金丝枣（Ziziphus jujube），属于鼠李科枣属植物，成熟后变红色，有“天然维生素”的美誉，除生食外，还可煮食、熬汤或作为炖品之配料，还可制成脆枣、蜜枣、枣茶等。近年来，沧州市金丝枣产量达800万kg。金丝枣营养丰富，维生素C含量约为苹果的70倍[1]，干果中含糖量高达70%～80%，富含芦丁、膳食纤维、三萜酸、黄酮和酚酸等[2-4]，有养胃健脾、抗衰老、抗肿瘤、软化血管降低血压，防治高血压的功效[5]。柠檬（Citrus limon）为双子叶植物纲芸香科柑橘属植物，我国的柠檬产量排名世界第一，占世界柑橘产业的9%。柠檬果实中富含芳香挥发成分和苹果酸、琥珀酸、钙、磷、柠檬苦素、维生素C和维生素P等物质[6]，具有生津解暑、开胃健脾、预防和治疗高血压和心肌梗塞等功效[7]。柠檬味酸、微苦，生吃鲜食较少，多加工成柠檬片、柠檬蜜饯、柠檬茶[8]、柠檬汁[9-10]等食用。
果醋是由水果汁（浆）经酒精发酵、醋酸发酵制得的酸性饮品，既保留了水果中的大部分维生素、植物多酚等生物活性成分，也获得了微生物发酵产生的有机酸等成分，因而形成了其独特的营养和风味，备受消费者青睐[11]。国内外利用果蔬等原料发酵果醋的相关研究越来越多，苏伟等[12]以摇瓶发酵法制备的苹果醋与酶解法制备的枣汁进行调配制成金丝枣苹果醋复合饮料，确定了其最佳配方。郭梦瑶等[13]从柿子醋醋醅中分离木醋杆菌（Acetobacter xylinum）并应用于冬枣醋的研制，确定了最佳醋酸发酵条件。郭静婕[6]研究不同发酵条件对香蕉柠檬复合果醋产酸量的影响，确定了香蕉柠檬复合果醋最适发酵工艺条件。将金丝枣和柠檬制成复合果醋，不仅克服了单一原料发酵果醋的风味、色泽的缺陷，起到风味互补的作用，还发挥两者维生素C含量均较高的营养特色。
本研究以金丝枣和柠檬为主要原料制备金丝枣柠檬复合果醋，采用单因素试验及正交试验分别探究了金丝枣、柠檬的酶解工艺条件，金丝枣和柠檬果汁的体积比以及酒精发酵和醋酸发酵的工艺条件，以期为红枣和柠檬精深加工提供有益的参考，为红枣柠檬复合果醋产品研发及产业化发展提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
1.1.1 原料与菌株
金丝枣：市售；柠檬：广东中兴绿丰发展有限公司；葡萄酒果酒专用酵母SY[1]：安琪酵母股份有限公司；醋酸菌干粉[14]：烟台帝伯仕酵母有限公司。
1.1.2 试剂
果胶酶（酶活为10 000 U）：上海万康生物科技有限公司；氢氧化钠、抗坏血酸、磷酸盐缓冲液、酒石酸钾钠、碳酸氢钠、次甲基蓝、五水硫酸铜（均为分析纯）：上海源叶生物科技有限公司。
1.2 仪器与设备
DHP-9012型电热恒温培养箱、HG-9620A电热鼓风干燥箱、THZ-103B恒温培养摇床、HWS12型电热恒温水浴锅：上海一恒科学仪器有限公司；WK2102型电磁炉、MJ-BL25B2搅拌机：广东美的生活电器制造有限公司；ST2200ZH-B型pH计：奥豪斯仪器（上海）有限公司；JJ3000型电子天平：广州市正一科技有限公司；722可见分光光度计：上海佑科仪器仪表有限公司；LDZX-30FBS立式蒸汽灭菌锅：上海申安医疗器械厂。
1.3 试验方法
1.3.1 金丝枣柠檬复合果醋制备工艺流程及操作要点
操作要点：
金丝枣汁的制备：金丝枣干果经去核后进行复水处理，按料液比1∶8（g∶mL）加水浸泡10 h[15]，沥干水分，以料液比1∶4（g∶mL）加水并加热煮沸15 min至果肉软烂，冷却至室温打浆1 min[16]。添加0.03%的果胶酶，45 ℃酶解时间2 h，酶解后，85 ℃水浴10 min灭酶[5]，4层纱布过滤，获得滤液，即得金丝枣汁。
柠檬汁的制备：柠檬鲜果用清水洗净，100 ℃热烫30～60 s去除杂菌，洗净去皮去核，破碎榨汁，添加0.025%的果胶酶，45 ℃酶解4 h，酶解后，85 ℃水浴10 min灭酶[5]，4层纱布过滤，获得滤液，即得柠檬汁。
