酱香大曲是酱香型白酒生产所需的糖化发酵剂，在酿造过程中起到糖化、生香及投料等作用[1]。目前，大部分企业生产酱香大曲仍然秉承传统酿造工艺，即人工踩曲，其生产成本高，生产效率较低。随着科技进步，机械化酿造酱香型白酒已成为发展趋势，发展安全高产的机械化酿造模式势在必行。酱香型白酒机械化生产多集中在高温制曲工艺环节，传统酱香大曲是将曲料倒入模具中，经人工踩制而成。机械仿生压曲采用自动控制系统，对曲块压制成型进行实时监控[2]。传统人工踩曲与机械仿生压曲两种不同的压曲工艺生产的酱香大曲中的微生物种类、理化指标以及发酵性能存在差异[3]。有研究表明，不同压曲工艺大曲的特性影响白酒的品质，因此，解析其中微生物群落和理化指标有助于评价酱香大曲品质，并对酱香型白酒机械化酿造发展具有重要意义[4-6]。
基于基因组学技术直接研究其中微生物群落的全部微生物，无需分离单菌株，从而打破了大部分酿造微生物不可培养引起的对微生物群落片面化的研究局面[7]。相比于第一代测序技术成本高、速度慢、通量低，第二代测序技术通量较高，但读长短，仅为30～450 bp，且扩增易发生错配。第三代测序技术是一种具有成本低、速度快、通量高及读长长等优点的测序技术[7]。目前，常见的第三代测序技术为Oxford Nanopore的纳米孔单分子、单分子脱氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）测序、单分子实时测序技术[8]。Oxford Nanopore纳米孔单分子技术解链与测序同时进行，该技术的核心为核酸外切酶与α-溶血素纳米孔相耦合，且为保证监测到每个碱基，需控制碱基穿过5 nm的纳米孔的速度在1核苷酸/ms[9]。该技术特点是无需聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）扩增，避免碱基发生替换、偏置，且随着测序深度增加及更正软件的使用准确率可达到99.9%[10]。
本研究采用纳米孔单分子测序技术分析不同压曲工艺酱香大曲中微生物群落结构，结合理化指标评价机械仿生压曲与传统人工踩曲成品曲的品质，以期掌握更多酱香型白酒中的微生物信息，为推进机械化生产酱香型白酒奠定理论基础。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
1.1.1 材料
机械仿生压曲AQ、传统人工踩曲MQ：贵州省赤水河流域某酒厂成品曲（贮存时间为6个月）。取样时间为2022年1月，该酒厂制曲车间中3个曲仓中成品曲各一块，粉碎混合后用四分法进行缩分取样，备用。
1.1.2 试剂
氢氧化钠（分析纯）：天津大茂化学试剂厂；硫酸（分析纯）：川东化工集团；己酸、乙醇、乙酸（均为分析纯）：上海沪试实验室器材股份有限公司；乙酸钠（分析纯）：南京化学试剂股份有限公司；DNA提取试剂盒：美国Zymo Research BIOMICS公司；MegaFi Fidelity DNA Polimerase：加拿大Applied Biological Materials Inc公司；其他试剂均为国产分析纯。
1.2 仪器与设备
FA1204N电子天平：上海菁海仪器有限公司；DHG-9140A电热恒温鼓风干燥箱、HH-8J数显恒温水浴锅：常州润华电器有限公司；DK-98-Ⅱ电炉：天津市泰斯特仪器有限公司；YXQ-LS-100SII立式压力蒸汽灭菌锅：上海博讯医疗股份有限公司；BCD-640WAGM冷藏柜：青岛海尔股份有限公司。
1.3 方法
1.3.1 不同压曲工艺酱香大曲理化特性分析
按照QB/T 4257—2011《酿酒大曲通用分析方法》[11]对酱香大曲的水分含量、酸度、糖化力和淀粉含量进行测定。
1.3.2 不同压曲工艺酱香大曲微生物群落的高通量测序
机械仿生压曲、传统人工踩曲两种压曲工艺的酱香大曲样品送至成都罗宁生物科技有限公司，使用DNA提取试剂盒提取样品中的DNA，以其为模板，采用引物ITS1（5'-GGTCATTTAGAGGAAGTAA-3'）和ITS4（5'-AGCCTSCSCTTANTDATATGC-3'）PCR扩增真菌内源转录间隔区（internally transcribed spacer，ITS）基因序列；采用引物8F（5'-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3'）和1492R（5'-CGGTTACCTTGTTACGACTT-3'）PCR扩增细菌的16S rDNA区域基因序列。真菌PCR扩增体系：5×MegaFi Buffer 5 μL，10 mmol/L脱氧核糖核苷酸三磷酸（deoxy-ribonucleoside triphosphate，dNTPs）0.5 μL，GSS Depletion Mix 2 μL，上游引物ITS3 1 μL，下游引物ITS4 1 μL，DNA模板2 μL，MegaFi DNA polymerase 0.5 μL，超纯水13 μL。