新疆葡萄酒产能过剩，脱醇葡萄酒、葡萄烈酒的消费群体日益增加，脱醇葡萄酒是用葡萄原料经发酵后，采用特殊加工方式加工而成的酒精度低于0.5%vol的葡萄酒，葡萄烈酒是以葡萄或葡萄汁为原料经过发酵、蒸馏、贮藏而制成的一种酒精饮料。高年发等[1]采用分子蒸馏法将葡萄酒进行加工制成脱醇葡萄酒及酒精。但对脱醇葡萄酒、葡萄烈酒的安全性并未进行研究。
葡萄酒在发酵过程中可能会产生氨基甲酸乙酯，这种物质可以导致肺癌、肝癌、淋巴癌等致命性疾病[2-4]。赭曲霉毒素A含量高低主要与葡萄原料是否被真菌感染有关，葡萄原料从种植到生长再到采摘运输都要十分注意[5-6]。生物胺是一种低分子质量的有机化合物，是植物的内源性物质，具有重要的生理功能。在一定浓度下，生物胺可能会导致头痛、皮肤刺激、心跳加快、高血压和低血压、呕吐和神经障碍[7-9]。
反渗透、渗透蒸馏、渗透汽化等膜工艺可以获得低度葡萄酒。这些过程可以在低温下进行，将对葡萄酒的热影响降至最低，然而，在渗透蒸馏过程中，水不断添加到滞留物中，这是欧盟委员会法规严格禁止的。渗透汽化法通过膜的选择透过性达到料液分离。组分的分离基于单个组分通过膜的传输速率的差异，可以用溶液扩散模型来解释[10-11]。
渗透汽化是一种新型的膜分离技术。按功能分渗透汽化膜有亲水膜和亲有机物膜，大部分葡萄酒行业生产脱醇葡萄酒的是亲有机物膜[12]。CARTWRIGHT P等[14]在实验室规模上研究了渗透蒸发法从石榴汁中回收挥发性芳香化合物[13]。渗透汽化生产脱醇酒和葡萄烈酒具有许多优点，例如高选择性、低操作温度和最小的芳香化合物损失。此外，它产生的废料要少得多。
为保证渗透汽化膜生产脱醇葡萄酒、葡萄烈酒的安全性，本研究主要检测干红葡萄酒原酒、一级6 h、9 h、12 h停留液（脱醇葡萄酒样品）、二级6 h、9 h、12 h渗透液（葡萄烈酒样品）中氨基甲酸乙酯、赭曲霉毒素A、生物胺、甲醇等安全性指标，探究脱醇过程中脱醇葡萄酒、葡萄烈酒各安全性指标的变化，探究其变化趋势，为提升脱醇葡萄酒、葡萄烈酒的安全性提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
干红葡萄酒（100%赤霞珠酿造）：新疆中信国安葡萄酒业有限公司；D5-氨基甲酸乙酯标准品（纯度＞98%）、氨基甲酸乙酯标准品（分析纯）：北京安捷飞科技有限公司；组胺盐酸盐、β-苯乙胺盐酸盐、酪胺盐酸盐、腐胺盐酸盐、尸胺盐酸盐、色胺盐酸盐、亚精胺盐酸盐、章鱼胺盐酸盐、1,7-二氨基庚烷和精胺盐酸盐（均为分析纯）：上海纯优生物科技有限公司；叔戊醇（分析纯）：山东省越兴化工有限公司；赭曲霉毒素A（分析纯）：上海飞测生物科技有限公司。
1.2 仪器与设备
聚二甲基硅氧烷（polydimethylsiloxane，PDMS）商用复合膜：中国南京久思高科技公司；himadzu GCMS-TQ8040NX岛津气相色谱-质谱联用仪、Shimadzu LC40岛津高效液相色谱仪、ShimadzuGC-2030岛津气相色谱仪：日本岛津公司。
1.3 方法
1.3.1 渗透汽化法制备脱醇酒
渗透汽化法制备脱醇酒工艺流程如下：
第一阶段：利用PDMS分离膜，将赤霞珠干红原酒在合适的温度和分离时间条件下进行分离，酒精、部分水及挥发性香气成分透过膜富集，在低真空状态下汽化，通过冷凝收集得到酒精度明显提升的渗透液，未透过膜的一侧原料，酒精度不断降低，葡萄中的酚类物质、有机酸等被浓缩，最终可制得酒精度在0.5%vol以下的脱醇酒基酒（一级停留液）。进料温度：45 ℃；运行时间：12 h；原料循环泵流量为48 m3/h；膜上游侧原料循环系统压力≤0.3 MPa；膜下游真空系统压力为5 kPa；载冷剂温度：-15～-10 ℃。