混合、调配：将金丝枣汁与柠檬汁以体积比5∶5进行混合，使调配果汁酸甜适宜、口味协调。
酒精发酵：称取安琪果酒酵母0.02 g，加入至100 mL混合果汁中，于40 ℃水浴活化30 min后接种至混合果汁中，在28 ℃静置发酵6 d[17]，发酵至酒精度不再上升，即得复合果酒发酵液（酒精度为6%vol）。
醋酸发酵：称取0.04%的醋酸菌干粉，直接加入复合果酒发酵液中混匀后，置于摇床32 ℃，150 r/min发酵7 d，发酵液酸度不再上升即为终点，发酵结束后总酸含量为21.71g/L。
过滤、灭菌、澄清、罐装：醋酸发酵液用纱布过滤，所得滤液于80 ℃水浴25 min灭菌[18]，经自然澄清、罐装即可得金丝枣柠檬复合果醋成品。
1.3.2 酶解工艺优化
（1）金丝枣酶解工艺优化
单因素试验：分别考察果胶酶添加量（0.01%、0.02%、0.03%、0.04%、0.05%、0.06%）、酶解时间（1 h、2 h、3 h、4 h、5 h、6 h）、酶解温度（30 ℃、35 ℃、40 ℃、45 ℃、50 ℃、55 ℃）和酶解pH值（2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0）对金丝枣出汁率的影响。
正交试验：在单因素试验的基础上，以金丝枣出汁率为考察指标，以果胶酶添加量（A）、酶解时间（B）、酶解温度（C）和酶解pH值（D）为影响因素，设计L9（34）正交试验，确定金丝枣酶解条件的最佳工艺参数。
（2）柠檬汁酶解工艺优化
单因素试验：分别考察果胶酶添加量（0.010%、0.015%、0.020%、0.025%、0.030%、0.035%）、酶解时间（1 h、2 h、3 h、4 h、5 h、6 h）、酶解温度（30 ℃、35 ℃、40 ℃、45 ℃、50 ℃、55 ℃）和酶解pH值（2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0）对柠檬出汁率的影响。
正交试验：在单因素试验的基础上，以果胶酶添加量（A）、酶解时间（B）、酶解温度（C）和酶解pH值（D）作为影响因素，以柠檬汁出汁率为评价指标，设计L9（34）正交试验，确定柠檬酶解条件的最佳工艺参数。
1.3.3 金丝枣汁与柠檬汁体积比的确定
将制得的金丝枣汁与柠檬汁按照体积比1∶9、2∶8、3∶7、4∶6、5∶5、6∶4、7∶3、8∶2、9∶1进行混合，并根据感官评分标准进行感官评价，确定金丝枣汁与柠檬汁体积比对混合果汁感官评分的影响。
1.3.4 酒精发酵工艺条件优化
单因素试验：以残糖含量、酒精度为考察指标，固定培养条件为28 ℃静置培养6 d，分别考察初始糖度（14°Bx、16 °Bx、18 °Bx、20 °Bx、22 °Bx）、酵母菌接种量（0.01%、0.02%、0.03%、0.04%、0.05%）和初始pH值（3.5、4.0、4.5、5.0、5.5）对金丝枣柠檬复合果醋酒精发酵效果的影响。
正交试验：在单因素试验的基础上，以酒精度为考察指标，以初始糖度（A）、酵母菌接种量（B）、初始pH值（C）作为影响因素，设计L9（33）正交试验，探究金丝枣柠檬复合果醋酒精发酵最佳工艺条件。
1.3.5 醋酸发酵工艺优化
单因素试验：以感官评价为考察指标，依次考察初始pH值（2.5、3.0、3.5、4.0及4.5）、醋酸菌接种量（0.02%、0.04%、0.06%、0.08%、0.10%）和初始酒精度（5.0%vol、6.0%vol、7.0%vol、8.0%vol、9.0%vol）对金丝枣柠檬复合果醋醋酸发酵效果的影响。
正交试验：在单因素试验结果的基础上，以感官评价为考察指标，初始酒精度（A）、醋酸菌接种量（B）和初始pH值（C）为影响因素，设计L9（33）正交试验，考察3因素对金丝枣柠檬复合果醋醋酸发酵效果的影响。
1.3.6 测定方法
