青稞俗称裸大麦，是青藏高原一种常见的粮食作物，具有耐高寒、适应性强、高产早熟等特点[1]。特殊的生长环境赋予其高蛋白、高纤维、高维生素和低脂肪、低糖的三高两低特性和富含β-葡聚糖等功能因子，具有很好的营养功能[2-3]，对预防心血管疾病、糖尿病等有显著作用[4-6]。
淀粉是青稞的重要组成成分，被人体分解利用，供给人体热量，因其消化性不同可以分为快消化淀粉（ready digestible starch，RDS）、慢消化淀粉（slowly digestible starch，SDS）和抗性淀粉（resistant starch，RS）三类[7]，快消化淀粉是指在小肠中20 min内消化；慢消化淀粉是指能在小肠中20～120 min内才能被消化；抗性淀粉指120 min内无法在小肠中消化吸收。研究表明，快消化淀粉（RDS）作为日常主食的主要成分，使人很快饥饿增加食欲从而容易引致肥胖和影响脂类新陈代谢；慢消化淀粉（SDS）能够缓慢释放能量，可以保证饭后血糖的相对稳定，避免造成大幅度的波动引起血糖过高和过低的现象，有益于高血压、糖尿病和肥胖患者病情调控[8-9]；抗性淀粉（RS）作为一种新型的膳食纤维功能性成分，具有降低血糖指数、改善结肠微生物群落的潜力[10]。因此，降低快消化淀粉含量、提高慢消化淀粉含量的研究对人体健康有重要意义。青稞淀粉约占青稞籽粒干质量的70%左右[11]，而快消化淀粉占青稞淀粉的75.17%、慢消化淀粉占青稞淀粉的12.32%、抗性淀粉占青稞淀粉的12.51%。可通过改性而改变淀粉的分子结构、功能性、消化性等，制备成为青稞改性淀粉，从而扩大青稞淀粉的应用[12]。改变淀粉结构的方法有物理法、化学法、酶法、加工处理（如常压、高压蒸煮）等[13]。其中酶法具有效率高、能耗低、污染小等特点[14]。安攀宇[15]使用α-淀粉酶、β-淀粉酶、普鲁兰酶制备青稞慢消化淀粉，发现当普鲁兰酶添加量为200 U时慢消化淀粉含量达到最高值；张倩倩[11]利用酶解法制备青稞慢性消化淀粉并进行工艺优化研究，发现普鲁兰酶的添加量200 U，酶解时间10 h，冷藏回生时间1 d，淀粉含量为15%时，慢消化淀粉含量为32.72%。GURAYA H S等[16]利用普鲁兰酶处理大米淀粉，结果显示慢消化淀粉的含量增加。
本试验以青稞为原料，通过普鲁兰酶协同α-葡萄糖苷酶降低青稞快消化淀粉（RDS）含量。考察酶添加量、料液比、酶解时间和温度对青稞快消化淀粉含量的影响，在单因素试验基础上，以快消化淀粉含量为响应值，选择3因素3水平的响应面试验探究最优酶解工艺参数，以期拓展青稞在食品上的应用，推进高原健康食品的发展，对糖尿病患者及需低糖饮食人群有一定意义。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
萌芽黑青稞粉：青海汉和生物科技股份有限公司；普鲁兰酶（酶活力1 500 U/mL）、糖化酶（酶活力10万U/mL）：江苏锐阳生物科技有限公司；α-葡萄糖苷酶（酶活力70万U/mL）：上海吉至生化科技有限公司；猪胰α-淀粉酶（酶活力50 U/mg）：合肥博美生物科技有限责任公司；淀粉含量检测试剂盒（50T/48S）：北京索莱宝科技有限公司；其他试剂均为国产分析纯。
1.2 仪器与设备
LR10M 冷冻离心机、H/T16MM 台式高速离心机：湖南赫西仪器装备有限公司；THZ-82恒温振荡器：国华实业有限公司；UV-1780紫外可见分光光度计：岛津仪器（苏州）有限公司；Tissuelyser-96多样品组织研磨仪：上海净信实业发展有限公司；MULTISKAN Sky全波长酶标仪：北京平利洋经贸有限公司。
1.3 试验方法
1.3.1 改性青稞粉的制备
