低聚木糖作为肠道益生菌的“优质粮食”，在选择性刺激肠道益生菌增殖的同时，特异性抑制肠道致病菌的生长，调整肠道微环境、增强宿主免疫力和健康水平，有助于国民大健康的实现[1-4]，因而低聚木糖高效制备对于大健康行业和农林废弃资源的高附加值利用至关重要。近年来，低聚木糖系列产品的开发和推广在饲料添加剂、食品添加剂、化妆品和医疗保健品等领域已初具规模。低聚木糖作为木聚糖高值化加工的主流产品，可通过化学、物理和生物酶法实现低聚木糖的高效制备。基于阿拉伯木聚糖的分子结构解析，其水解酶系主要涵括木聚糖酶、木糖苷酶、阿拉伯糖苷酶等，其中木聚糖酶和阿拉伯糖苷酶作为关键水解酶极为重要[5-7]。相比于同质木聚糖而言，阿拉伯木聚糖类异质杂多糖因受支链结构空间位阻的影响，木聚糖酶和阿拉伯糖苷酶间协同作用对于阿拉伯低聚木糖的高效制备极为重要[8-9]。YANG L等[10]研究表明，半乳甘露聚糖主链上的半乳糖支链取代度与甘露聚糖酶水解效率呈现负相关性，半乳糖苷酶可有效提升甘露聚糖酶酶水解效率。在阿拉伯木聚糖定向水解过程中，利用阿拉伯糖苷酶有选择去除阿拉伯木聚糖的支链结构，对于木聚糖酶水解效率和阿拉伯低聚木糖得率的提高意义深远[10-11]。
目前，生物酶的制备多采用产酶菌株筛选、底物特异性诱导和工程菌的可控改造等技术加以实现，其中以基因工程菌的可控改造技术研究最为广泛[12-14]。基因工程菌的构建多以大肠杆菌（Escherichia coli）和毕赤酵母（Pichia pastoris）为目的基因载体，但大肠杆菌或毕赤酵母次级代谢产物的生物安全性和基因工程菌的传代稳定性，是限制其在食品工业大规模应用的限制因素[15-18]。里氏木霉（Trichoderma reesei）作为合成木聚糖水解酶系的主要菌株，利用底物诱导可实现木聚糖水解酶的高效制备，因而，诱导底物的筛选成为实现阿拉伯糖苷酶和木聚糖酶协同制备的关键[19-22]。车前草作为中草药资源在我国应用历史悠远，车前子壳为大粒车前草或平车前草的成熟种皮，细胞壁包含10%～30%亲水性阿拉伯木聚糖，具有杀菌消炎、调节免疫和改善便秘等生理活性。研究表明，车前子壳中包含62.5%的阿拉伯木聚糖，其化学结构为β-1,4-糖苷键形成的木聚糖主链，在其主链上随机进行阿拉伯糖（arabinose，Ara）或木糖（xylopyranose，Xyl）取代，阿拉伯糖与木糖的摩尔比为0.41∶1.00[11]。因此，本研究以车前子壳作为诱导底物，利用单因素试验和响应面试验系统优化里氏木霉（Trichoderma reesei）液态发酵条件，以期实现阿拉伯糖苷酶和木聚糖酶的协同制备，为阿拉伯木聚糖资源的高效生物炼制奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
1.1.1 菌株和材料
里氏木霉（Trichoderma reesei）NL03：南京林业大学生物化工研究所；车前子壳：广州福芯堂生物科技有限公司，机械粉碎后，过100目筛，其中阿拉伯木聚糖含量为（62.58±0.29）%，水分含量为（7.37±0.27）%。
1.1.2 化学试剂
玉米芯木聚糖（碱法提取木聚糖，含水量（10.47±0.19）%）：江苏康维生物科技有限公司；微晶纤维素（平均聚合度为117，粒度50 μm，含水量（5.47±0.21）%）：美国Sigma公司；硫酸铵、尿素、磷酸二氢钾、无水硫酸镁、无水氯化钙、3,5-二硝基水杨酸（3,5-dinitrosalicylic acid，DNS）、氢氧化钠、酒石酸钾钠、偏重亚硫酸钠、柠檬酸、木糖、葡萄糖、苯酚、对硝基苯酚、磷酸二氢钠、碳酸钠、大豆蛋白胨：上海麦克林生化科技有限公司；对硝基苯基-α-L-阿拉伯呋喃糖苷（p-nitrophenyl-α-L-arabinofuranosid，pNPA）：上海源叶生物科技有限公司。试验所用化学试剂均为分析纯或生化试剂。