（1）理化指标的测定
酒精度的测定：参考GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》的酒精计法[19]；总糖的测定：采用直接滴定法[20]；总酸的测定：参照GB/T 12456—2021《食品安全国家标准食品中总酸的测定》的酸碱滴定法[21]；pH值的测定：采用pH计。
酶解后原料出汁率依据下式[22]进行计算：
式中：m1为酶解后所得果汁质量，g；m2为果胶酶添加量，g；m3为酶解前果浆质量，g。
（2）感官评价
金丝枣柠檬复合果汁的感官评价：参考李璐等[18]制定的评分标准结合金丝枣汁和柠檬汁的特点，制定金丝枣与柠檬复合果汁的感官评价标准见表1，请10名专业品评人员从色泽和外观、香气、滋味方面对金丝枣柠檬复合果汁进行感官评价。
表1 金丝枣柠檬复合果汁感官评分标准
Table 1 Sensory evaluation standard of golden-silk jujube and lemon compound juice
金丝枣柠檬复合果醋的感官评价：10名专业品评人员依据色泽、滋味和气味、组织状态、含杂质情况对金丝枣柠檬复合果醋进行感官评价[23-24]，满分为100分，感官评分标准见表2。
表2 金丝枣柠檬复合果醋感官评分标准
Table 2 Sensory evaluation standard of golden-silk jujube and lemon compound vinegar
1.3.7 数据处理
所有数据重复3次，数据均以“平均值±标准差”表示，使用SPSS 22.0进行数据分析，用Origin 9.0进行绘图。
2 结果与分析
2.1 金丝枣酶解工艺条件优化
2.1.1 金丝枣酶解工艺条件优化单因素试验结果
果胶酶分解果胶、瓦解植物细胞壁，有利于可溶性固形物的溶出[25]，酶解处理可显著提高金丝枣汁出汁率，减少金丝枣汁中抗坏血酸和总酚损失[26]，本试验探究了果胶酶添加量、酶解时间、酶解温度和酶解pH值对金丝枣出汁率的影响，结果见图1。
由图1A可知，果胶酶添加量在0.01%～0.03%范围内增加，金丝枣出汁率逐渐升高；当果胶酶添加量为0.03%时，金丝枣出汁率最高，为93.87%；当果胶酶添加量＞0.03%之后，金丝枣出汁率降低。因此，最适果胶酶添加量为0.03%。由图1B可知，当酶解时间在1～3 h范围内增加，金丝枣出汁率逐渐增加；当酶解时间为3 h时，金丝枣出汁率达到最大值，为93.34%；当酶解时间＞3 h之后，金丝枣出汁率逐渐降低。因此，最适酶解时间为3 h。由图1C可知，酶解温度在30～45 ℃范围内增加，金丝枣出汁率明显提高；当酶解温度为45 ℃时，金丝枣出汁率最高，为93.85%；酶解温度＞45 ℃之后，金丝枣出汁率则呈下降趋势，这是由于温度高于45 ℃，果胶酶活性降低，不利于底物转化[27]。因此，最适酶解温度为45 ℃。由图1D可知，当酶解pH值在2.5～4.0范围内增加，金丝枣出汁率明显提高；当酶解pH值为4.0时，金丝枣出汁率达到最大值，为93.32%；当酶解pH值＞4.0之后，金丝枣出汁率逐渐下降，原因可能是pH过低或过高会破坏果胶酶的结构和功能。因此，最适酶解pH值为4.0。
图1 果胶酶添加量（A）、和酶解时间（B）、酶解温度（C）、酶解pH（D）对金丝枣出汁率的影响
Fig.1 Effect of pectinase addition(A),enzymolysis time(B),temperature(C)and pH(D)on golden-silk jujube juice yield
不同字母代表差异显著（P＜0.05）。下同。
2.1.2 金丝枣酶解工艺条件优化正交试验结果与分析
在单因素试验的基础上，以金丝枣出汁率为考察指标，选取果胶酶添加量（A）、酶解时间（B）、酶解温度（C）、酶解pH值（D），设计L9（34）正交试验优化金丝枣酶解工艺条件，正交试验结果与分析见表3。
