宁夏枸杞（Lycium barbarum）是重要的药食两用植物资源[1]，研究表明，枸杞具有保肝[2]、明目[3]、抗癌[4]、抗抑郁[5]、调节免疫[6]等药理作用。南瓜具有良好的栽培特性[7]，营养丰富，含有人体所需的多糖、类胡萝卜素等多种天然活性物质[8]，具有降血糖、降脂保肝、抗氧化等多种药用价值[9]。
益生菌是一类具有维持肠道菌群平衡，增强免疫力功效的活性微生物，相比单菌发酵而言，复合益生菌发酵更能赋予果蔬汁独特的风味和丰富的营养功能[10]；且经过喷雾干燥制备的果蔬粉具有良好的分散性和溶解性，可保持果蔬原有营养物质和风味，使储存和运输更加方便[11]。如张璐等[12]通过对比单一及混合益生菌发酵猕猴桃果汁，发现混合益生菌发酵猕猴桃果汁香气更浓郁，更适合生产；张振民等[11]通过对比脱脂乳粉及β-麦芽糊精协同减压喷雾干燥技术制备枣粉，发现选择以脱脂乳粉作为助干剂和保护剂，其产品助干效果和保护效果均显著优于β-麦芽糊精。
但是目前市面上枸杞南瓜深加工制品相对较少，且南瓜多数仍以鲜食为主，其加工产业附加值较低；因此实验采用同样具有抗氧化、保肝、促进肠道健康等功能的枸杞南瓜结合乳酸菌进行发酵制备成粉作为研究方向，一方面可以促进枸杞、南瓜的深加工进一步发展、减少因地域和季节造成的资源浪费；另一方面益生菌又能与枸杞、南瓜起到协同作用，从而提高产品的抗氧化能力及促进肠道健康的能力。
本研究以枸杞、南瓜为原料，利用植物乳杆菌（Lactobacillu plantarum）和鼠李糖乳杆菌（Lactobacillus rhamnosus）混菌（5∶1）发酵枸杞南瓜汁，以喷雾干燥法制备枸杞南瓜粉，采用单因素试验及正交试验优化喷雾干燥工艺，并通过体外模拟胃肠消化试验及自由基清除试验研究枸杞南瓜粉的消化特性及氧化活性，旨在进一步推进果蔬汁益生菌发酵技术的发展并为果蔬粉新产品的研发提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
宁夏枸杞、板栗南瓜、小苏打、白砂糖：市售；植物乳杆菌（Lactobacillu plantarum）、鼠李糖乳杆菌（Lactobacillus rhamnosus）：宁夏食品微生物应用技术与安全控制重点实验室；D-异抗坏血酸钠：国药集团化学试剂有限公司；脱脂乳粉（编号为190-12865）：日本和光纯药工业公司；胃蛋白酶（酶活30 000 U/g）、胰蛋白酶（酶活250 U/mg）、猪胆盐：博奥拓达科技有限公司；果胶酶（酶活500 U/mg）、1,1-二苯基-2-苦基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）、2,2-联氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二铵盐（2,2'-azinobis（3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate）diammonium salt，ABTS）：上海源叶生物科技有限公司；其他试剂均为国产分析纯。
1.2 仪器与设备
LDZX-50KBS 立式压力蒸汽灭菌器：上海申安医疗器械厂；JYK-C051 榨汁机：中国杭州九阳小家电有限公司；PB-LO pH 计：赛多利斯科学仪器有限公司；UV-2450紫外分光光度计：上海仪电科学仪器有限公司；B-290小型喷雾干燥仪：步琦实验室设备贸易（上海）有限公司。
1.3 方法
1.3.1 枸杞南瓜粉的制备
枸杞汁的制备：枸杞干果去除表面污垢后，以水料比5∶1（mL∶g）先加水浸泡8～9 h，再加入0.05%的D-异抗坏血酸钠作为护色剂打浆，加入总体积0.15%的果胶酶，于50 ℃条件下水浴2h。用滤布过滤后，用小苏打调节pH值至6.0～6.5之间，在80 ℃条件下杀菌15 min，冷却后得到枸杞汁，备用。