1.1.3 培养基
产酶培养基：车前子壳10.00 g、葡萄糖1.00 g、磷酸二氢钾20.00 g、尿素3.00 g、无水硫酸镁1.50 g、硫酸铵14.00 g、氯化钙4.00 g、FeSO4·7H2O 5.00 mg、MnSO4·7H2O 1.60 mg、ZnSO4·7H2O 1.40 mg、CoCl2 2.00 mg，充分溶解于蒸馏水后，加入1 mol/L柠檬酸缓冲液50 mL，蒸馏水定容至1 000 mL。121 ℃高压蒸汽灭菌15 min。
1.2 仪器与设备
TU-1950紫外-可见分光光度计：北京普析通用仪器有限责任公司；SHA-A恒温振荡水浴锅：上海精密仪器仪表有限公司；Direct-QTM5超纯水系统：美国密理博公司；AEL-200电子分析天平：日本岛津公司；Allegra X-64R台式高速冷冻离心机：美国贝克曼公司；THZ-300C恒温培养摇床：上海一恒科学仪器有限公司；SW-CJ-2D超净工作台：苏州净化设备有限公司。
1.3 实验方法
1.3.1 产酶发酵液的制备
在产酶培养基的基础上，将里氏木霉孢子悬浮液（孢子数量为2.0×107 CFU/mL）按10%（V/V）的接种量加入产酶培养基中，于170 r/min摇床中培养，产酶温度第1天设定为30 ℃，第2天将温度调整至28 ℃，培养时间为5.0 d，得到产酶发酵液。
1.3.2 产酶条件优化单因素试验
采用单因素试验依次探讨诱导物种类（车前子壳、玉米芯木聚糖、微晶纤维素、半乳甘露聚糖、葡甘露聚糖），初始pH值（1.0、3.0、5.0、7.0、9.0），培养时间（1.0 d、2.0 d、3.0 d、4.0 d、5.0 d），底物质量浓度（以车前子壳绝干质量计）（5 g/L、10 g/L、15 g/L、20 g/L、25 g/L）和碳氮比（0.7∶1.0、1.0∶1.0、1.3∶1.0、1.6∶1.0、1.9∶1.0）对木聚糖酶和阿拉伯糖苷酶产酶效果的影响。每个单因素条件设置3个重复，将产酶发酵液于-4 ℃条件下5 000 r/min离心30 min，收集上清液测定木聚糖酶和阿拉伯糖苷酶酶活。
1.3.3 产酶条件优化响应面试验
在单因素试验结果的基础上，选取碳氮比（A）、培养时间（B）和底物质量浓度（C）三个主要影响因素，以木聚糖酶活力（Y1）和阿拉伯糖苷酶活力（Y2）为响应值，根据Design-Expert 8.0.7软件中Box-Behnken试验设计原理进行3因素3水平响应面试验，Box-Behnken试验设计因素与水平见表1，共设计17个组合，包括5个中心试验组和12个非中心试验组。
表1 响应面试验设计因素与水平
Table 1 Factors and levels of Box-Behnken experiments design
1.3.4 分析方法
（1）木聚糖酶活力的测定
0.9mL的1.0%桦木木聚糖底物溶液，50 ℃预热5 min，加入0.1 mL适当稀释的产酶上清液，于50 ℃条件下反应30 min，立即加入3.0 mL DNS试剂终止反应，随后沸水浴中处理5 min，冷却后定容至25 mL，充分摇匀，于波长550 nm处测定反应混合物的吸光度值，并根据吸光度值与还原糖的相关关系，计算反应生成的还原糖含量。
木聚糖酶酶活定义：在上述反应条件下，每分钟水解底物产生1 μmol木糖所需木聚糖酶的酶量为一个酶活单位（IU/mL）[23]。
（2）阿拉伯糖苷酶活力的测定
0.1mL适当稀释的产酶上清液和0.9 mL 1 mmol/L pNPA溶液于50 ℃保温10 min，立即加入2.0 mL 1 mol/L的Na2CO3溶液终止反应，加入10 mL蒸馏水，充分摇匀，于波长400 nm处测定反应混合物的吸光度值，并依据吸光度值与对硝基苯酚的线性相关关系，计算反应生成的对硝基苯酚的含量。
