、26 ℃条件下进行酒精发酵。赫连远坤等[20]采用1%盐水、1%淀粉液和自来水清洗赤霞珠葡萄，破碎后的葡萄浆接种活化后的活性干酵母ST进行发酵，结果表明，用1%盐水或1%淀粉液清洗能去除较多的霉菌和细菌，提高酿酒葡萄洁净度，有利于葡萄酒发酵产乙醇及风味复杂性。OBERHOLSTERA等[21]研究明胶、蛋清和错流微滤对葡萄酒酚类物质的影响，以期通过工艺改善提高葡萄酒品质。
桑椹酒风味独特，但较葡萄酒显得单一。此外，桑椹酒产量和认同度远远低于葡萄酒。如将桑椹和葡萄酿造成桑椹葡萄复合果酒，则可以集两者之优势于一体，开发一款独具特色的复合果酒。本研究以桑椹品种黑珍珠与酿酒葡萄品种赤霞珠为原料，制备桑椹葡萄复合果酒。探讨不同比例桑椹葡萄混合发酵的果酒的风味特征，采用单因素试验及响应面试验筛选其最佳发酵工艺，并通过气质联用（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）技术分析桑椹葡萄复合果酒的香气成分特征，研制桑椹葡萄复合果酒，可满足人们对营养保健、口感风味、时尚生活的不同需求，为工业化生产桑椹葡萄复合果酒提供技术支撑。同时可在一定程度上解决桑椹深加工问题，丰富果酒产品，促进果酒市场发展。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
桑椹（品种黑珍珠）：河北金桑园农业发展有限公司；葡萄（品种赤霞珠）：市售；安琪牌果酒专用酵母：安琪酵母股份有限公司；果胶酶（30 000 U/g）：宁夏和氏璧生物技术有限公司；白砂糖（食品级）：市售；无水柠檬酸、偏重亚硫酸钾（均为分析纯）：国药集团化学试剂有限公司。
1.2 仪器与设备
BL-300-X电子天平：厦门百伦斯电子科技有限公司；HH-4恒温水浴锅：金坛市杰瑞尔电器有限公司；STARTER 3100 pH计：上海奥豪斯仪器有限公司；SPX-250B-Z恒温培养箱：上海博讯实业有限公司医疗设备厂；安捷伦7890A-5975C气质联用（GC-MS）系统：美国安捷伦公司；TG-WAXMS毛细管柱：美国赛默飞世尔（中国）科技公司。
1.3 实验方法
1.3.1 桑椹葡萄复合果酒加工工艺流程及操作要点
操作要点：将桑椹、葡萄清洗，沥干水分后，按照一定质量比混合、破碎，根据预设复合果酒15%vol的酒精度加糖，混合破碎好的果汁中加入偏重亚硫酸钾（以SO2计，终浓度为60 mg/L）和300 mg/L的果胶酶，于10 ℃培养箱中浸渍16 h。称取1 g的活性干酵母于烧杯中，再加入10 mL的桑葚葡萄混合果汁，在37 ℃条件下活化30～40 min，活化酵母接入混合果汁中，于23 ℃条件下进行酒精发酵（测定酒液比重，保持稳定不变即为酒精发酵结束），酒精发酵结束后，用纱布进行皮渣分离，在18 ℃条件下进行20 d苹果酸-乳酸发酵，30 mg/L蛋清粉下胶处理酒样2 d，过滤澄清得到原酒，酒装瓶后于水浴锅70 ℃杀菌10 min，取出冷却即为桑椹葡萄复合果酒成品。
1.3.2 桑椹与葡萄质量比对桑椹葡萄复合果酒品质的影响
试验设6组处理，其桑椹与葡萄质量比分别为1∶0、1∶1、1∶2、1∶4、1∶6、0∶1，编号为1～6号，每组3个重复。分别测定1～6号桑椹葡萄复合果酒样品的初始糖含量及发酵参数，并对其进行感官评价，确定最佳桑椹和葡萄质量比。
1.3.3 分析检测
酒精度、酸度、总糖、可溶性固形物等理化指标与感官指标的测定，参考国标GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》[22]。感官评定标准见表1。
表1 桑椹葡萄复合果酒感官评定标准
Table 1 Sensory evaluation standards of mulberry-grape compound fruit wine
1.3.4 桑椹葡萄复合果酒发酵工艺优化