第二阶段：继续利用分离膜，对第一阶段的渗透液进行分离，未透过膜的一侧得到酒精度在1.0%vol以下的脱醇液，膜的透过侧最终富集得到高酒精度的葡萄烈酒（二级渗透液）。进料温度：45 ℃；运行时间：12 h；原料循环泵流量为20 m3/h；膜上游侧原料循环系统压力≤0.3 MPa；膜下游真空系统压力为2 kPa；载冷剂温度：-15～-10 ℃。
在第一阶段和第二阶段6 h、9 h、12 h分别取样留作备用。
1.3.2 安全性指标检测
分别测定第一阶段6 h、9 h、12 h停留液和第二阶段6 h、9 h、12 h渗透液中氨基甲酸乙酯、生物胺、甲醇、赭曲霉毒素A以及Fe3+、Cu2+的含量。
（1）氨基甲酸乙酯的检测
采用气相色谱-质谱联用仪法测定：SH-Rtx-Wax色谱柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm），进样量1 μL，柱温为开始55 ℃，持续1.5 min，逐渐提升到180 ℃，系统运行平稳后，温度提升到240 ℃；流速0.8 mL/min。进样口温度215 ℃；载气为高纯度氦气（He）（纯度≥99.999%）。
（2）生物胺的检测
采用液相色谱法测定：色谱柱为C18柱（250 mm×4.6mm，5 μm），检测波长254 nm，进样量20 μL，柱温35 ℃，流动相A为90%乙腈、10%（含0.1%乙酸的0.01 mol/L乙酸铵溶液），流动相B为10%乙腈、90%（含0.1%乙酸的0.01 mol/L乙酸铵溶液），流速0.8 mL/min。
（3）甲醇的测定
采用液相色谱法测定：HJ-FFAP色谱柱（30 m×0.32 mm，0.5 μm），载气流量1.0 mL/min，进样量10 μL，色谱柱温度为初温35 ℃，保持1 min，以4.0 ℃/min升到125 ℃，以20 ℃/min升到195 ℃，保持5 min；检测器温度245 ℃，进样口温度245 ℃，分流比：20∶1。
（4）赭曲霉毒素A的检测
采用液相色谱法测定：Agilent TC-C18色谱柱（145 mm×4.5 mm，5 μm），检测波长222 nm，激发波长325 nm，发射波长455 nm；进样量10 μL，柱温30 ℃。
（5）Fe3+、Cu2+检测法
采用莫燕霞等[15]的检测方法。
1.3.3 数据分析
采用Excel 2016、SPSS Statistics 26.0、Origin9.5.0进行数据分析。
2 结果与分析
2.1 理化指标结果分析
3种样品的基本理化指标见表1。由表1可知，脱醇葡萄酒的总糖含量较干红葡萄酒原酒显著上升（P＜0.05），总酸含量较干红葡萄酒原酒显著上升（P＜0.05），pH较干红葡萄酒原酒显著下降（P＜0.05），酒精度较干红葡萄酒原酒显著下降（P＜0.05），葡萄烈酒总酸含量较干红葡萄酒原酒显著下降（P＜0.05），pH较干红葡萄酒原酒显著上升（P＜0.05），酒精度较干红葡萄酒原酒显著上升（P＜0.05），因为PDMS膜对酒精的透过率较高、对酸类物质的透过率较低，因此在脱醇葡萄酒中酸度较高、酒精度较低，在葡萄烈酒中酸度较低、酒精度较高。
表1 3种酒样的基本理化指标
Table 1 Basic physicochemical indexes of three wine samples
注：同列不同字母代表差异显著（P＜0.05）。下同。
2.2 氨基甲酸乙酯含量分析
本研究所采用贮藏一年的干红葡萄酒原酒酒样，测定不同时间段的氨基甲酸乙酯含量变化，结果见图2。