酶改性青稞粉的制备参照王晓燕等[17]的方法并稍作修改。称取6 g青稞粉溶于50 mL蒸馏水中并搅拌至无结块，加入1 mol/L pH 5.2的乙酸钠缓冲溶液（称取6.804 g乙酸钠蒸馏水溶解，后加入1.118 5 mL的乙酸，定容至50 mL）5 mL，加入一定量的普鲁兰酶和α-葡萄糖苷酶，然后立即放入温度为65 ℃、转速150 r/min的恒温振荡器中振荡2 h。反应结束后立即将锥形瓶放入沸水浴锅里灭酶10 min，冷却后将锥形瓶中的样品转移到300 mL离心管中再入50 mL洗涤液，放入离心机中5 000 r/min离心10 min，得到的固体用蒸馏水洗涤并再次离心，重复2次，结束后取出沉淀物于平皿中，然后放入60 ℃的鼓风干燥箱中烘干，采用多样品组织研磨仪，在50 Hz条件下研磨70 s，备用。
1.3.2 酶添加量的确定
普鲁兰酶添加量的确定：在酶解温度为65 ℃、料液比为1∶10（g∶mL）、酶解时间为2 h条件下，分别测定普鲁兰酶添加量分别为120 U/g、160 U/g、200 U/g、240 U/g、280 U/g时的快消化淀粉含量。
α-葡萄糖苷酶添加量的确定：选取最适普鲁兰酶添加量，在酶解温度为65 ℃、料液比为1∶10（g∶mL）、酶解时间为2 h条件下，分别测定葡萄糖苷酶添加量分别为20 U/g、50 U/g、80 U/g、110 U/g、140 U/g时的快消化淀粉含量。
1.3.3 酶解工艺优化单因素试验
在选出最佳双酶添加量基础上，以快消化淀粉含量为评价指标，分别考察酶解温度（45℃、55℃、65℃、75℃、85℃）、酶解时间（1 h、2 h、3 h、4 h、5 h）及料液比（1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25（g∶mL））对酶解效果的影响。
1.3.4 酶解工艺优化响应面试验
在单因素试验基础上，固定普鲁兰酶添加量为200 U/g，酶解温度为55 ℃，选取α-葡萄糖苷酶添加量（A）、料液比（B）以及酶解时间（C）3个因素为自变量，以快消化淀粉含量（Y）为响应值，采用3因素3水平中心组合设计，优化酶降解青稞快消化淀粉酶解工艺，响应面试验设计因素与水平见表1。
表1 响应面试验设计因素与水平
Table 1 Factors and levels of response surface experimental design
1.3.5 总淀粉含量的测定
采用淀粉含量检测试剂盒法测定总淀粉（total starch，TS）含量。以0.10mg/mL、0.05mg/mL、0.04mg/mL、0.03mg/mL、0.02 mg/mL、0.01 mg/mL葡萄糖标准溶液质量浓度（x）为横坐标，以波长620 nm处测定的吸光度值（y）为纵坐标，绘制葡萄糖标准曲线，得到标准曲线线性回归方程：y=12.192x+0.002，相关系数R2=0.999 2。总淀粉含量计算公式如下：
式中：TS为总淀粉含量，mg/g；X为测得的吸光度值对应标准曲线的葡萄糖含量，mg/mL；D为稀释倍数1 000；V为提取后总体积，mL；W为称取的改性青稞粉质量，g。1.11为换算系数。
1.3.6 快消化淀粉含量的测定
快消化淀粉含量体外模拟消化参考缪铭等[18]的方法，并稍作修改。称取酶改性青稞粉0.2 g，加入0.2 mol/L pH 5.2的乙酸钠缓冲溶液（称取6.804 g乙酸钠蒸馏水溶解，后加入1.118 5 mL的乙酸，定容至250 mL）15 mL，同时加入5颗玻璃珠，加入混酶液10 mL。立即放入37 ℃的恒温振荡锅中150 r/min分别反应0、20 min后，取出沸水浴灭酶10 min，放入冷水中冷却至常温。取体外模拟消化后的溶液2 mL于离心管中，放入离心机4 500 r/min离心15 min，取上清液100 μL，加入900 μL蒸馏水后，加2 mL 3,5-二硝基水杨酸（3,5-dinitrosalicylic acid，DNS），沸水浴反应5 min后，冷水循环冷却至室温后加入12 mL蒸馏水，混匀，使用紫外分光光度仪在波长540 nm处测定吸光度值，每个样品分别做3组平行，并设置空白对照组，取平均值，快消化淀粉含量计算公式如下：