阿拉伯糖苷酶酶活定义：在上述反应条件下，每分钟水解pNPA释放1 μmol对硝基苯酚所需阿拉伯糖苷酶的酶量为一个酶活单位（IU/mL）[24]。
1.3.5 数据处理及统计分析
所有数据均重复测定3次，采用Design-Expert 8.0.7软件分析响应面试验。采用SPSS19.0数据统计软件对数据进行统计分析，结果表示为“平均值±标准差”（X±S）。
2 结果与分析
2.1 产酶培养条件优化单因素试验结果
2.1.1 产酶培养基诱导碳源的确定
以里氏木霉为产酶菌种，分别研究以玉米芯木聚糖、微晶纤维素、车前子壳、半乳甘露聚糖和葡甘露聚糖（添加量为10 g/L）为诱导碳源，对木聚糖酶和阿拉伯糖苷酶合成效能的影响，结果见图1。由图1可知，以微晶纤维素（水不溶性）、半乳甘露聚糖（水溶性）和葡甘露聚糖（水溶性）为诱导底物时，里氏木霉分泌阿拉伯糖苷酶的能力较弱，仅分别为（0.11±0.01）IU/mL、（0.11±0.02）IU/mL和（0.10±0.01）IU/mL。里氏木霉所分泌的阿拉伯糖苷酶为诱导酶，只有在以包含阿拉伯糖支链的木聚糖存在时，才可诱导阿拉伯糖苷酶的合成[25]。以玉米芯木聚糖（水不溶性）为产酶诱导底物时，产酶发酵液中木聚糖酶和阿拉伯糖苷酶活力分别为（3.18±0.23）IU/mL和（0.48±0.03）IU/mL。张晓娜等[26]研究表明，在玉米芯木聚糖主链上有不同程度的阿拉伯糖残基取代，经碱液提取所得木聚糖包含少量的阿拉伯糖支链，这也是玉米芯木聚糖可以诱导里氏木霉分泌阿拉伯糖苷酶的原因。以车前子壳（部分水溶性）为诱导底物时，发酵液中木聚糖酶和阿拉伯糖苷酶活力最高，分别为（4.47±0.11）IU/mL和（1.47±0.06）IU/mL。因此，选择车前子壳作为最适诱导碳源。
图1 不同碳源对木聚糖酶和阿拉伯糖苷酶活力的影响
Fig.1 Effect of different carbon sources on the xylanase and arabinosidase activities
2.1.2 产酶培养基初始pH值的确定
培养基初始pH值可通过改变微生物细胞膜表面电荷和膜的通透性阻碍微生物对营养物质的吸收，影响菌体生物量和产酶效力[27]。此外，发酵液pH值如超出生物酶的最适pH范围，将会导致酶蛋白的结构稳定性和酶活力降低。不同产酶培养基初始pH值对里氏木霉诱导木聚糖酶和阿拉伯糖苷酶合成的影响见图2。由图2可知，当初始pH值为5.0时，里氏木霉培养液中木聚糖酶活力和阿拉伯糖苷酶活力均达到最高值，分别为（4.4±0.11）IU/mL和（1.47±0.06）IU/mL。当发酵液初始pH值处于强酸性条件下（pH=1.0），发酵液中木聚糖酶活力降低较多，仅为（0.96±0.05）IU/mL，而培养基初始pH值在5.0～9.0条件下，木聚糖酶活力分别为（4.47±0.11）IU/mL、（4.18±0.05）IU/mL和（3.31±0.11）IU/mL。结果表明，里氏木霉源木聚糖酶在弱酸和弱碱性环境均体现良好的稳定性。当产酶培养基初始pH值为5.0和7.0时，产酶液中阿拉伯糖苷酶活力均为（1.47±0.06）IU/mL，阿拉伯糖苷酶活力均高于其他初始pH值组。因此，最适培养基初始pH值为5.0。
图2 不同初始pH值对木聚糖酶和阿拉伯糖苷酶活力的影响
Fig.2 Effect of different initial pH on the xylanase and arabinosidase activities
2.1.3 培养时间的确定
