灰树花（Grifola frondosa）又名云蕈、舞茸，是一种极具开发前景的食、药两用真菌[1]。灰树花子实体和菌丝体中含有丰富的多糖、多酚、多肽等营养物质[2-5]，具有益气健脾，补虚扶正、调节机体免疫、抗肿瘤、抗疲劳等多种生物活性[6-9]。海棠果（Crabapple）又名楸子、红厚壳，原产于我国，现主要分布在华北地区，其果皮色泽鲜红夺目，果肉黄白色，鲜食酸甜香脆[10]。海棠果中含有大量的营养物质，如糖类、维生素、多酚、有机酸等，能够补充人体所需营养，增强机体免疫力，具有生津止渴、健脾开胃、涩肠止痢的功效[11-12]。
益生菌发酵可改善果蔬汁原有不良风味，赋予果蔬汁独特口感[13]。此外，在果蔬汁发酵过程中可产生有机酸、短肽、多酚等多种营养物质，其可调节肠道微生态，赋予发酵果蔬汁一定的保健功能[14-17]。本实验室前期研制了一款海棠果酵素，该饮品口感良好，酸甜适口。灰树花营养丰富，但相关食品种类单一、口感较差，难以满足市场需要[18-20]。
本试验以灰树花、海棠果为原料，利用乳酸菌发酵制备灰树花海棠果发酵饮料，探究接种量、接种比例、发酵温度、发酵时间等条件对灰树花海棠果发酵饮料相关指标的影响，并研究其抗疲劳活性，以期为灰树花、海棠果深加工及综合利用提供新的思路。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
1.1.1 菌株
植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）MA2、保加利亚乳杆菌（Lactobacillus bulgaricus）717和嗜热链球菌（Streptococcus thermophiles）176：天津科技大学食品科学与工程学院发酵食品与微生物资源开发研究室。
1.1.2 试验原料
灰树花浸提液：山东博华有限公司；海棠果果汁：山东博华有限公司；白砂糖：北京古松经贸有限公司。
1.1.3 试验动物
无特定病原体（specific pathogen free，SPF）级Wistar雄性大鼠（体质量100～110 g）：斯贝福（北京）生物技术有限公司。动物饲养于天津科技大学食品科学与工程学院屏障系统动物实验中心。室内条件为：相对湿度（55±5）%，温度（23±1）℃，控制12 h明暗光照循环，自由摄食和饮用水。天津科技大学动物保护与使用委员会已经通过本实验的申请，并按照《实验动物管理及使用指南》进行饲养管理。
1.2 仪器与设备
FA2204B电子天平：上海精密科学仪器股份有限公司；HK-04B 摇摆式粉碎机：广州市旭朗机械设备有限公司；Y909 榨汁机：山东九阳有限公司；DFD-7000 四孔水浴锅：德阳东方电工有限责任公司；ATAGO 糖度仪：日本ATAGO公司；HFsafe-900超净工作台：上海力申科学仪器有限公司；DL201恒温自动干燥箱：天津市实验仪器厂；SM510自动灭菌锅：日本Yamato公司；BCD-217GM-20℃冰箱：中国海尔有限公司；DELTA-320 pH计：法国METTLER-TOLEDO公司。
1.3 试验方法
1.3.1 灰树花海棠果发酵饮料制备工艺
将灰树花浸提液与海棠果果汁按1∶1（V/V）混合均匀→调配（添加6%白砂糖）→灭菌（90 ℃、15 s）→接种发酵剂→恒温发酵→灌装→灰树花海棠果发酵饮料
1.3.2 灰树花海棠果发酵饮料制备工艺优化正交试验
试验前期通过单因素试验[21]考察了白砂糖添加量、发酵时间、接种量、发酵菌种比例、发酵温度单因素对灰树花海棠果发酵饮料总酸、pH、可溶性固形物、感官评分的影响，结果表明，最优白砂糖添加量为6%，发酵时间为3 d，接种量为3×107 CFU/mL，发酵菌种比例（MA2∶717∶176）为2∶1∶1，发酵温度为35 ℃。
在单因素试验的基础上，以灰树花海棠果发酵饮料感官评分作为评价指标，以白砂糖添加量、发酵时间、菌种比例、发酵温度为试验因素，设计L9（34）正交试验，正交试验因素与水平见表1。
表1 灰树花海棠果发酵饮料制备工艺优化正交试验因素与水平
Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments for fermented Grifola frondosa crabapple beverage preparation technology optimization
1.3.3 动物试验条件及分组
将18只4周龄Wistar雄性大鼠随机分为3组：空白对照组（NC）为6只Wistar雄性大鼠，灌胃1 mL生理盐水，持续10 d；红牛功能饮料组（RB）为6只Wistar雄性大鼠，灌胃1 mL红牛功能饮料，持续10 d；灰树花海棠果发酵饮料组（GF）为6只Wistar雄性大鼠，灌胃1 mL灰树花海棠果发酵饮料，持续10 d。
1.3.4 跑笼试验
将装有大鼠的跑笼置于大水槽中，水温控制在10 ℃以下，水面高于笼高的2/3又不浸没跑笼。大鼠在求生本能和寒冷的双重刺激下，不得不依靠提高动能（速度）来维持一定的动力势能避免被水淹没和保持体温。为了避免大鼠抓附跑笼的侧壁，采用光滑的墙纸将侧壁密封[22]。
1.3.5 爬杆试验
将各试验组大鼠置于干净的统一的有机玻璃棒上（试验时将爬杆架置于深10 cm、水温15 ℃的水盆中）。让在玻璃棒上的大鼠的肌肉处在静力紧张的状况，记录试验大鼠因为其肌肉的疲劳，而从玻璃棒上掉下来的时间。大鼠3次落水的时候，停止试验，3次试验测得的时间累加作为该试验组大鼠的爬杆时间[23-24]。
1.3.6 负重游泳试验
每组选用6只大鼠，末次给予大鼠受试物30 min后，置大鼠于游泳箱中游泳，水深为35 cm，水温为（25.0±0.5）℃，鼠尾根部负荷10%体质量的铅皮。记录大鼠从游泳开始至力竭的时间，作为大鼠游泳力竭时间[25-26]。
1.3.7 数据处理
本试验所得数据均采用数理统计软件SPSS 21.0进行统计学分析，试验数据以“均值±标准偏差”表示，P＜0.05表示两组之间具有显著性差异，P＜0.01 表示两组之间具有极显著性差异。
2 结果与分析
2.1 灰树花海棠果发酵饮料制备工艺优化正交试验
正交试验结果与分析见表2，方差分析见表3。
表2 灰树花海棠果发酵饮料制备工艺优化正交试验结果与分析
Table 2 Results and analysis of orthogonal experiments for fermented Grifola frondosa crabapple beverage preparation technology optimization
表3 正交试验结果方差分析
Table 3 Variance analysis for orthogonal experiment results
注：“*”表示对结果影响显著（P＜0.05）。
由表2、表3可知，影响灰树花海棠果发酵饮料口感的主次因素为白砂糖添加量＞发酵温度＞菌种比例＞发酵时间，最佳组合为A2B1C1D2，即白砂糖添加量为6%；发酵时间为3 d；菌种比例为2∶1∶1；发酵温度为37 ℃。对最优组合A2B1C1D2进行验证，感官评分结果为89分。
2.2 灰树花海棠果发酵饮料对大鼠体质量的影响
大鼠体质量指标是反映大鼠健康状况的重要指标。各组大鼠活泼，精神状态良好，皮毛光滑，未见任何不良反应。由图1可知，3组大鼠灌胃10 d后体质量均有增加，但与空白对照组（NC）相比，红牛功能饮料组（RB）和灰树花海棠果发酵饮料组（GF）大鼠体质量无显著差异（P＞0.05），以上结果表明灰树花海棠果发酵饮料对大鼠体质量增长无显著性影响。
图1 灰树花海棠果发酵饮料对大鼠体质量的影响
Fig.1 Effect of fermented Grifola frondosa crabapple beverage on body mass of rat
2.3 灰树花海棠果发酵饮料对大鼠运动耐力的影响
2.3.1 灰树花海棠果发酵饮料对大鼠跑笼时间的影响