由图2可知，在一级系统中，一级6 h、9 h、12 h停留液中的氨基甲酸乙酯含量呈上升趋势，上升幅度较小，在二级系统中随着样品酒精度的不断提高，二级6 h、9 h、12 h渗透液中的氨基甲酸乙酯含量呈下降趋势，这说明了PDMS复合膜对氨基甲酸乙酯的透过率极低。国际规定葡萄酒中氨基甲酸乙酯浓度不得超过20 μg/L，其他国家也制订了相应标准限量：德国和法国规定葡萄酒中氨基甲酸乙酯的含量不得超过30 μg/L和15 μg/L[16-17]，本研究中脱醇葡萄酒中氨基甲酸乙酯含量小于4 μg/L，葡萄烈酒的氨基甲酸乙酯含量小于1 μg/L，均远低于以上几种标准。
图2 经渗透膜处理不同阶段酒样中氨基甲酸乙酯含量变化趋势
Fig.2 Change trend of urethane content in wine samples of different stages with permeable membrane treatment
2.3 生物胺含量分析
在葡萄汁还未发酵时，甲胺、已胺、苯乙胺等物质就存在于葡萄汁中。在一次发酵过程中这些物质可被微生物降解，在二次发酵中乳酸菌将葡萄酒中的氨基酸脱羧，在这个过程中会产生组胺、酪胺、腐胺等生物胺，其中组胺、酪胺对人体健康有较大伤害。在酒类饮品中，由于乙醇可以抑制酶对生物胺的解毒作用，国家及葡萄酒企业对葡萄酒中生物胺的监管力度越来越大[18-21]。该研究对经渗透膜处理的不同阶段酒样的生物胺含量进行测定，结果见表2。
表2 不同阶段酒样中的生物胺含量
Table 2 Bioamines contents in wine samples of different stages mg/L
由表2可知，在二级系统中，只有二级6 h渗透液含有微量的色胺与苯乙胺，不含有其他种类的生物胺，在一级系统中，一级6 h、9 h、12 h停留液生物胺总量逐渐上升，在干红葡萄酒原酒中腐胺、尸胺含量分别为4.80 mg/L、1.67mg/L，在脱醇葡萄酒中腐胺、尸胺含量分别为15.19 mg/L、4.47 mg/L，干红葡萄酒原酒中的酪胺、苯乙胺、组胺含量分别为0.33 mg/L、1.11 mg/L、1.77 mg/L，脱醇葡萄酒中酪胺、苯乙胺、组胺含量分别为2.72 mg/L、3.22 mg/L、4.70 mg/L，大部分生物胺都保留在脱醇葡萄酒中，葡萄烈酒中的生物胺的含量基本趋于零，这可能是由于生物胺属于大分子物质，PDMS膜对生物胺的透过率极低。
2.4 赭曲霉毒素A含量分析
赭曲霉毒素是霉菌中某些曲霉属和青霉属菌种产生的有毒代谢产物，其中，赭曲霉毒素A是最常见且毒性最大的，对人类和动物健康影响极大[22]，经渗透膜处理的不同阶段酒样中赭曲霉毒素A含量的测定结果见图3。
图3 不同阶段酒样中赭曲霉毒素A含量变化趋势
Fig.3 Variation trend of ochrechrotoxin A content in wine samples at different stages
由图3可知，相较于干红葡萄酒原酒中的赭曲霉毒素A含量，脱醇葡萄酒中的赭曲霉毒素A含量在脱醇6 h、9 h到完全脱醇呈上升趋势，脱醇葡萄酒中赭曲霉毒素A含量最多，但含量未超过0.6 mL/L。中国食品安全国家标准GB 2761—2017《食品中真菌毒素限量》中赭曲霉毒素A限量标准定为2 μg/kg[23]，本研究中脱醇葡萄酒的赭曲霉毒素A的含量较原酒有所提升但均小于0.6 μg/kg，葡萄烈酒中的赭曲霉毒素含量处于0.1 μg/kg左右，均远低于相关标准。
2.5 甲醇含量分析