南瓜汁的制备：将南瓜剥皮去芯，以水料比4∶1（mL∶g）加水，再加入0.05%的D-异抗坏血酸钠作为护色剂打浆，加入总体积0.15%的果胶酶，于50 ℃条件下水浴2 h，后用小苏打将枸杞汁的pH值调至6.0～6.5之间，在80 ℃条件下杀菌15 min，冷却后得到南瓜汁，备用。
枸杞南瓜粉的制备[14]：在灭菌后的枸杞南瓜汁中（体积比为5∶1）接种4%的混菌，其中植物乳杆菌（Lactobacillu plantarum）与鼠李糖乳杆菌（Lactobacillus rhamnosus）体积比为5∶1，并于37 ℃条件下厌氧发酵15 h，当pH达到4.0～4.2之间时判定发酵结束，加入3%白砂糖，得到发酵枸杞南瓜原浆，对其进行喷雾干燥，得到枸杞南瓜粉。
1.3.2 喷雾干燥工艺优化
（1）单因素试验[13]
以进口热风温度（140 ℃、150 ℃、160 ℃、170 ℃、180 ℃）、进料流量（6.0 mL/min、7.5 mL/min、9.0 mL/min、10.5 mL/min、12.0 mL/min）、脱脂乳粉添加量（0、2%、3%、4%、5%）作为自变量，以感官评分与集粉率作为评价指标，考察上述各因素对喷雾干燥的影响。
（2）响应面试验
在单因素试验基础上，以进口热风温度（A）、进料流量（B）和脱脂乳粉添加量（C）为自变量，以集粉率（Y1）和感官评分（Y2）为响应值，设计3因素3水平Box-Behnken试验，响应面试验因素与水平见表1。
表1 Box-Behnken试验设计因素与水平
Table 1 Factors and levels of Box-Behnken experiments design
1.3.3 体外模拟胃肠消化试验
参考文献[15]略有改动，称取未发酵枸杞南瓜粉10 g作为对照组、发酵枸杞南瓜粉10 g作为发酵组分别做体外模拟试验，置于400 mL生理盐水混合均匀，用1 mol/L HCl溶液调节pH至2.0，加入5 mL模拟胃液（0.2 g胃蛋白酶溶入5 mL 0.01 mol/L HCl溶液）充分溶解，置于37 ℃、120 r/min恒温振荡器中振荡2 h，每隔0.5 h取样一次，每次取样10 mL；体外模拟胃消化结束后向胃消化液中用1 mol/L碳酸氢钠溶液调节pH至7.0，加入5 mL肠液（0.2 g胰蛋白酶和1.24 g猪胆盐溶于50 mL 0.1 mol/L NaHCO3溶液），混合均匀，置于37 ℃、120 r/min恒温振荡器振荡4 h，每隔1 h取样一次，每次取样10 mL。胃肠消化阶段取得的样品于12 000 r/min、4 ℃条件下离心10 min，离心后样品在-80 ℃保存，每次使用前溶解。
1.3.4 分析检测
（1）活菌数测定
参考文献[16]，采用稀释涂布平板计数法测定。
（2）感官评价
邀请12名感官评价培训合格的同学组成感官评价小组对发酵后的枸杞南瓜粉进行无记名打分。首先对成粉的色泽、组织状态进行评价，然后取3 g枸杞南瓜粉溶于50 mL温开水进行气味、口感及整体协调性评价，满分为100分，取平均值作为最终感官评分。
表2 枸杞南瓜粉感官评分标准
Table 2 Sensory evaluation standards of L.barbarum pumpkin powder
（3）集粉率测定
参考文献[17]略有改动，集粉率反映了不同干燥条件对枸杞南瓜粉干燥效果的影响，其计算公式如下：
式中：M1为收集到喷雾干燥枸杞南瓜粉质量，g；M2为枸杞南瓜发酵原浆固形物含量，g；M3为脱脂乳添加量，g。
（4）总多酚、总黄酮含量的测定
采用福林酚法测定总多酚含量[18]，以没食子酸当量（gallic acid equivalent，GAE）表示样品中总多酚含量，以μgGAE/mL表示；采用硝酸铝显色法测总黄酮含量[19]，芦丁当量（rutin equivalent，RE）表示样品中总黄酮含量，以μgRE/mL表示。