产酶发酵的初始阶段主要为里氏木霉利用培养基中葡萄糖完成自身生物量的增长，随着葡萄糖消耗殆尽，里氏木霉为满足自身生长的需要，逐渐分泌车前子壳多糖相关水解酶，实现车前子壳多糖的降解，为里氏木霉提供可直接代谢的碳源物质。培养时间在2～4 d内，里氏木霉分泌的车前子壳多糖水解酶会逐渐积累，但是培养时间过长导致培养环境的恶化，会导致酶蛋白的失活，最终呈现酶活力下降的现象。里氏木霉以10 g/L车前子壳为诱导底物，培养基初始pH值为5.0下，探究培养时间对木聚糖酶和阿拉伯糖酶合成情况的影响，结果见图3。由图3可知，随着培养时间的延长，培养基中木聚糖酶活力均呈现先上升后下降的趋势。当培养时间为4～5 d时，木聚糖酶活力由（4.47±0.11）IU/mL降低至（3.70±0.08）IU/mL；而阿拉伯糖苷酶活力由（1.47±0.06）IU/mL稍微提升至（1.50±0.05）IU/mL，增加幅度较小。因此，最适培养时间为4 d。
图3 不同的培养时间对木聚糖酶和阿拉伯糖苷酶活力的影响
Fig.3 Effect of different culture time on the xylanase and arabinosidase activities
2.1.4 产酶培养基中底物浓度的确定
车前子壳经水浸泡展现出较大的黏度，因而车前子壳浓度对于里氏木酶发酵产酶的影响是不可忽略的因素。车前子壳浓度较高，导致整个产酶体系黏度较大，影响传质效率和溶解氧指数，从而限制菌体增殖和生物酶合成。车前子壳质量浓度对木聚糖酶和阿拉伯糖苷酶合成的影响见图4。由图4可知，随着底物质量浓度的增加，产酶上清液中木聚糖酶和阿拉伯糖苷酶活力大体呈现出逐渐增加的趋势。当车前子壳质量浓度由10 g/L增加至25 g/L时，木聚糖酶活力由（4.47±0.11）IU/mL增加至（5.16±0.38）IU/mL，木聚糖酶活力的增加幅度较小。当车前子壳质量浓度为10 g/L、15 g/L和20 g/L时，阿拉伯糖苷酶活力分别为（1.47±0.06）IU/mL、（3.67±0.08）IU/mL和（5.16±0.38）IU/mL。当车前子壳质量浓度为25 g/L时，产酶发酵液中木聚糖酶和阿拉伯糖苷酶活力分别为（5.16±0.38）IU/mL和（5.55±0.22）IU/mL，相较于车前子壳质量浓度为20 g/L无明显提升。因此，最适车前子壳质量浓度为20 g/L。
图4 不同底物质量浓度对木聚糖酶和阿拉伯糖苷酶活力的影响
Fig.4 Effect of different substrate mass concentration on the xylanase and arabinosidase activities
2.1.5 产酶培养基中碳氮比的优化
以车前子壳为诱导底物，硫酸铵和尿素按照初始培养基中的比例组成混合碳源，并将碳氮比分别设定为0.7∶1.0、1.0∶1.0、1.3∶1.0、1.6∶1.0和1.9∶1.0，配制成产酶培养基，在170 r/min条件下培养4 d，研究碳氮比对里氏木霉分泌木聚糖酶和阿拉伯糖苷酶能力的影响，结果见图5。由图5可知，随着碳氮比的增加，培养基中氮源物质的质量浓度由46.63 g/L降低至17.17 g/L，产酶液中木聚糖酶和阿拉伯糖苷酶活力逐渐增加。当碳氮比为0.7∶1.0时，产酶培养基灭菌后呈现固体凝胶状态，里氏木霉无法在该培养基上生长并产酶，因而未能在产酶培养基中检测到酶活。当碳氮比由1.0∶1.0增加至1.6∶1.0时，产酶液中木聚糖酶活力和阿拉伯糖苷酶活力分别由（4.93±0.14）IU/mL和（4.14±0.07）IU/mL增加至（10.59±0.33）IU/mL和（8.99±0.05）IU/mL。碳氮比进一步由1.6∶1.0增加至1.9∶1.0，产酶液中木聚糖酶活力和阿拉伯糖苷酶活力增长幅度较少。结果表明，碳氮比较低时，里氏木霉因氮源浓度过高导致生物量激增和碳源消耗过快，不利于生物酶的合成。因此，最适碳氮比为1.6∶1.0。
图5 不同的碳氮比对木聚糖酶和阿拉伯糖苷酶活力的影响