细菌PCR扩增体系：5×MegaFi Buffer 5 μL，10 mmol/L dNTPs 0.5 μL，上游引物8F 1 μL，下游引物1492R 1 μL，DNA模板2 μL，MegaFi DNA polymerase 0.5 μL，超纯水15 μL。PCR扩增程序：98 ℃预变性30 s；98 ℃变性5 s，54 ℃退火15 s，72 ℃延伸45 s，共25～30个循环；72 ℃再延伸2 min；4 ℃保温。PCR扩增产物纯化后用1%的琼脂糖凝胶电泳检测，每个样本进行3次重复，取线性期PCR产物等量混合后建库。采用MinION Flow Cell测序试剂盒、Nanopore GridION Mk1测序仪测序。
1.3.3 高通量测序数据处理与分析
高通量测序所得序列通过使用NanoFilt去除、过滤掉低质量序列，基于Uchime算法和gold数据库去除嵌合体，得到有效数据（effiective tag）。使用生信物种注释软件Kraken2（http：//ccb.jhu.edu/software/kraken2/）对每一条序列进行物种注释，并统计物种数目。基于UNITE数据库（8.2）和SILVA数据库（138）进行基因序列比对和注释分析。使用Kraken2软件进行k-mer比对算法，直接进行物种注释：首先将序列切成若干k-mer；再将k-mer比对到物种分类数据库上获得其最低共同祖先（lowest common ancestor，LCA）；最后将相同的种，即操作分类单元（operational taxonomic unit，OTU）进行合并统计，本研究沿用第二代测序以OTU作为一类高相似性序列集合的描述方式，但每个OTU对应每个种。使用R语言（3.6.0）对样品Alpha多样性指数进行分析，用于衡量Alpha多样性的指标主要有Chao1指数、Shannon指数和Simpson指数。Chao1指数用于衡量样本中物种的丰度，其数值与样本物种总数成正比[12]。Shannon和Simpson指数用于综合衡量样本物种多样性[13]，其数值越大代表群落多样性越高。
2 结果与分析
2.1 不同压曲工艺酱香大曲理化特性分析
酱香大曲主要起到糖化、发酵、投粮和增香等作用[14]。生产实践中，酱香大曲的酸度、糖化力、水分和淀粉含量常作为重要的理化指标，用于衡量大曲品质[15]。大曲酸度应在0.10～0.35 mmol/g范围，适宜的酸度能够抑制杂菌生长，并为酯化反应提供前体物质[16]。酸度主要受产酸微生物代谢、脂肪与蛋白质水解程度影响，酸度过高或过低均不利于酿造微生物生长繁殖[15]。糖化力指大曲中的淀粉酶将酿造原料中的淀粉水解为可发酵性糖类的能力，糖化力过高淀粉水解率增加，可能导致堆子升温增快，从而不利于发酵，糖化力应为（100～300）U[16]。酱香大曲水分含量需＜13%，既要保证微生物生长繁殖，又要避免因水分含量过高导致大曲发霉变质[14]。地方标准DB52/T 871—2014《酱香型白酒酿酒用大曲》中规定酱香大曲中淀粉含量应为53%～60%，大曲中淀粉在酱香型白酒多轮次发酵中起投粮作用[16]。不同压曲工艺酱香大曲的理化指标见表1。
表1 不同压曲工艺酱香大曲的理化指标
Table 1 Physicochemical indexes of sauce-flavor Daqu with different molding processes
注：不同字母表示差异显著（P＜0.05）。
由表1可知，不同压曲工艺酱香大曲样品的水分含量、酸度与淀粉含量均符合地方标准DB52/T 871—2014《酱香型白酒酿酒用大曲》[16]。传统人工踩曲MQ水分含量显著高于机械仿生压曲AQ（P＜0.05），大曲水分含量越高越不易贮存；机械仿生压曲AQ的糖化力和淀粉含量均显著高于传统人工踩曲MQ（P＜0.05），机械仿生压曲AQ能够起到更好的糖化作用和投粮作用；机械仿生压曲AQ的酸度略低于传统人工踩曲MQ，分别为2.3 mmol/g、3.0 mmol/g，但无显著差异（P＞0.05）。综上所述，通过机械仿生压曲制备的酱香大曲AQ品质优于传统人工踩曲的酱香大曲MQ。
2.2 不同压曲工艺酱香大曲微生物菌群测序结果分析
从不同压曲工艺酱香大曲样品中提取基因组DNA后，分别对ITS（16S rDNA）区基因序列进行测序，通过双端拼接、过滤嵌合体后共获得70 826条（45 631条）有效序列，平均碱基长度为525 bp（1 379 bp）。基于检测到的菌种绘制韦恩图，结果见图1。由图1a可知，不同压曲工艺酱香大曲样品共有63个真菌菌种，机械仿生压曲AQ样品特有菌种为4个，序列数之和在总菌种的序列数中所占的比例为0.03%，传统人工踩曲MQ中真菌菌种在机械仿生压曲AQ样品中均存在。由图1b可知，不同压曲工艺酱香大曲样品中共有272个细菌菌种，机械仿生压曲AQ和传统人工踩曲MQ样品特有细菌菌种分别为29个和26个，这些菌种的序列数之和在总菌种的序列数中所占的比例分别为0.18%、0.17%。结果表明，机械仿生压曲AQ样品中微生物菌种数多于传统人工踩曲MQ样品，且具有传统人工踩曲MQ样品中的所有真菌菌种。