式中：G20为样品酶解20 min时的葡萄糖含量，mg/g；G0为样品酶解0 min 时葡萄糖的含量，mg/g；0.9为还原糖（以葡萄糖计）换算成淀粉的换算系数；TS为总淀粉含量，mg/g。
式中：G为葡萄糖含量，mg/g；At为吸光度值；D为稀释倍数1 500；W为测定时称取的青稞粉质量，g。
1.3.7 改性青稞粉体外降血糖活性测定
（1）α-淀粉酶抑制率测定
参照梁宗瑶等[19]的方法，准备150 μL的样品液和0.5 mg/mL的α-淀粉酶液150 μL，混合均匀后于37 ℃孵育10 min，然后将250 μL的1%的可溶性淀粉溶液加入混合液中，并在37 ℃继续孵育10 min，加入500 μL的DNS停止反应，在沸水浴中反应5 min。冷却后取200 μL于96孔板中，使用酶标仪在波长540 nm处测定吸光度值，每个样品做3个平行，并设置空白对照，取平均值，α-淀粉酶抑制率计算公式如下：
式中：a为含有α-葡萄糖苷酶溶液和待测样品的测定吸光度值；b为不含α-葡萄糖苷酶溶液含有待测样品的测定吸光度值；c为含有α-葡萄糖苷酶溶液却不含待测样品的测定吸光度值。
（2）α-葡萄糖苷酶抑制率测定
参照赖晓桦等[20]的方法，称取0.05 g改性青稞粉，加入0.05 mol/L磷酸盐缓冲液（phosphate buffer solution，PBS）（pH 6.8）600 μL，滴加300 μL 20 mmol/L的对硝基苯-α-D-吡咯葡萄糖苷（p-nitrophenyl α-D-glucopyranoside，pNPG）溶液；并在37 ℃振荡水浴锅中反应20 min，后滴加0.2 U/mL的α-葡萄糖苷酶溶液200 μL，室温反应10 min后，加入反应终止液0.1 mol/L Na2CO3 1.65 mL，并在3 000 r/min的转速条件下离心10 min，吸取200 μL上清液于96孔板中，用酶标仪于波长405 nm处测定其吸光度值。本试验中的空白对照为pH 6.8、0.05 mol/L PBS溶液。α-葡萄糖苷酶抑制率计算公式如下[18]：
式中：a为含有α-葡萄糖苷酶溶液和待测样品的测定吸光度值；b为不含α-葡萄糖苷酶溶液含待测样品的测定吸光度值；c为含有α-葡萄糖苷酶溶液不含样品的测定吸光度值；d为不含α-葡萄糖苷酶溶液和待测样品的测定吸光度值。
2 结果与分析
2.1 普鲁兰酶添加量的确定
由图1可知，当普鲁兰酶添加量在120～200 U/g时，快消化淀粉含量随着普鲁兰添加量的增大而下降；当普鲁兰酶添加量在200 U/g时，快消化淀粉含量最低，为57.14%；当普鲁兰酶添加量＞200 U/g之后，快消化淀粉含量有所上升。酶解产物积累至一定程度会反向抑制酶解，随着添加量的增加，快消化淀粉含量逐渐增加，增加趋势较大。普鲁兰酶酶解会增加直链淀粉含量[21]，直链淀粉比例与抗性淀粉含量呈正相关[22-24]，从而造成快消化淀粉含量减少。综上，确定最适的普鲁兰酶添加量为200 U/g。
图1 普鲁兰酶添加量对青稞快消化淀粉含量的影响
Fig.1 Effect of pullulanase addition on rapid digestible starch contents of highland barley
2.2 α-葡萄糖苷酶添加量的确定
由图2可知，在α-葡萄糖苷酶添加量为20～80 U/g时，随着α-葡萄糖苷酶添加量的增加，快消化淀粉的含量减少；当普鲁兰酶添加量在80 U/g时，快消化淀粉含量最低，为57.01%；当普鲁兰酶添加量＞80 U/g之后，快消化含量有所上升。因为α-葡萄糖苷酶可将游离的葡萄糖基转移到其他底物上，并形成α-1,6-糖苷键，得到非发酵性的低聚异麦芽糖或糖酯、糖肽等[25]。因此，最佳α-葡萄糖苷酶的添加量为80 U/g。
图2 α-葡萄糖苷酶添加量对青稞快消化淀粉含量的影响