（5）抗氧化活性的测定
DPPH自由基清除率、ABTS自由基清除率的测定参考ARISE A K等[20]的方法；羟自由基清除率的测定参考何坤明等[21]的方法。
1.3.5 数据处理
每组试验重复处理3次，应用Origin 9.0、Design-Expert 8.0.6软件进行Box-Behnken试验设计绘图、SPSS 22.0软件进行单因素方差分析，P＜0.05表示差异显著。
2 结果与分析
2.1 喷雾干燥工艺优化
2.1.1 单因素试验结果
由图1a可知，随着进口热风温度的升高，集粉率和感官评分整体呈先上升再下降趋势；当进口热风温度＜160 ℃时，由于受热不均匀，导致物料干燥不充分，集粉率与感官评价较低；当进口热风温度为160 ℃时，集粉率与感官评价最高，分别为41.57%、89.33分；当进口热风温度＞160 ℃之后，高温使物料中的糖类物质发生焦糖化反应以及溶化反应，出现粘壁现象，口感和集粉率降低[22]。因此，进口热风温度在160 ℃为宜。
图1 各单因素对枸杞南瓜粉集粉率及感官评分的影响
Fig.1 Effect of various factors on the powder collection rate and sensory score of L.barbarum pumpkin powder
由图1b可知，当进料流量＜7.5 mL/min时，由于进料量较小，料液受热较为充分，枸杞南瓜汁的干燥效果较好，但缺点是其耗时较长；当进料流量为7.5 mL/min时，集粉率与感官评价最高，分别为43.64%、90.00分；当进料流量＞7.5 mL/min之后，由于进料速度加快，物料受热不充分，导致产品中含水量愈来愈高，集粉率和口感下降，严重会出现滴液现象。因此，进料流量选择7.5 mL/min为宜。
由图1c可知，当脱脂乳粉添加量0～2%时，随着脱脂乳粉的添加，使物料中可溶性固形物含量增加，便于干燥，同时赋予产品一股淡淡的奶香味；当脱脂乳粉添加量2%时，集粉率最高，为42.72%，感官评分为86.33分；当脱脂乳粉添加量＞2%之后，物料中固形物含量增大，影响喷雾效果，严重时会阻塞干燥喷头。因此，脱脂乳粉添加量选择2%为宜。
综上所述，喷雾干燥单因素优化参数为进口热风温度160 ℃，进料流量7.5 mL/min，脱脂乳粉添加量2%。
2.1.2 响应面试验结果分析
在单因素试验基础上，以进口热风温度（A）、进料流量（B）和脱脂乳粉添加量（C）为自变量，以集粉率（Y1）和感官评分（Y2）为响应值，设计3因素3水平Box-Behnken试验，响应面试验结果及分析见表3，方差分析结果见表4，得到的二次多项回归方程分别为：
表3 Box-Behnken试验设计及结果
Table 3 Design and results of Box-Behnken experiments
表4 回归模型方差分析
Table 4 Variance analysis of regression model
注：“**”表示对结果影响极显著（P＜0.01），“*”表示对结果影响显著（P＜0.05）。
由表4可知，集粉率Y1和感官评价Y2的回归方程的F值分别为49.70、17.58，P值均＜0.01，表明模型均极显著，Y1、Y2模型失拟项F值分别为0.16、1.32，P值分别为0.915 2、0.383 7（P值均＞0.05），失拟项均不显著，说明方程的拟合度较好，可以用两个模型对试验响应值进行分析和预测。决定系数R2分别为0.984 6、0.957 6，校正决定系数R2adj分别为0.964 8、0.903 1；变异系数分别为3.10%、1.67%。