图1 不同压曲工艺酱香大曲样品真菌（a）及细菌（b）菌群的韦恩图
Fig.1 Venn diagram of fungal (a) and bacterial (b) flora in sauceflavor Daqu samples with different molding processes
为了探索样本物种丰富度随测序深度的变化趋势，从不同压曲工艺酱香大曲样品中随机抽取一定数量序列数与序列所代表的物种数目，以抽取的一系列序列数和相应的物种数绘制稀释曲线，结果见图2。
图2 不同压曲工艺酱香大曲的物种数稀释曲线
Fig.2 Dilution curve of species number of sauce-flavor Daqu with different molding processes
a：真菌；b：细菌。
由图2可知，机械仿生压曲AQ和人工踩曲MQ样品的稀释曲线前期急剧上升，随着抽取序列数的增加后趋于平缓。结果表明，前期随着抽取序列数的增加，检出大量物种；当抽检数量达到15 000条序列后，物种不再随测序数量增加而显著增加，表明样本测序量充分，测序结果能真实反映不同压曲工艺酱香大曲的微生物多样性。
2.3 不同压曲工艺酱香大曲微生物菌群多样性分析
不同压曲工艺酱香大曲样品微生物菌群的Alpha多样性分析结果分别见表2及表3。由表2及表3可知，各酱香大曲样本的Coverage数值均＞0.999，说明测序结果能够真实的反映样品物种丰度及物种多样性[17]。在不同压曲工艺酱香大曲样品真菌和细菌菌群Alpha多样性指数中，机械仿生压曲AQ样品的Chao1指数、Shannon指数和Simpson指数均较高，说明机械仿生压曲AQ中物种分布较传统人工踩曲MQ更均匀、菌群多样性更高。
表2 不同压曲工艺酱香大曲样品真菌菌群的Alpha多样性分析结果
Table 2 Alpha diversity analysis results of fungal flora of sauceflavor Daqu samples with different molding processes
表3 不同压曲工艺酱香大曲样品细菌菌群的Alpha多样性分析结果
Table 3 Alpha diversity analysis results of bacterial flora of sauceflavor Daqu samples with different molding processes
2.4 不同压曲工艺酱香大曲微生物群落结构分析
从机械仿生压曲AQ与传统人工踩曲MQ酱香大曲样品中共检测到63个真菌种，其中，相对丰度＞0.1%的真菌菌种见图3a。由图3a可知，两种大曲样品中相对丰度较高的菌种均为烟曲霉（Aspergillus fumigatus）（0.34%；0.46%）、微皱篮状菌（Talaromyces rugulosus）（0.16%；0.15%）、米曲霉（Aspergillus oryzae）（0.19%；0.10%）。传统人工踩曲MQ酱香大曲样品中检出的真菌均在机械仿生压曲AQ酱香大曲样品中检出。
从机械仿生压曲AQ与传统人工踩曲MQ酱香大曲样品中共检测到272个细菌种，相对丰度排前20的细菌菌种见图3b。由图3b可知，两样品中相对丰度排前10的物种均为丁香假单胞菌（Pseudomonas syringae）（7.22%；6.78%）、绿针假单胞菌（Pseudomonas chlororaphis）（3.90%；4.38%）、恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida）（3.92%；4.00%）、假单胞杆菌（Pseudomonas sp.）CC6-YY-74（3.12%；3.18%）、防御假单胞菌（Pseudomonas protegens）（2.70%；2.47%）、沼泽红假单胞菌（Rhodopseudomonas palustris）（2.12%；2.56%）、荧光假单胞菌（Pseudomonas fluorescens）（2.15%；2.20%）、铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）（2.11%；2.00%），Pseudomonas silesiensis（1.87%；1.89%），贪噬菌属（Variovorax sp.）PMC12（2.04%；1.70%）。机械仿生压曲AQ酱香大曲样品中特有的相对丰度较高（相对丰度＞0.02%）的细菌种为普通拟杆菌（Bacteroides vulgatus）、Pseudomonas cerasi和人类产碱菌（Paenalcaligenes hominis）；传统人工踩曲MQ酱香大曲样品中特有的相对丰度较高（相对丰度＞0.02%）的细菌种为魏格沃斯菌（Wigglesworthia glossinidia）、发酵氨基酸球菌（Acidaminococcus fermentans）和Alteromonas australica。