表3 金丝枣酶解条件优化正交试验结果与分析
Table 3 Results and analysis of orthogonal tests for enzymatic hydrolysis conditions optimization of golden-silk jujube juice
由表3可知，根据R值得出影响金丝枣酶解出汁率的4个因素的主次顺序为：C＞D＞B＞A，即酶解温度＞酶解pH＞酶解时间＞果胶酶添加量。根据k值，得出最优金丝枣酶解条件组合为A2B2C2D3，即果胶酶添加量0.03%、酶解pH值3.5、45 ℃条件下水解3 h，在该工艺条件下进行3次平行验证试验，金丝枣出汁率达到93.9%，较未经酶解的对照组金丝枣出汁率（78.88%）提高了15.02%。结果表明，对金丝枣酶解条件进行优化可以提高金丝枣出汁率。
2.2 柠檬酶解工艺条件优化
2.2.1 柠檬酶解工艺条件优化单因素试验结果
柠檬中果胶含量高达25%左右[28]，导致柠檬汁黏度较高，直接榨汁出汁率较低，因此本试验采用果胶酶水解柠檬的果胶物质，并探究果胶酶添加量、酶解时间、酶解温度以及酶解pH值对柠檬出汁率的影响，结果见图2。
由图2A可知，当果胶酶添加量为0.010%～0.025%，柠檬出汁率上升显著；果胶酶添加量为0.025%时，柠檬出汁率最高，为89.12%；果胶酶添加量＞0.025%之后，酶解出汁率上升趋势不明显。因此，最适果胶酶添加量为0.025%。由图2B可知，当酶解时间为1～3 h时，柠檬出汁率逐渐增加；当酶解时间为3 h时，柠檬出汁率最高，为89.11%；当酶解时间＞3 h之后，柠檬出汁率下降。因此，最适酶解时间为3 h。由图2C可知，当酶解温度为30～40 ℃时，柠檬出汁率逐渐增加；当酶解温度为40 ℃时，柠檬出汁率达最高值，为88.94%；当酶解温度＞40 ℃之后，柠檬出汁率下降。因此，最适酶解温度为40 ℃。由图2D知，当酶解pH值为2.5～4.0时，柠檬出汁率逐渐增加；当酶解pH值为4.0时，柠檬出汁率最高，为89.23%；当酶解pH值＞4.0之后，柠檬出汁率下降。因此，最适酶解pH值为4.0。
图2 果胶酶添加量（A）、酶解时间（B）、酶解温度（C）、酶解pH（D）对柠檬出汁率的影响
Fig.2 Effect of pectinase addition (A),enzymolysis time (B),temperature (C) and pH (D) on lemon juice yield
2.2.2 柠檬酶解工艺条件优化正交试验结果与分析
在单因素试验的基础上，以柠檬出汁率为考察指标，选取果胶酶添加量（A）、酶解时间（B）、酶解温度（C）、酶解pH值（D），设计L9（34）正交试验优化柠檬酶解工艺条件，正交试验结果与分析见表4。
表4 柠檬酶解条件优化正交试验结果与分析
Table 4 Results and analysis of orthogonal tests for enzymatic hydrolysis conditions optimization of lemon
由表4可知，根据R值，影响柠檬酶解出汁率的4个因素的主次关系为A＞C＞B＞D，即果胶酶添加量＞酶解温度＞酶解时间＞酶解pH值。根据k值，得出最优柠檬酶解条件的组合为A3B2C3D3，即果胶酶添加量0.020%，酶解时间3 h，酶解温度45 ℃，酶解pH值4.5。以此优化工艺条件下，进行3次平行验证试验，柠檬出汁率达90.04%，较未酶解的对照组柠檬出汁率提高了9.91%。
2.3 金丝枣汁和柠檬汁体积比的确定
金丝枣汁和柠檬汁体积比对感官评分的影响见图3。
图3 金丝枣汁和柠檬汁体积比对复合果汁感官评分的影响