由P值可知，一次项中脱脂乳粉添加量（C）对集粉率（Y1）和感官评价（Y2）影响极显著（P＜0.01），进料流量（B）对集粉率影响极显著（P＜0.01），对感官评价影响显著（P＜0.05），进口热风温度（A）对集粉率影响极显著（P＜0.01），对感官评价影响不显著（P＞0.05）；二次项中A2、B2对集粉率和感官评价影响极显著（P＜0.01），C2对集粉率影响不显著（P＜0.05），对感官评价影响极显著（P＜0.01）；交互项中AC对集粉率影响显著（P＜0.05），对感官评价影响显著（P＜0.05），AB、BC对集粉率影响不显著（P＞0.05），对感官评价影响显著（P＜0.05）。由F值可知，各因素对喷雾干燥后集粉率影响大小为进口热风温度（A）＞脱脂乳粉添加量（C）＞进料流量（B）；各因素对感官评价的影响大小为脱脂乳粉添加量（C）＞进料流量（B）＞进口热风温度（A）。
响应面等高线形状以及曲线坡度可以反映出影响响应值结果各因素之间的相互作用，若两因素交互作用不显著，等高线性状呈圆形；两因素交互作用显著，等高线性状呈椭圆形。
由图2a、2b、2c可知，脱脂乳粉添加量与进料流量、进口热风温度的响应面坡度较陡，等高线性状趋向于椭圆形，说明脱脂乳粉添加量与进料流量、进口热风温度对喷雾干燥后集粉率交互作用显著，同理可得，进口热风温度与进料流量对集粉率的交互影响最小；由图2d、2e、2f可知，进口热风温度与进料流量、进料流量与脱脂乳粉添加量、进口热风温度与脱脂乳粉添加量三者响应面坡度陡，交互作用等高线均趋于椭圆形，说明三者交互作用显著，对感官评价的影响较大。
图2 各因素交互作用对枸杞南瓜粉集粉率及感官评分影响的响应面及等高线
Fig.2 Response surface plots and contour lines of the effects of interaction of factors on powder collection rate and sensory score of L.barbarum pumpkin powder
经Design-Expert 8.0.6软件响应面分析后得到的最佳喷雾干燥工艺为：进口热风温度159.9℃，进料流量7.32mL/min，脱脂乳粉添加量2.5%，在该条件下得到的集粉率预测值为40.8%，感官评分预测值为88.8分。为了便于实际操作，将最佳喷雾干燥工艺修正为：进口热风温度160 ℃，进料流量7.5 mL/min，脱脂乳粉添加量2.5%。在此优化条件下，进行3次平行验证试验，集粉率实际值为40.3%，感官评分实际值为89.3分，与集粉率和感官评分预测值相近，说明方程拟合度良好，模型可靠。
2.2 体外模拟胃肠消化试验
2.2.1 总黄酮、总多酚变化
枸杞南瓜粉在体外模拟胃肠消化过程中总黄酮及总多酚含量的变化结果见图3。
由图3A可知，在体外模拟胃肠消化实验中，对照组和发酵组胃肠消化阶段的总黄酮含量随消化时间增加不断降低。在胃消化2 h后，发酵组总黄酮含量为对照组的1.89倍，这可能是发酵组在发酵时的酸性环境中释放了部分黄酮类物质，而对照组未经发酵，导致对照组中的样品在酸性环境和胃蛋白酶的双重作用下极大地促进了黄酮类物质的释放[18]。在肠消化阶段，总黄酮含量呈现先升高再降低的趋势，且整体高于胃消化组，肠消化2 h后发酵组总黄酮含量为对照组的1.54倍。这可能是由于pH突然升高使原来在酸性环境下沉淀的大分子物质再次溶解[23]，而后在胰液和胆汁的作用下使黄酮类物质的降解量大于释放量有关[24]。消化结束后，对照组总黄酮含量较胃消化0 h下降了14.81%，发酵组总黄酮含量下降了6.35%。
由图3B可知，胃肠消化过程中总多酚的变化规律与总黄酮相似，但总体下降趋势较快，这说明在胃消化阶段黄酮类物质的稳定性优于多酚类物质。胃消化2 h后，由于酸性环境对于酚类物质的稳定具有一定作用，使得发酵组的总多酚含量为对照组的1.27倍。在肠消化2 h后，由于胰酶和胆汁作用，使蛋白质与多酚之间的共价键断裂，释放出更多的自由酚类物质，消化后期酚类物质出现不稳定降解，发酵组总多酚含量为对照组的1.23倍[25]。消化结束后，对照组总多酚含量较胃消化0 h下降了3.01%，发酵组总多酚含量上升了2.21%。胃肠消化过程中总黄酮含量的变化规律与总多酚类似，但总黄酮含量变化幅度较小，这说明黄酮类物质在模拟胃肠液中较稳定。
