红曲霉（Monascus）作为一种药食用丝状真菌，其次级代谢产物包括天然红曲色素、γ-氨基丁酸、莫纳可林（Monacolin）K、桔霉素等[1-2]。红曲色素作为一种聚酮类代谢产物，现已有110多种被发现[3]，根据其溶解性可分为醇溶性和水溶性2种[4]。红曲色素具有食品着色剂的生物安全性和适用性[5]，已被用于研制具有功能特性的调味品[6]、酒类[7]、肉制品[8]和面制品[9]等。除此之外，红曲色素具有羟基、醚键、羰基等官能团和共轭结构，具有抗突变[10]、抗癌[11]、抗肥胖[12-13]、抗氧化[14]、降血压[15]和抗阿尔兹海默症[4]等多种生物活性，使得红曲色素在功能性食品、制药等方面有更广的应用前景。
氮源作为重要的能源物质，对真菌生长发育过程中大分子物质有调控作用，已有关于构巢曲霉（Aspergillus nidulans）、粗糙脉胞菌（Neurosporacrassa）中氮代谢调控机制的研究[16-17]。岳倩倩等[18]考察不同的无机氮源对红曲霉菌丝生长和产色素的调控情况发现，铵态氮对红曲霉生长和产色素有促进作用，亚硝态氮则有抑制作用，但其氮代谢调控机制尚不清楚。
随着第二代测序技术的出现，组学技术应运而生。到目前为止，主要的组学方法包括基因组学、转录组学、蛋白质组学、代谢组学等[19-20]。其中，转录组学因其具有灵敏度高、费用低、针对性强、对其筛出的遗传标记可直接进行应用等优点而率先取得进步[21]。因其可以用于深度挖掘新基因、确定代谢途径及进化分析[22-23]，已被广泛应用于生物学、医学、农学等领域。如稻曲病菌有性生殖中光诱导基因的转录组分析[24]、大青转录组测序及生物信息学分析[25]等。为深入研究氮源对红曲霉生长和产色素的调控机制，本研究分别以铵态氮、亚硝态氮为氮源培养安卡红曲霉（Monascus anka）菌株GZUM-25，采用Illumina二代测序平台对红曲霉GZUM-25进行转录组测序分析，分析不同氮源条件下调控红曲霉菌丝生长和产色素的差异表达基因，并对基因进行GO功能富集及KEGG通路富集分析，以期为后续红曲霉基因的深度挖掘提供信息资源和理论参考。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
1.1.1 菌种
安卡红曲霉（Monascus anka）GZUM-25：本实验室分离保藏。
1.1.2 培养基
沙氏琼脂改良培养基[25]：麦芽糖5 g/L，蛋白胨10 g/L，酵母膏5 g/L，琼脂20 g/L，葡萄糖20 g/L，pH自然，121 ℃高压灭菌25 min。液体培养基中不添加琼脂。
察氏培养基[25]：NaNO33g/L，K2HPO41g/L，MgSO·47H2O 0.5 g/L，KCl 0.5 g/L，FeSO4 0.01 g/L，蔗糖30 g/L，琼脂20 g/L，121 ℃高压灭菌25 min。
调控培养基：向察氏培养基中分别添加1%的NaNO2、（NH4）2SO4两种不同的无机氮源，用于红曲霉菌株培养。
1.1.3 化学试剂
麦芽糖、葡萄糖、酵母膏、蛋白胨（均为生化试剂）：奥博星生物技术有限公司；NaNO2、K2HPO4、MgSO4·7H2O、KCl、FeSO4（均为分析纯）：重庆北碚精细化工厂；（NH4）2SO4（分析纯）：重庆川江化工有限公司。其他试剂均为国产分析纯。
1.2 仪器与设备
LDZX-50KBS立式高压蒸汽灭锅：上海申安医疗器械厂；SW-CJ-1F超净工作台：苏州净化设备有限公司；DH-360A电热恒温培养箱：北京科伟永兴仪器有限公司；THZ-82A数显气浴恒温振荡器：金坛市晶玻实验仪器厂；Trizol总核糖核酸（ribonucleic acid，RNA）抽提试剂盒、TruseqTM RNA sample prep试剂盒、Dynal M280磁珠：美国Invitrogen公司；NanoDrop2000：美国Thermo Scientific公司。
1.3 试验方法
1.3.1 红曲霉样品制备
将安卡红曲霉菌株GZMU-25接种到沙氏琼脂改良培养基上，30 ℃恒温培养10 d。将已活化的安卡红曲霉菌株GZMU-25用10 mL无菌水洗下后，将孢子悬液分别转移到含1%NaNO2和1%（NH4）2SO4的调控培养基中，分别编号为MP1、MP2，30 ℃、230 r/min条件下振荡培养7 d。培养结束后，将菌丝用无菌镊子挑出，用液氮速冻保存于-80 ℃冰箱。
1.3.2 总RNA的提取