Fig.5 Effect of different carbon and nitrogen ratio on the xylanase and arabinosidase activities
2.2 产酶条件优化的响应面试验结果
在单因素试验结果的基础上，分别选取碳氮比（A）、培养时间（B）和底物质量浓度（C）三个自变量，以木聚糖酶活力（Y1）和阿拉伯糖苷酶活力（Y2）为响应值，应用Design Expert 8.0.7对产酶条件进行响应面试验，Box-Behnken试验设计及结果见表2，方差分析见表3。由表3可知，一次项A对木聚糖酶活力的影响显著（P＜0.05），二次项A2、B2、C2对木聚糖酶活力的影响极显著（P＜0.01），其他项均不显著（P＞0.05）。二次项A2、B2对阿拉伯糖苷酶活力的影响显著（P＜0.05），二次项C2对阿拉伯糖苷酶活力的影响极显著（P＜0.01），其他项均不显著（P＞0.05）。另外，对表2结果进行二元多项式回归拟合分析，得到多元拟合方程，Y1=11.41+0.30A-0.020B+0.22C+0.15AB+0.17AC+0.19BC-2.90A2-2.86B2-3.16C 2，模型P值＜0.000 1，该拟合模型达到极显著水平（P＜0.01），决定系数R2=0.993 8，调整决定系数R2adj=0.985 8，表明拟合方程与测定值拟合度较好，模型设计合理；由F值可知，各因素对木聚糖酶活力的影响顺序为：碳氮比（A）＞底物质量浓度（C）＞培养时间（B）。Y2=10.79+0.40A+0.11B+0.49C+0.19AB+0.61AC+0.40BC-1.06A2-1.10B2-1.70C 2，模型P值为0.014 1，该拟合模型达到显著水平（P＜0.05），决定系数R2=0.884 3，调整决定系数R2adj=0.735 5，表明模型拟合度良好。由F值可知，各因素对阿拉伯糖苷酶活力的影响顺序为：底物质量浓度（C）＞碳氮比（A）＞培养时间（B）。
表2 Box-Behnken试验设计及结果
Table 2 Design and results of Box-Behnken experiments
表3 回归模型方差分析
Table 3 Analysis of variance of regression model
注：“**”表示对结果影响极显著（P＜0.01），“*”表示对结果影响显著（P＜0.05）。
经模型预测，当碳氮比（A）为1.62∶1.0、培养时间（B）为4.0 d和底物质量浓度（C）为20.40 g/L时，木聚糖酶活力和阿拉伯糖苷酶活力预测值分别为11.40 IU/mL、10.87 IU/mL。
为了便于实际操作，将最优产酶条件修正为：初始pH值5.0、底物质量浓度20 g/L、培养时间4.0 d、碳氮比1.6∶1.0。在此最优产酶条件下进行3次平行验证试验，结果显示，木聚糖酶、阿拉伯糖苷酶活力平均实际值分别为（11.42±0.15）IU/mL、（10.83±0.08）IU/mL。上述结果与模型预测值基本一致，因此证实该模型可精准预测里氏木霉利用车前子壳的实际木聚糖酶和阿拉伯糖苷酶的合成情况。
3 结论
本研究里氏木霉以车前子壳为诱导碳源，以单因素试验和响应面试验对产酶条件进行优化，以期确定木聚糖酶和阿拉伯糖苷酶的最佳诱导条件。确定最佳产酶条件：以车前子壳为碳源，初始pH 5.0、培养时间4.0 d、底物质量浓度20 g/L、碳氮比1.6∶1.0，在此优化条件下，木聚糖酶和阿拉伯糖苷酶的活力可达最大值，分别为（11.42±0.15）IU/mL和（10.83±0.08）IU/mL，是优化前的2.55倍和7.37倍。该研究可为车前子源阿拉伯低聚木糖的定向酶水解制备奠定酶学基础。
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