图3 枸杞南瓜粉在体外模拟胃肠消化过程中总黄酮（A）及总多酚（B）含量的变化
Fig.3 Changes of total flavones(A)and total polyphenols(B)contents in L.barbarum pumpkin powder during simulated gastrointestinal digestion in vitro
不同小写字母表示差异显著（P＜0.05）。
2.2.2 抗氧化活性变化
枸杞南瓜粉在体外模拟胃肠消化过程中抗氧化活性的变化结果见图4。由图4可知，在体外模拟胃肠消化实验中抗氧化活性在消化0.5 h出现显著差异（P＜0.05）。在胃消化阶段，0.5 h后自由基清除率出现显著降低（P＜0.05），随后逐渐稳定，胃消化结束后对照组ABTS+、DPPH、羟自由基清除率分别下降了9.09%、7.48%、6.17%，发酵组ABTS+·、DPPH·、羟自由基清除率分别下降了8.99%、3.45%、2.18%；发酵组抗氧化活性物质含量变化分别是对照组的1.27倍、1.17倍和1.12倍。这可能是由于酸性环境有利于抗氧化物质释放，也有可能是在酸性条件下多酚类和黄酮类物质发生不同程度的水解，与实验组的抗氧化物质变化呈现相关性。
图4 枸杞南瓜粉在体外模拟胃肠消化过程中抗氧化活性的变化
Fig.4 Changes of antioxidant activities of L.barbarum pumpkin powder during simulated gastrointestinal digestion in vitro
肠消化2 h后，发酵组抗氧化活性物质含量变化分别是对照组的1.25倍、1.14倍和1.13倍；肠消化4 h后，对照组ABTS+、DPPH、羟自由基清除率分别下降了4.18%、5.04%、7.59%，发酵组ABTS+、DPPH、羟自由基清除率分别下降了2.09%、2.92%、3.45%；变化趋势与总多酚、总黄酮含量变化相似，呈现先升后降的趋势，且肠消化阶段抗氧化物质的清除率明显高于胃消化阶段，这说明抗氧化活性物质的清除率与总多酚、总黄酮含量呈现正相关。
在整个消化阶段，ABTS+·清除率对照组、发酵组分别上升了0.14%、2.96%；DPPH·清除率对照组下降了0.72%、发酵组上升了1.73%；羟自由基清除率对照组下降了4.61%、发酵组上升了4.74%，综上表明枸杞南瓜粉发酵组的生物利用率高于对照组。
3 结论
单因素试验及响应面试验优化喷雾干燥工艺为进口热风温度160 ℃，进料流量7.5 mL/min，脱脂乳粉添加量2.5%；此时所得枸杞南瓜粉集粉率达40.3%，感官评分89.3分。通过对最佳工艺条件下的枸杞南瓜粉的体外模拟胃肠消化研究分析发现，消化结束后测得发酵组消化液中总多酚、总黄酮含量分别上升了2.21%、6.35%，ABTS+·、DPPH·、羟自由基清除率分别为58.26%、86.43%、70.98%，显著高于对照组（P＜0.05），且肠消化阶段的抗氧化能力显著高于胃消化阶段（P＜0.05）。这表明发酵枸杞南瓜粉在酶和胆汁的作用下总多酚、总黄酮得到充分释放、整体抗氧化能力得到提高，有利于调节人体胃肠道消化进程、增大对样品大分子物质的生物利用率。
[1]冯琳.发酵枸杞汁的制备及解酒护肝功能的评价[D].无锡：江南大学，2021.
[2]刘倩，余意，梁琰，等.枸杞子活性成分及分析方法研究进展[J].辽宁中医药大学学报，2018，20（11）：56-59.
[3]李永盛，王茂鹤，刘建飞，等.枸杞多糖对乙醇诱导肝细胞损伤的保护作用研究[J].天然产物研究与开发，2020，32（4）：549-556.