采用总RNA提取试剂盒提取经液氮冷冻保藏的菌丝球总RNA，通过NanoDrop2000对所提RNA的浓度和纯度进行检测，采用琼脂糖凝胶电泳检测RNA完整性，Agilent 2100测定RNA完整值（RNA integrity number，RIN），挑选满足测序要求的RNA样本进行转录组测序。
1.3.3 文库的构建和Illummina Hiseq测序
利用带有Oligo（dT）的磁珠与poly A进行腺嘌呤（adenine，A）-胸腺嘧啶（thymine，T）配对，从样本MP1、MP2总RNA中分离出信使核糖核酸（messenger ribonucleic acid，mRNA），加入fragmentation buffer，将mRNA随机断裂成碱基长度为200 bp左右的小片段。在逆转录酶的作用下，加入六碱基随机引物，以mRNA为模板反转录合成第一链互补脱氧核糖核酸（complementary deoxyribonucleic acid，cDNA），随后进行第二链合成，形成稳定的双链结构。对双链cDNA进行末端修饰、片段大小选择，最后选择富集合格的文库进行Illummina Hiseq测序。
1.3.4 序列分析和功能注释
通过Illummina Hiseq测序得到包含测序接头序列、低质量读段、N（无法确定碱基信息）率较高序列及长度过短序列的原始测序数据，采用软件SeqPrep、Sickle对原始数据进行阅读框（reads）中接头序列的去除、3'端低质量碱基的修剪及含N比率＞10%reads的去除。利用bowtie将修剪后的测序数据比对到基因组上，检测外显子之间的可变剪切信息，并将最终得到的序列与Nr、GO、KEGG数据库进行对比，并对其功能进行注释。
2 结果与分析
2.1 红曲霉转录组测序与转录分析
对原始数据进行统计分析，结果见表1。由表1可知，从样品MP1中得到的阅读框（reads）总数和碱基总数分别为62 127 568条和9 381 262 768 bp；从样品MP2中得到的reads总数和碱基总数分别为52 725 002条和7 961 475 302 bp。对原始数据进行质量修剪后，样品MP1得到的Clean reads和Clean碱基总数分别为61 233 790条和9 145 916 108 bp；样品MP2得到的Clean reads 和Clean 碱基总数分别为51 890 476条和7 746 137 365 bp。样品MP1和MP2的鸟嘌呤（guanine，G）胞嘧啶（cytosine，C）含量分别为53.29%、53.10%，Q20碱基比例分别为98.59%、98.53%，Q30碱基比例分别为95.78%、95.64%。通过与参考基因组对比后，样品MP1和MP2得到的Uniquely mapped总数分别为45 194 295、35 139 204，占比分别为73.81%、67.72%。结果表明，该转录组样本测序质量较高，可进行下一步样品中差异基因的分析。
表1 转录组测序结果统计
Table 1 Statistics of transcriptome sequencing analysis results
注：Q20为质量值≥20的碱基所占比列；Q30为质量值≥30的碱基所占比列。
2.2 红曲霉样本间差异基因的分析
使用edgeR软件，根据gene read count数据进行差异表达计算，按照错误发现率（false discoveryrate，FDR）＜0.05且差异倍数（fold change，FC）对数值的绝对值（｜log2FC｜）≥1为标准，对样品差异基因进行筛选，结果见图1。
图1 红曲霉样本间差异表达基因散点图
Fig.1 Scatter plot of differentially expressed genes between Monascus samples
越接近0的点，说明表达量越低；偏离对角线程度越大的点表明该基因在两个样本间表达差异越大。
由图1可知，样本MP1与MP2中共存在2 117个基因，其中存在显著差异基因有95个，37个基因属于显著上调，58个基因属于显著下调。
2.3 红曲霉样本间差异表达基因的GO功能富集分析