Fig.3 Effect of volume ratio of golden-silk jujube juice and lemon juice on sensory scores of compound juice
由图3可知，当金丝枣汁和柠檬汁体积比在1∶9～7∶3之间，随着混合汁中金丝枣汁的占比增大，感官评分随之升高；当金丝枣汁和柠檬汁体积比为7∶3时，感官评分最高，为90分；但金丝枣汁和柠檬汁体积比超过7∶3时，感官评分则呈下降趋势。故确定金丝枣汁和柠檬汁混合的最佳体积比为7：3。
2.4 酒精发酵工艺条件优化
2.4.1 酒精发酵工艺条件优化单因素试验结果
酒精发酵是果醋发酵的关键环节，本试验探究了初始糖度、酵母菌接种量和初始pH值对金丝枣柠檬复合果汁酒精发酵效果的影响，结果见图4。
图4 初始糖度（A）、酵母菌接种量（B）、初始pH（C）对金丝枣柠檬复合果汁酒精发酵的影响
Fig.4 Effect of initial sugar content (A),yeast inoculum (B),initial pH(C) on alcoholic fermentation of golden-silk jujube and lemon compound juice
由图4A可知，随着初始糖度在14～22°Bx范围内增加，残糖含量显著增加。随着初始糖度在14～18°Bx范围内增加，发酵液中酒精度显著增加；当初始糖度为18°Bx时酒精度达到最高，为8.3%vol；当始糖度＞18°Bx，酒精度下降。初始糖度越高，高渗透作用对酵母生长抑制越明显[29]，表现为残糖含量增加，酒精度下降，且发酵液浑浊，酒精气味刺鼻。综上所述，最适初始糖度为18°Bx。由图4B可知，酵母菌接种量在0.01%～0.05%范围内增加，残糖含量一直呈下降趋势。随着酵母菌接种量在0.01%～0.03%范围内增加，酒精度逐渐增加；酵母菌接种量为0.03%时，酒精度达最高值，为8.8%vol；酵母菌接种量＞0.03%，发酵液酒精度降低，这可能是由于酵母接种量过高，发酵液中营养物质大量被消耗而影响了酒精发酵[30]，综上所述，最适酵母接种量为0.03%。由图4C可知，随着初始pH值在3.5～5.5范围内增加，残糖含量逐渐增加，初始pH值＞4.5，残糖含量上升更明显。随着初始pH值在3.5～4.5范围内增加，酒精度逐渐增加；初始pH值＞4.5之后，发酵液中酒精度则明显降低；初始pH值为5.5时，无法测出酒精度，表明该pH条件不适于酵母发酵。通过显著性分析结果显示，初始pH值为4.0和4.5时，发酵液酒精度无显著性差异（P＜0.05），为进一步细化酒精发酵的最适初始pH值，选择初始pH值为4.00、4.25、4.50进行正交试验。
2.4.2 酒精发酵工艺条件优化正交试验结果与分析
在单因素试验基础上，以酒精度为评价指标，考察初始糖度（A）、酵母菌接种量（B）、初始pH值（C）对酒精发酵效果的影响，设计3因素3水平的正交试验，正交试验结果与分析见表6。
表6 酒精发酵工艺条件优化正交试验结果与分析
Table 6 Results and analysis of orthogonal tests results for alcoholic fermentation technology optimization
由表6可知，以酒精度为评价指标，根据R值，影响发酵液酒精发酵阶段酒精度的3个因素的主次关系为：初始糖度（A）＞初始pH值（C）＞酵母菌接种量（B）。根据k值，得到酒精发酵阶段最佳工艺条件的组合为A3B3C3，即初始糖度20°Bx，酵母菌接种量0.04%，初始pH值4.0。在此优化条件下进行验证试验，酿造得到的金丝枣柠檬复合果酒残糖含量为3.86 g/L，酒精度为9.00%vol。
2.5 醋酸发酵工艺条件优化
2.5.1 醋酸发酵工艺条件优化单因素试验结果