单因素试验：在确定桑椹和葡萄质量比后，分别设置酵母添加量为1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%，发酵时间为3 d、5 d、7 d、9 d、11 d，发酵温度为17 ℃、20 ℃、23 ℃、26 ℃、29 ℃进行发酵工艺优化单因素试验，考察酵母添加量、发酵时间、发酵温度对桑椹葡萄复合果酒酒精度及感官评分的影响。
响应面试验设计：在单因素试验基础上，选取对桑椹葡萄复合果酒发酵影响较大的发酵温度（A）、酵母接种量（B）、发酵时间（C）作为自变量，以酒精度（Y1）和感官评分（Y2）为响应值，采用Design-Expert 8.0.6软件设计响应面分析试验。Box-Behnken试验设计因素水平见表2。
表2 桑椹葡萄复合果酒发酵工艺优化Box-Behnken试验设计因素与水平
Table 2 Factors and levels of Box-Behnken experiments design for fermentation technology optimization of mulberry-grape compound fruit wine
1.3.5 复合果酒挥发性风味物质GC-MS分析
通过固相微萃取（solid phase microextraction，SPME）提取桑椹葡萄复合果酒样品中的香气化合物，采用GC-MS法进行分析[23]。
样品前处理：将含有7.5 mL桑椹葡萄复合果酒样品、2 g NaCl和25 μL三辛醇内标的混合物放入18 mL样品瓶中。将50/30 μm DVB/Carboxen/PDMS萃取头插入由聚四氟乙烯-硅隔膜密封的样品瓶中，在40 ℃下温浴52 min萃取，解吸6 min，使用安捷伦7890A-5975C GC/MS系统进行挥发性香气化合物分析[24]。
气相色谱条件：TG-WAXMS毛细管柱（60 m×0.25 mm×0.25 μm），载气为氦气（He），流速为1 mL/min。升温程序：在50 ℃的初始温度下保持2 min，随后，以3 ℃/min的速率将温度升高至80 ℃，然后以5 ℃/min的速率再升高至230 ℃，230 ℃下保持6 min[25]。
质谱条件：电子电离（electronic ionization，EI）源，电子能量70 eV，离子源温度：230 ℃；四极杆温度：150 ℃；溶剂延迟：4 min；增益系数：1；质量扫描范围在20～450 m/z[26]。
定性定量方法：使用安捷伦科技公司5977A化学站软件确定每个峰的面积。美国国家标准技术研究所（national institute of standards and technology，NIST）14标准库自动检索化合物的质谱数据，然后参考相对标准光谱图进行化合物定性分析。采用峰面积归一化法计算各组分的相对含量，进行定量分析[27]。
1.3.6 数据处理
数据处理采用Microsoft Office Excel 2010和SPSS.20.0软件，显著性分析采用最小显著差别（least significant dif ference，LSD）和Duncan（D）进行假定方差齐性检验，P＜0.05表示差异达到显著水平。
2 结果与分析
2.1 桑椹和葡萄质量比的确定
2.1.1 不同桑椹和葡萄质量比对桑椹葡萄复合果酒初始糖含量及发酵参数的影响
不同桑椹和葡萄质量比对桑椹葡萄复合果酒理化指标的影响见表3。由表3可知，随着葡萄果实比例的增加，初始糖含量呈上升趋势（90～250.3 g/L），表明葡萄比桑椹含糖量更高。为了将各组的初始糖含量调整为等量（250 g/L），在样品1号至5号之间向各组添加适量蔗糖。酒精发酵结束后，1号样品的酒精度为11.20%vol，是六组中的最低值，这意味着某些糖或其他有机物无法通过酵母完全转化为酒精。桑椹和葡萄的质量比越低，发酵后剩余的总糖越低。另一方面，1号样品的可溶性固形物含量和总酸显著高于其他组，其他各组样品差异不大。考虑到白砂糖的添加量、桑椹葡萄复合果酒的风味等因素，选择最适桑椹和葡萄质量比为1∶4。
表3 不同桑椹和葡萄质量比对桑椹葡萄复合果酒初始含糖量及发酵参数的影响