甲醇是葡萄酒中的有害物质，人体摄入过量甲醇会对人体健康造成极大的危害，在蒸馏酒中的甲醇含量较高，GB/T 15037—2006《葡萄酒》对红葡萄酒中甲醇限量有明确要求，含量≤400 mg/L，GB 2757—2012《食品安全国家标准蒸馏酒及其配制酒》规定了蒸馏酒中的甲醇含量≤2 g/L[24-26]。经渗透膜处理的不同阶段酒样中甲醇含量的变化趋势见图4。
由图4可知，相较于干红葡萄酒原酒中的甲醇含量，一级停留液中的甲醇含量呈逐渐下降趋势，脱醇完成的脱醇葡萄酒样品甲醇含量最低，在二级系统中二级渗透液中的甲醇含量呈上升趋势，富集结束的葡萄烈酒样品甲醇含量最高，但远低于国家相关规定。葡萄烈酒中甲醇含量较高可能是因为甲醇的分子质量较小，沸点较低，在渗透汽化的过程中大部分都透过PDMS膜进入到葡萄烈酒样品中，所以导致二级渗透液中甲醇含量逐渐升高，为进一步降低葡萄烈酒中的甲醇含量，可在干红葡萄酒原酒酿造的过程中使用降甲醇果胶酶，在源头将甲醇含量降低。
图4 不同阶段酒样中甲醇含量变化趋势
Fig.4 Variation trend of methanol content in wine samples at different stages
2.6 Fe3+和Cu2+含量分析
GB/T 15037—2006《葡萄酒》[24]对Fe3+及Cu2+有明确要求，Fe3+应小于8 mg/L，Cu2+应小于1 mg/L。当Fe3+含量大于8 mg/L，会引起葡萄酒的铁破败病；当Cu2+含量高于1 mg/L时，酒体可能会出现铜性混浊，影响酵母的活动并降低葡萄酒的质量[23]。酒处理过程中铁离子及铜离子含量的变化结果见图5。
图5 不同阶段酒样中铁离子及铜离子含量变化趋势
Fig.5 Variation trend of iron ion and copper ion content in wine samples at different stages
由图5可知，干红葡萄酒原酒中Fe3+含量远小于8 mg/L，Cu2+远小于1 mg/L，在一级系统中，脱醇结束的脱醇葡萄酒中的Fe3+、Cu2+含量相较于原酒有所提升，在二级系统中，二级6 h、9 h、12 h渗透液Fe3+、Cu2+含量下降。由于Fe3+、Cu2+在原酒中含量较低，在脱醇过程中还有部分进入PDMS膜的孔径中，所以在脱醇葡萄酒中Fe3+、Cu2+含量提升不明显，在葡萄烈酒中几乎无Fe3+、Cu2+含量，说明PDMS膜对Fe3+、Cu2+透过率极低。
3 结论
在脱醇葡萄酒中氨基甲酸乙酯、赭曲霉毒素A、生物胺、Fe3+、Cu2+均少量上升，甲醇含量呈下降趋势，在葡萄烈酒中氨基甲酸乙酯、赭曲霉毒素A、生物胺、Fe3+、Cu2+均有所下降，甲醇含量呈上升趋势，但所有指标均符合相关标准，说明PDMS复合膜对氨基甲酸乙酯、赭曲霉毒素A、生物胺、Fe3+、Cu2+透过率较低，对甲醇透过率较高，在保证脱醇葡萄酒的品质及安全性的前提下，进一步降低了葡萄烈酒中的有害物质含量。
[1]高年发，陈志頔，张健.无醇葡萄酒的研制[J].酿酒科技，2006（11）：48-50.
[2] HASNIP S,CREWS C,POTTER N,et al.Survey of ethyl carbamate in fermented foods sold in the United Kingdom in 2004[J]. J Agr Food Chem,2007,55(7):2755-2759.
[3]LEKIMYK,KOHE,CHUNG H J,et al.Determination of ethyl carbamate in some fermented Korean foods and beverages[J]. Food Add Contam,2019,17(6):469-475.