Fig.2 Effect of α-glucosidase addition on rapid digestible starch contents of highland barley
2.3 酶解工艺优化单因素试验结果
2.3.1 料液比对青稞快消化淀粉含量的影响
由图3可知，当料液比为1∶5～1∶15（g：mL）时，快消化淀粉含量随之减少；当料液比为1∶15（g∶mL）时，快消化淀粉含量最低，为60.21%；当料液比为1∶15～1∶25（g∶mL）时，随着料液比的减小，酶解效果减弱。可能是因为料液比过小时，导致溶液中的酶浓度降低，酶与淀粉的接触机率减少；当料液比较大时，酶与淀粉之间的流动性较低，不易酶解，快消化淀粉含量降低较少[26]。因此，确定最佳酶解料液比为1∶15（g∶mL）。
图3 料液比对青稞快消化淀粉含量的影响
Fig.3 Effect of solid and liquid ratio on rapid digestible starch contents of highland barley
2.3.2 酶解温度对青稞快消化淀粉含量的影响
由图4可知，快消化淀粉的含量随着酶解温度在45～85 ℃内的升高呈现先降低后增加的趋势。当酶解温度为45～55 ℃时，快消化淀粉含量随之减少；当酶解温度达到55 ℃时，青稞快消化淀粉的含量最低，为59.09%。当酶解温度高于55 ℃之后，随着酶解温度升高，快消化淀粉含量升高，可能是因为温度过高导致了淀粉的降解造成[27]。因此，确定最佳酶解温度为55 ℃。
图4 酶解温度对青稞快消化淀粉含量的影响
Fig.4 Effect of enzymolysis temperature on rapid digestible starch contents of highland barley
2.3.3 酶解时间对青稞快消化淀粉含量的影响
由图5可知，当酶解时间为1～3 h时，青稞快消化淀粉的含量逐渐降低；当酶解时间为3 h时，快消化淀粉含量最低，为56.39%；当酶解时间＞3 h之后，青稞快消化淀粉含量逐渐升高。可能是因为酶解时间过长，支链淀粉含量减少，后期快消化淀粉酶解的速度大于慢消化淀粉，导致快消化淀粉的含量增加[28]。因此，确定最佳酶解时间为3 h。
图5 酶解时间对青稞快消化淀粉含量的影响
Fig.5 Effect of enzymolysis time on rapid digestible starch contents of highland barley
2.4 响应面试验结果
基于单因素试验结果，以α-葡萄糖苷酶添加量（A）、料液比（B）、酶解时间（C）为自变量，以快消化淀粉含量（Y）为响应值，采用Box-Behnken模型设计出包括17个试验点的试验方案，响应面试验方案及结果见表2。
表2 响应面试验设计及结果
Table 2 Design and results of response surface experiments
续表
2.4.1 回归模型的建立与显著性分析
对表2数据用Design-Expert 8.0.6软件进行回归拟合得到回归模型方程如下：
对上述回归模型进行显著性检验，方差分析结果见表3。由表3可知，该模型F值等于26.55，且P值＜0.000 1，表明拟合模型具有显著性。失拟项是模型数据变异的体现，失拟项P值=0.791 3＞0.05，不显著，说明该回归方程无失拟因素，试验结果的拟合度是比较好的[28]。变异系数（coefficient of variation，CV）表示试验的精确度，CV越大越不可靠，本试验中CV值（2.17%）较小，结果可靠。模型的决定系数R2为0.972 5，调整决定系数R2Adj为0.935 0，说明该模型可以解释大概94%响应值的变化。由P值可知，该模型的二次项A2、B2、C 2对青稞快消化淀粉含量影响极显著（P＜0.01），一次项B、交互项AB、BC对青稞快消化淀粉含量影响显著（P＜0.05），一次项A、C和交互项AC对青稞快消化淀粉含量影响不显著（P＞0.05）。由F值可知，影响青稞快消化淀粉含量因素顺序为B（料液比）＞A（α-葡萄糖苷酶添加量）＞C（酶解时间）。