[4]韩永红，刘兴祥.枸杞多糖促进大鼠肝癌组织细胞的凋亡[J].现代食品科技，2020，36（2）：7-11.
[5]李龙龙，周亚兰，高丽娟，等.补肾药抗抑郁的研究进展[J].中医研究，2020，33（8）：73-77.
[6]程爱佳，李光华，韩梅.枸杞多糖对坐骨神经损伤小鼠淋巴细胞增殖转化能力及血清IL-2与IL-12含量的影响[J].临床医学工程，2019，26（10）：1337-1338.
[7]袁晶，康三江，张海燕，等.5种不同益生菌发酵南瓜浆的发酵性能及抗氧化活性研究[J].食品安全质量检测学报，2021，12（19）：7732-7737.
[8]KIM M Y,KIM E J,KIM Y N,et al.Comparison of the chemical compositions and nutritive values of various pumpkin (Cucurbitaceae) species and parts[J].Nutr Res Pract,2012,6(1):21-27.
[9]王燕，车振明.南瓜的功能特性及其深加工[J].食品研究与开发，2005，26（3）：7-10.
[10]MICHALAK M,KUBIK-KOMAR A,WAS′KO A,et al.Starter culture for curly kale juice fermentatio n selected using principal component analysis[J].Food Biosci,2020,35:100602.
[11]范方宇，杨宗玲，李晗，等.喷雾干燥条件对果蔬粉加工特性影响研究进展[J].食品研究与开发，2020，41（9）：169-176.
[12]张璐，梁锦，黄天姿，等.单一及混合益生菌发酵猕猴桃果汁的香气成分分析[J].食品科学，2021，42（24）：213-220.
[13]张振民，方海田，刘慧燕，等.益生菌发酵枣粉喷雾干燥条件的优化[J].中国酿造，2022，41（1）：180-185.
[14]姜瑞.蓝莓枸杞发酵果汁的研制及其功能性评价[D].哈尔滨：东北农业大学，2021.
[15]汪瑞敏，杨娜，李博岩，等.不同乳酸菌发酵的黄秋葵汁液在模拟体外消化过程中总多酚及抗氧化活性的变化[J].食品研究与开发，2021，42（21）：13-21.
[16]中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会，国家食品药品监督管理总局.GB 4789.2—2016 食品安全国家标准 食品微生物学检验菌落总数测定[S].北京：中国标准出版社，2016.
[17]于淑艳.速溶枸杞粉的加工工艺研究[D].天津：天津科技大学，2014.
[18]LIN X H,LIN Z,LI T,et al.Phenolic content,antioxidant and antiproliferative activities of six varieties of white sesame seeds(Sesamum indicum L.)[J].RSC Adv,2017,7(10):5751-5758.
[19]陈希苗，李美英，许秋莉，等.体外模拟胃肠消化中山楂多酚及抗氧化活性的变化[J].食品科学，2019，40（5）：31-37.
[20]ARISE A K,ALASHI A M,NWACHUKWU I D,et al.Antioxidant activities of bambara groundnut (Vigna subterranea) protein hydrolysates and their membrane ultrafiltration fractions[J].Food Funct,2016,7(5):2431-2437.
[21]何坤明，王国锭，白新鹏，等.山茱萸籽多糖分离纯化、结构表征及抗氧化活性[J].食品科学，2021，42（19）：81-88.
[22]王磊，兰玉倩，林奇.喷雾干燥工艺对板栗粉速溶性的影响[J].食品科学，2010，31（2）：106-109.
[23]胡义东.体外模拟消化条件下芒果抗氧化活性的变化研究[D].南宁：广西大学，2014.
[24]黄宁馨.复合乳酸菌发酵枸杞汁的工艺优化及其营养品质变化研究[D].武汉：华中农业大学，2021.
[25] BOUAYED J,HOFFMANN L,BOHN T.Total phenolics,flavonoids,anthocyanins and antioxidant activity following simulated gastro-intestinal digestion and dialysis of apple varieties:Bioaccessibility and potential uptake[J].Food Chem,2011,128(1):14-21.