[4] ABREU S D M,ALVES A,OLIVEIRA B,et al.Determination of ethyl carbamate in alcoholic beverages：an interlaboratory study to compare HPLC-FLD with GC-MS methods[J].Anal Bioanal Chem,2015,382(2):498-503.
[5]BELLI N,MARIN S,DUAIGUES A,et al.Ochratoxin A in wines,musts and grape juices from Spain[J].J Sci Food Agr,2010,84(6):591-594.
[6]GÓMEZ C,BRAGULAT M R,ABARCA M L,et al.Ochratoxin A-producing fungi from grapes intended for liqueur wine production[J]. Food Microbiol,2006,23(6):541-545.
[7]SMIT A Y,DU TOIT M.Evaluating the influence of malolactic fermentation inoculation practices and ageing on lees on biogenic amine production in wine[J].Food Bioproc Technol,2013,6(1):198-206.
[8] LANDETE J M,FERRER S,PARDO I.Biogenic amine production bylactic acid bacteria,acetic bacteria and yeast isolated from wine[J]. Food Control,2017,18(12):1569-1574.
[9]KOMERL T,UUR S,PROSEN H.Biogenic amines in red wine:The impact of technological processing of grape and wine[J].Acta Agr Sloven,2013,101(2):249-261.
[10]黎进雪，吕泽，王伟雄，等.基于感官和GC-IMS分析传统高温蒸馏和渗透汽化膜分离技术对无核白葡萄烈酒香气物质的影响[J/OL].食品与发酵工业：1-10.[2022-12-20].DOI：10.13995/j.cnki.11-1802/ts.031490.
[11]王轶文，单衍雪，刘丙萍.膜分离技术研究进展[J].山东化工，2021，50（24）：62-63，66.
[12] SUN X,DANG G,DING X,et al.Production of alcohol-free wine and grape spirit by pervaporation membrane technology[J]. Food Bioprod Process,2020,32(15):123.
[13]杨凯，陈建林，李启良，等.渗透汽化膜分离技术在环保中的应用[J].环境科学与技术，2004，27（5）：105-108.
[14] LIU G P,JIN W Q.Pervaporation membrane materials: Recent trends and perspectives[J].J Membrane Sci,2021,636:119557.
[15]莫燕霞，殷居易，汤海青，等.不同前处理方法测定葡萄酒中锰、铁、铜含量的比较研究[J].广东化工，2014，41（5）：160-161，169.
[16]刘洋，李运奎，韩富亮，等.葡萄酒中氨基甲酸乙酯的研究进展[J].食品科学，2019，40（7）：297-303.
[17]刘宁，赵志军，刘延波，等.葡萄酒中氨基甲酸乙酯的研究进展[J].食品工业，2018，8（10）：3.
[18]李志军，吴永宁，薛长湖.生物胺与食品安全[J].食品与发酵工业，2014，30（10）：84-91.
[19] UBEDA C,HORNEDO-ORTEGA R,CEREZO A B,et al.Chemical hazards in grapes and wine,climate change and challenges to face[J].Food Chem,2020,314:126222.
[20]栾同青.黄酒酿造过程生物胺变化规律及其产生菌株研究[D].济南：齐鲁工业大学，2013.
[21]刘宁，赵志军，刘延波.葡萄酒中生物胺的影响因素及其控制[J].食品工业，2019，40（1）：233-236.
[22]峻峻，张红印，王海英，等.控制葡萄及其制品中赭曲霉毒素A的研究进展[J].食品工业科技，2014，35（16）：395-399.
[23]梁蒙，孙建平，秦燕飞，等.葡萄酒中几种潜在有害性物质研究进展[J].酿酒科技，2021，6（5）：43-45.
[24]中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局，中国国家标准化管理委员会.GB/T 15037—2006 葡萄酒[S].北京：中国标准出版社，2007.
[25]中华人民共和国卫生部.GB 2757—2012 葡萄烈酒及其配制酒[S].北京：中国标准出版社，2012.
[26]曾游，丁怡.顶空-毛细管气相色谱法测定葡萄酒中的甲醇[J].现代食品科技，2013，32（13）：22-33.