图3 基于种水平上不同压曲工艺酱香大曲样品的微生物群落结构
Fig.3 Microbial community structure of sauce-flavor Daqu samples with different molding processes based on the species level
a：真菌；b：细菌。
3 讨论
酱香型大曲的糖化力是保证酱香型白酒“多轮次”取酒和确保酒质稳定的关键，糖化力在300 U以下时，糖化力越高且淀粉含量高代表大曲能够将更多的淀粉水解为能够被微生物利用的可发酵性糖类[17]。酱香大曲的糖化力高低与大曲中微生物群落结构息息相关[18]，酱香大曲微生物群落结构相关研究证实曲霉属（Aspergillus）是酱香大曲中种类最为丰富的霉菌，可产生淀粉酶、糖化酶和纤维素酶等水解酶类[19-22]，糖化微生物的结构与酱香大曲中糖化力相关[23-25]。本研究结果表明，传统人工踩曲MQ与机械仿生压曲AQ中相对丰度较高的真菌种均为曲霉属（Aspergillus），包括烟曲霉（Aspergillus fumigatus）和米曲霉（Aspergillus oryzae），其中Aspergillus fumigatus具有较高的纤维素降解能力[26]，Aspergillus oryzae在酱香型白酒发酵过程中被证实为糖化菌株[27]。机械仿生压曲AQ的糖化力高于传统人工制曲，该结果与机械仿生压曲AQ中物种分布更均匀、菌群多样性更高相关。
4 结论
本研究采用第三代测序技术分析对比不同压曲工艺酱香大曲的微生物群落结构，并以理化指标为依据对比分析了不同压曲工艺酱香大曲品质。传统人工踩曲MQ水分含量显著高于机械仿生压曲AQ（P＜0.05）；机械仿生压曲AQ的糖化力和淀粉含量显著高于传统人工踩曲MQ（P＜0.05），机械仿生压曲AQ的酸度与传统人工踩曲MQ相近（P＞0.05），综合来看，机械仿生压曲AQ的糖化与投粮作用优于传统人工踩曲MQ，且机械仿生压曲AQ水分含量较低更易贮存。
不同压曲工艺酱香大曲样品中共发现63个真菌和272个细菌菌种，机械仿生压曲AQ样品特有菌种为4个，其余59种真菌在传统人工踩曲MQ与机械仿生压曲AQ样品中均被检出。机械仿生压曲AQ和传统人工踩曲MQ样品特有细菌菌种分别为29个和26个。在Alpha多样性指数中，机械仿生压曲AQ样品的Chao1指数、Shannon指数和Simpson指数均较高。机械仿生压曲AQ中物种分布较为均匀、检测出物种总数较高，且真菌与细菌群落多样性和总数均高于传统人工踩曲MQ。通过在UNITE和SILVA分类学数据库比对，在不同压曲工艺酱香大曲样品中鉴别出相对丰度较高的真菌种均为烟曲霉（Aspergillus fumigatus）、微皱篮状菌（Talaromycesrugulosus）和米曲霉（Aspergillusoryzae）；相对丰度较高的细菌种均为丁香假单胞菌（Pseudomonassyringae）、绿针假单胞菌（Pseudomonas chlororaphis）、恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida）、假单胞杆菌（Pseudomonas sp.）CC6-YY-74、防御假单胞菌（Pseudomonas protegens）、沼泽红假单胞菌（Rhodopseudomonas palustris）、荧光假单胞菌（Pseudomonas fluorescens）、铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）、Pseudomonas silesiensis、贪噬菌属（Variovorax sp.）PMC12。综合理化指标和微生物群落结构结果，机械仿生压曲AQ的品质要高于传统人工踩曲MQ。
基于第三代测序技术与理化指标测定，初步掌握不同压曲工艺酱香大曲中微生物菌种概况，对比分析机械仿生压曲与传统人工踩曲生产的酱香大曲品质。进一步将开展不同压曲工艺酱香大曲中微生物组学与酶学、风味组的相关性研究，并为微生物资源开发利用奠定理论基础。
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