醋酸菌以酒精为主要底物发酵产醋酸[31]，发酵产物的总酸含量与发酵时间息息相关，而发酵时间又直接受菌株接种量的影响[32]。因此，本试验考察了初始酒精度、醋酸菌接种量、初始pH值对金丝枣柠檬果酒醋酸发酵效果的影响，其结果见图5。
图5 初始酒精度（A）、醋酸菌接种量（B）、初始pH值（C）对红枣柠檬复合果酒醋酸发酵的影响
Fig.5 Effect of initial alcohol content (A),acetic acid bacteria inoculum(B),and initial pH (C) on acetic fermentation of golden-silk jujube and lemon compound alcoholic beverage
由图5A可知，当初始酒精度在5.0%vol～6.0%vol范围内增加时，感官评分逐渐增加；当初始酒精度为6.0%vol时，感官评分最高，为76.5分；当初始酒精度＞6.0%vol之后，感官评分略有下降。当初始酒精度在5.0%vol～9.0%vol范围内，总酸含量均呈增加趋势，由21.35 g/L提高至28.71 g/L，综合考虑，最适初始酒精度为6.0%vol。
由图5B可知，醋酸菌接种量在0.02%～0.04%范围内增加，金丝枣柠檬复合果醋感官评分有所增加；当醋酸菌接种量为0.04%，感官评分最高，为76.6分，当醋酸菌接种量＞0.04%之后，感官评分整体呈下降趋势。在醋酸菌接种量在0.02%～0.06%范围内增加，金丝枣柠檬复合果醋总酸含量逐渐增加；当醋酸菌接种量为0.06%，总酸含量最高，为30.68 g/L，当醋酸菌接种量＞0.06%，总酸含量下降。综合考虑，最适醋酸菌接种量为0.04%。
由图5C可知，初始pH值在2.5～4.5范围内增加，总酸含量显著下降。当发酵液初始pH值在2.5～4.0范围内增加，感官评分逐渐增加；初始pH值为4.0时，感官评分达到最大，为70.8分；初始pH值＞4.0之后，感官评分逐渐下降。因此，最适pH值为4.0。
2.5.2 醋酸发酵工艺条件优化正交试验结果与分析
在单因素试验基础上，以感官评分为评价指标，考察初始酒精度（A）、醋酸菌接种量（B）、初始pH（C）对醋酸发酵效果的影响，设计3因素3水平的正交试验，正交试验结果与分析见表7。
表7 醋酸发酵工艺条件优化正交试验结果与分析
Table 7 Results and analysis of orthogonal experiments for acetic acid fermentation process conditions optimization
由表7可知，根据极差值R，影响感官评分的3个因素的主次关系为初始pH值（C）＞醋酸菌接种量（B）＞初始酒精度（A）。根据k值，得到最优醋酸发酵阶段工艺条件组合是A2B3C3，即初始酒精度6.0%vol，醋酸菌接种量0.06%，初始pH值4.5。在此优化条件下进行3次平行验证试验，酿造金丝枣柠檬复合果醋感官评分达81.2分，总酸含量为18.01 g/L，符合NY/T 2987—2016《绿色食品 果醋饮料》要求[33]。
3 结论
本试验以金丝枣与柠檬为原料发酵制备金丝枣柠檬复合果醋，分别确定了金丝枣与柠檬的最佳酶解条件，将酶解后的金丝枣汁和柠檬汁以7∶3（V/V）混合后，调整初始pH值4.0，初始糖度20°Bx，添加SO2含量75 mg/L，以0.04%接种量接种安琪酵母SY，28 ℃发酵6 d，然后进行醋酸发酵，即初始pH值4.5，初始酒精度6%vol，醋酸菌接种量0.06%，32 ℃发酵7 d，制得金丝枣柠檬复合果醋。金丝枣柠檬复合果醋感官评分为81.2分，醋体呈黄橙色，口感酸甜适宜，状态均一、稳定，无悬浮物，风味协调。其总酸（以乙酸计）含量为18.01 g/L，符合NY/T 2987—2016《绿色食品 果醋饮料》要求。
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