Table 3 Effect of different mass ratio of mulberry and grape on the initial sugar contents and fermentation parameters of mulberry-grape compound fruit wine
注：不同字母表示差异显著（P＜0.05）。
2.1.2 不同桑椹和葡萄质量比对桑椹葡萄复合果酒感官品质的影响
不同桑椹和葡萄质量比对桑椹葡萄复合果酒感官品质的影响结果见图1。由图1可知，1号样品色泽深紫，较澄清，桑椹香气浓郁丰富，挥发酸高，愉悦度弱一些，感官评分为79分。2号样品酒体澄清，有光泽，无沉淀，桑椹香气浓郁丰富，感官评分为82分。3号样品色泽深紫，较澄清，口感平衡，回味较好，感官评分为83分。4号样品色泽深紫，比较澄清，口感爽净，平衡协调，回味长，感官评分为90分。5号样品色泽紫红，澄清透明，桑椹香气浓郁，口感单薄，回味短，感官评分为87分。6号样品色泽紫红，澄清晶亮入口时酸，掩盖了一部分香气成分，整体表现略有欠缺，余味短，感官评分为82分。因此，最适桑椹和葡萄质量比为1∶4。综上，桑椹和葡萄质量比1∶4最适合酿制桑椹葡萄复合果酒。
图1 不同桑椹和葡萄质量比对桑椹葡萄复合果酒感官评分的影响
Fig.1 Effect of different mass ratio of mulberry and grape on sensory score of mulberry-grape compound fruit wine
2.1.3 桑椹葡萄复合果酒发酵工艺优化单因素试验
在桑椹和葡萄质量比为1∶4条件下，分别设置酵母接种量为1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%，发酵时间为3 d、5 d、7 d、9 d、11 d，发酵温度为17 ℃、20 ℃、23 ℃、26 ℃、29 ℃进行复合果酒发酵工艺优化单因素试验，结果见图2。
图2 酵母接种量（A）、发酵温度（B）和发酵时间（C）对桑椹葡萄复合果酒酒精度和感官评分的影响
Fig.2 Effect of yeast inoculum (A),fermentation temperature (B)and time (C) on the alcohol content and sensory score of mulberry-grape compound fruit wine
由图2A可知，在接种量为1.0%～2.0%时，酒精度和感官评分随之增高；在接种量为2%时，酒精度和感官评分最高，分别为13.2%vol和92分；在接种量为2.0%～3.0%时，酒精度和感官评分随之下降。因此，最适接种量为2.0%。由图2B可知，在发酵温度为17～23 ℃时，酒精度和感官评分随之增高；在发酵温度为23 ℃时，酒精度和感官评分最高，分别为13.6%vol和92分；在发酵温度为23～29 ℃时，酒精度和感官评分随之下降。因此，最适发酵温度为23 ℃。由图2C可知，在发酵时间为3～9 d时，酒精度和感官评分随之增高；在发酵时间为9 d时，酒精度和感官评定分数最高，分别为13.6%vol和92分；在发酵时间为9～13 d时，酒精度和感官评分随之下降。因此，最适发酵时间为9 d。
2.2 桑椹葡萄复合果酒发酵工艺优化响应面试验
2.2.1 响应面分析及模型方差分析
在单因素试验基础上，选取对桑椹葡萄复合果酒发酵影响较大的发酵温度（A）、酵母接种量（B）、发酵时间（C）作为自变量，以酒精度（Y1）和感官评分（Y2）为响应值，依据Box-Behnken试验设计原理，设计17个试验点的响应面分析试验，Box-Behnken试验设计及结果见表4，方差分析见表5。
表4 桑椹葡萄复合果酒发酵工艺优化Box-Behnken试验设计及结果
Table 4 Design and results of Box-Behnken experiments for fermentation technology optimization of mulberry-grape compound fruit wine