使用Goatools软件对红曲霉样品间差异表达的基因进行GO功能显著性富集，利用GO数据库，以P≤0.05为筛选标准，按照基因参与的生物学过程（biological process，BP）、构成细胞组分（cellular component，CC）、实现的分子功能（molecular function，MF）等将MP1、MP2样品存在的差异表达基因进行比对分析，结果见图2。由图2可知，在样本MP1和MP2中，差异基因参与了生物学过程、细胞组分和分子功能。将95个差异基因分别映射到46个代谢通路中，在分子功能中，主要富集通路为铁离子连接（iron ion binding）和单氧化酶活性（monooxygenase activity），均有5个差异基因参与，均占差异表达基因总数的5.26%。其次是氧化还原酶活性（oxidoreductase activity）、血红素结合（heme binding）等。在细胞组分中，主要富集通路为葡萄糖苷酶II复合物（glucosidase II complex）、细胞表面（cell surface），参与的差异表达基因数均为1个，均占总差异表达基因总数的1%。在生物学过程中，主要富集通路为葡萄糖代谢过程（sucrose metabolic process）、淀粉代谢过程（starch metabolic process）、细胞碳水化合物代谢过程（cellular carbohydrate metabolic process），参与差异表达的基因数分别有3个、3个、4个，占总差异表达基因总数的3.16%、3.16%、4.21%。
图2 红曲霉样本间差异表达基因的GO功能富集结果
Fig.2 GO functional enrichment results of differentially expressed genes between Monascus samples
“**”表示极显著富集（P＜0.01），“*”表示显著富集（P＜0.05）。
2.4 红曲霉样本间差异表达基因的KEGG通路富集分析
以P≤0.05作为筛选差异基因在KEGG通路显著富集的标准，使用软件KOBAS对红曲霉样本间差异基因进行KEGG通路富集分析，结果见图3。由图3可知，在样品MP1和MP2中，95个差异基因中有11个基因注释到KEGG 17条通路中。包括磷酸肌醇代谢（inositol phosphate metabolism）、氨基苯基酸酯降解（aminobenzoate degradation）、淀粉和蔗糖代谢（starch and sucrose metabolism）、氯代环己烷和氯苯降解（chlorocyclohexane and chlorobenzene degradation）、紧密连接（tight junction）、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸生物合成（valine，leucine and isoleucine biosynthesis）、酪氨酸代谢（tyrosine metabolism）等。在以上差异表达基因富集通路中，磷酸肌醇代谢（inositol phosphate metabolism）、淀粉和蔗糖代谢（starch and sucrose metabolism）、苯乙烯降解（styrenedegradation）以及氨基苯基酸酯降解（aminobenzoate degradation）差异基因参与数目最多，均为2个，可推测以上4条通路在红曲霉菌丝生长和色素产生方面存在重要作用。
图3 红曲霉样本间差异表达基因的KEGG通路富集分析结果
Fig.3 KEGG pathway enrichment analysis results of differentially expressed genes between Monascus samples
颜色的深浅代表通路富集程度；“*”表示差异基因在该通路显著富集（P＜0.05）。
3 结论
以铵态氮、亚硝态氮为氮源培养安卡红曲霉（Monascus anka）菌株GZUM-25，采用Illumina二代测序平台对红曲霉GZUM-25进行转录组测序分析发现，铵态氮和亚硝态氮培养下的安卡红曲霉GZUM-25基因组中有95个差异表达基因，其中，上调基因有37个，下调基因有58个。通过GO功能富集及KEGG通路富集分析发现，差异基因主要富集的功能为生物学过程、细胞组分和分子功能，富集的通路为磷酸肌醇代谢、淀粉和蔗糖代谢、苯乙烯降解、氨基苯基酸酯降解。本研究为红曲霉相关功能基因的挖掘提供了理论支持。
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