表3 回归模型方差分析
Table 3 Variance analysis of regression model
注：“*”表示对结果影响显著（P＜0.05）；“**”表示对结果影响极显著（P＜0.01）。
2.4.2 响应面试验结果分析
由图6可知，α-葡萄糖苷酶添加量和料液比、料液比和酶解时间对青稞快消化淀粉含量有显著影响（P＜0.05），α-葡萄糖苷酶添加量和酶解时间对青稞快消化淀粉含量影响不显著（P＞0.05），这与表3的方差分析结果一致。
图6 各因素间交互作用对青稞快消化淀粉含量影响的响应面及等高线
Fig.6 Response surface plots and contour lines of effects of interaction between various factors on rapid digestible starch contents of highland barley
2.4.3 验证试验
由Design-Expert 8.0.6软件分析后，得到最优酶解工艺条件为：α-葡萄糖苷酶添加量80.3 U/g、料液比为1∶15（g∶mL）、酶解时间为2.9 h。在此优化条件下，青稞快消化淀粉含量预测值为57.85%。为了便于实际操作，将最优酶解工艺条件修正为：α-葡萄糖苷酶添加量80 U/g、料液比1∶15（g∶mL）、酶解时间3.0 h。在此优化条件下进行3次平行验证试验，青稞快消化淀粉含量实际值为54.95%，与预测值差别不大。
2.5 改性青稞粉体外降血糖活性测定结果
淀粉等先在人体内被α-淀粉酶水解为麦芽糖等双糖，再被α-葡萄糖苷酶水解成葡萄糖、果糖等单糖，之后被小肠吸收，因此抑制α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的活性可以降低餐后血糖。由图7可知，改性青稞粉的α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的抑制率分别为90.94%和91.89%，比原粉分别增加了68.1%和50.4%，说明经过普鲁兰酶和α-葡萄糖苷酶双酶酶解后，青稞淀粉的体外降血糖活性得到了明显提高，可以为后期低血糖生成指数（glycemic index，GI）食品的研发提供理论基础。
图7 α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的抑制率
Fig.7 Inhibitory rate of α-amylase and α-glucosidase
3 结论
本试验研究普鲁兰酶协同α-葡萄糖苷酶降低青稞快消化淀粉含量的酶解工艺条件，在单因素试验的基础上，设计响应面试验分析优化α-葡萄糖苷酶添加量、料液比、酶解时间对快消化淀粉含量的影响。结果表明，普鲁兰酶协同α-葡萄糖苷酶降低青稞快消化淀粉含量的最佳酶解工艺条件为：普鲁兰酶添加量200 U/g、α-葡萄糖苷酶添加量80 U/g、料液比1∶15（g∶mL）、酶解时间3 h、酶解温度55 ℃。在此优化条件下，改性青稞粉快消化淀粉含量为54.95%，比未处理过的青稞粉中快消化淀粉含量（75.17%）降低了20.22%。体外降血糖活性测定结果表明，改性青稞粉的α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的抑制率分别为90.94%和91.89%，比原粉分别增加了68.1%和50.4%，说明经过双酶协同酶解后，青稞淀粉的体外降血糖活性得到了明显提高，为后期研发低GI青稞产品提供了一定的理论依据。
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