采用Design-Expert 8.0.6软件对表4数据进行二次回归方程拟合，得到酒精度和感官评分对发酵温度（A）、酵母接种量（B）及发酵时间（C）的多元二次回归方程：
由表5可知，模型显著（P＜0.001），酒精度失拟项不显著（P=0.292 9＞0.05），感官评分失拟项不显著（P=0.133 8＞0.05），表明该模型在研究区域拟合度较好。以酒精度为响应值，模型决定系数R2=0.955 8，调整决定系数R2Adj=0.899 0，以感官评分为响应值，模型决定系数R2=0.950 1，调整决定系数R2Adj=0.885 9，说明该回归模型具有较好的拟合水平。由P值可知，一次项B，二次项A2、C2对酒精度影响极显著（P＜0.01），一次项A、C，二次项B2对酒精度影响显著（P＜0.05）；一次项B、C，二次项A2、C 2对感官评分影响极显著（P＜0.01），一次项A，二次项B2对感官评分影响显著（P＜0.05）。由F值可知，桑椹葡萄复合果酒中各因素对酒精度影响顺序为酵母接种量＞发酵温度＞发酵时间；各因素对感官评分影响顺序为发酵时间=酵母接种量＞发酵温度。
表5 回归模型方差分析
Table 5 Variance analysis of regression model
注：“*”表示对结果影响显著（P＜0.05）；“**”表示对结果影响极显著（P＜0.01）。
2.2.2 验证试验
通过Design Expert 8.0.6软件分析，桑椹与葡萄质量比为1∶4时，最佳发酵工艺条件为：发酵温度24.27 ℃、酵母接种量2.20%、发酵时间8.60 d。在此条件下，桑椹葡萄复合果酒的酒精度的理论值为13.63%vol，感官评分的理论值为93.59分。考虑到实际操作可行性，将最佳发酵工艺条件修正为：发酵温度24 ℃、酵母接种量2.0%、发酵时间9 d，对桑椹葡萄复合果酒发酵工艺条件进行3次平行验证试验，测得优化后的酒精度实际值为13.60%vol，感官评分实际值为94分，与预测值相差不大，验证结果与响应面试验预测结果基本一致，说明优化工艺可行。
2.2.3 桑椹葡萄复合果酒中挥发性化合物种类及含量
通过固相微萃取（SPME）提取桑椹葡萄酒样品中的香气化合物，并通过GC-MS进行分析[23]，结果见表6。由表6可知，桑椹葡萄复合果酒共检出50种挥发性化合物，包括醇类20种、酯类9种、酸类10种、醛类3种、酚类3种、酮类1种、醚类2种、烯烃类2种。酯类如乙酸乙酯、辛酸乙酯、乙酸异戊酯、乙酸异戊酯等具特有的水果香气[29]；醇类如乙醇、苯乙醇、三辛醇等具有强烈的酒精味道和花香[30]；酸类如琥珀酸具有轻微的咸味和苦味[31]；醛类如苯乙醛具有能够产生强烈的类似甜酒的风味[32]；萜烯化合物能产生类似香橙花和玫瑰花的香气，有时候也会有凤梨的香气[33]。这些香气成分共同构成了桑椹葡萄发酵酒独特的香气与风格。
表6 桑椹葡萄复合果酒的香气成分测定结果及香气特征
Table 6 Determination results of aroma compounds and aroma characteristics of mulberry-grape compound fruit wine
续表
3 结论
酿造桑椹葡萄复合果酒的最佳桑椹葡萄质量比为1∶4。采用单因素试验及响应面试验确定最佳发酵工艺条件为：酵母接种量2.0%，发酵温度24 ℃，发酵时间9 d。在此条件下，酒精度为13.6%vol，感官评分为90分。桑椹葡萄复合果酒共检出50种香气化合物，包括醇类20种、酯类9种、酸类10种、醛类3种、酚类3种、酮类1种、醚类2种、烯烃类2种。其中醇类、酯类和酸类是桑椹葡萄复合果酒的香气成分。这款果酒的特点是色泽深紫色，果香稳定和谐，酒体醇厚，回味丰富。桑椹葡萄复合果酒的开发将满足人们对口感、风味和保健的追求，为解决桑椹的贮藏问题和深加工提供可行的策略。
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