运动耐力的下降是疲劳最直接、客观的表现[22]。跑笼试验是测定运动耐力的方法之一，是评价抗疲劳的主要方法。跑笼时间的长短可反映动物运动疲劳程度。由图2可知，t（RB）＞t（GF）＞t（NC），即红牛功能饮料组（RB）大鼠跑笼时间最长，跑笼时间为（1 234.43±104.92）s，而灰树花海棠果发酵饮料组（GF）跑笼时间为（1 222.97±187.79）s。与空白对照组（NC）相比，红牛功能饮料（RB）和灰树花海棠果发酵饮料（GF）均能延长大鼠跑笼时间，延长率分别为12.30%和11.25%，但组间均无显著性差异（P＞0.05），这可能与组内个体差异较大有关。以上结果表明，饮用灰树花海棠果发酵饮料可延长大鼠跑笼时间。
图2 灰树花海棠果发酵饮料对大鼠跑笼时间的影响
Fig.2 Effect of fermented Grifola frondosa crabapple beverage on rat cage running time
2.3.2 灰树花海棠果发酵饮料对大鼠爬杆时间的影响
爬杆试验是测定运动耐力的方法之一，是评价抗疲劳的常用方法。由图3可知，t（GF）＞t（RB）＞t（NC），即灰树花海棠果发酵饮料组（GF）大鼠爬杆时间最长，爬杆时间为（81.88±8.56）s，而红牛功能饮料组（RB）爬杆时间为（65.18±7.44）s。与空白对照组（NC）相比，红牛功能饮料（RB）和灰树花海棠果发酵饮料组（GF）极显著延长了大鼠爬杆时间（P＜0.01），延长率分别为41.32%和77.54%。与红牛功能饮料组相比，灰树花海棠果发酵饮料组（GF）极显著延长了大鼠爬杆时间（P＜0.01）。以上结果表明，饮用灰树花海棠果发酵饮料可延长大鼠爬杆时间，具有增强耐力、缓解疲劳的作用，且效果优于红牛功能饮料组。
图3 灰树花海棠果发酵饮料对大鼠爬杆时间的影响
Fig.3 Effect of fermented Grifola frondosa crabapple beverage on rat pole climbing time
“#”与空白对照组比较具有显著性差异（P＜0.05）。
“**”与红牛功能饮料组比较具有极显著性差异（P＜0.01）。下同。
2.3.3 灰树花海棠果发酵饮料对负重游泳时间的影响
负重游泳力竭试验是测定运动耐力的方法之一，是评价抗疲劳的主要方法。负重游泳力竭时间的长短可反映动物运动疲劳程度。由图4可知，t（GF）＞t（RB）＞t（NC），即灰树花海棠果发酵饮料组（GF）大鼠游泳力竭时间最长，游泳时间为（772.12±65.17）s，而红牛功能饮料组（GF）游泳时间为（643.16±87.60）s。与空白对照组（NC）相比，红牛功能饮料和灰树花海棠果发酵饮料组（GF）可显著延长大鼠游泳时间（P＜0.05），延长率分别为31.86%、58.31%。与红牛功能饮料组相比，灰树花海棠果发酵饮料组（GF）显著延长了大鼠力竭游泳时间（P＜0.05）。以上结果表明，饮用灰树花海棠果发酵饮料可延长大鼠负重游泳力竭时间，具有增强耐力、缓解疲劳的作用，且效果优于红牛功能饮料组。王金菊等[9]研究表明，灌胃灰树花发酵液可显著延长小鼠游泳力竭时间，增强小鼠运动耐力，这与本试验研究结果相一致。
图4 灰树花海棠果发酵饮料对大鼠力竭游泳时间的影响
Fig.4 Effect of fermented Grifola frondosa crabapple beverage on rat exhaustive swimming time
“*”表示与红牛功能饮料组比较具有显著差异（P＜0.05）。
3 结论
本试验通过正交试验，确定灰树花海棠果发酵饮料最佳发酵工艺为：白砂糖添加量为6%；发酵时间为3 d；MA2∶717∶176接种比例为2∶1∶1；发酵温度为37 ℃。在此条件下制得饮料酸甜可口，风味良好，感官评分为89分。通过跑笼试验、负重游泳试验、爬杆试验，探究了灰树花海棠果发酵饮料对大鼠抗疲劳的作用。结果表明，与红牛功能饮料组（RB）相比，灰树花海棠果发酵饮料具有相似的抗疲劳效果，且部分试验效果更优。与空白对照组（NC）相比，灰树花海棠果发酵饮料具有显著提高机体耐力，缓解疲劳的效果，具有开发为抗疲劳食品的潜力。
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