党参（Codonopsis pilosula），又名单枝党、条党或者蛮党，是桔梗科党参（Codonopsis pilosula（Franch.）Nannf.）属植物，是川党参（Codonopsis tangshen Oliv.）的生态型品种的干燥根，因产地贵州遵义道真县洛龙镇而得名洛党参，是当地特有的中药材，有着较早的入药历史[1]。洛党参的茎和叶都可以入药或是食用，还可作食品添加剂或是饲料添加剂，能治疗多种疾病，经常食用洛党参会对人体健康有益[2-3]，研究表明，洛党参脂溶性成分有显著的脑保护作用，具有有效成分极性低，内部成分丰富且生物活性物质占比多的特点[4]。洛党参的应用除了用于临床保健治疗或是在家庭菜品中作为食疗；市面上还开始逐渐出现了“党参饮料”“党参晶”“党参酒”“洛党参茶”“洛党参精品口服液”“洛党参咀嚼片”等洛党参保健食品[5-6]。洛党参中主要含有苷类、糖类、甾醇等，其中党参炔苷为聚乙炔类化合物，可以作为质量评价的指标。关于洛党参的研究目前集中在栽培技术[7-9]、贮藏保鲜[10]、质量评价[11-12]和产业发展[13]上，有关洛党参精深加工的研究报道还较少。
葡萄（Vitis vinifera L.）是我国重要的水果之一，果实汁多味美，含有大量对人体有益物质，具有较高的营养和药用价值[14]，将葡萄与富含营养的原材料共同发酵制备的葡萄酒成品不仅具有其原材料的营养保健价值，又丰富了葡萄酒风味，为葡萄酒种类创新鉴定了基石。王燕荣等[15]以酿酒葡萄、黑枸杞为发酵原料，制备黑枸杞干红葡萄酒，并优化了其发酵条件；张天佑等[16]利用人参、鹿胎等原料，以葡萄酒为酒基制备人参鹿胎葡萄酒，并筛选出最佳制备方法；于亚敏等[17]利用紫皮洋葱和赤霞珠葡萄酒为原料，制备洋葱葡萄酒。
本研究选用经超临界CO2萃取获得的洛党参萃取物与葡萄为主要原料，经葡萄酒酵母（Saccharomyces uvarum）BV818发酵制备洛党参萃取物-葡萄复合发酵酒，采用单因素试验及正交试验对其发酵工艺条件进行优化，并分析其理化指标、微生物指标和挥发性风味成分，以期赋予葡萄酒一定的药用价值与独特的参香，增加葡萄酒的饮用口感和保健价值，为贵州地方特色洛党参复合发酵酒的产业化开发奠定理论基础与技术支持，同时有利于提高洛党参产业附加值，拓宽应用途径，助力乡村振兴。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
1.1.1 材料与菌株
巨峰葡萄：山东巨峰葡萄购销合作社；洛党参：贵州省遵义市道真县洛龙镇；葡萄酒酵母（Saccharomyces uvarum）BV818：安琪酵母股份有限公司。
1.1.2 试剂
CO2（食品级）：遵义市望江气体有限公司；葡萄糖、焦亚硫酸钾（均为分析纯）：国药集团化学试剂有限公司；果胶酶（10万U/g）：山东隆科特酶制剂有限公司；无水乙醇（分析纯）：重庆万盛川东化工有限公司；甲醇（色谱级）：上海阿拉丁生化科技有限公司。
1.2 仪器与设备
SFE-2超临界CO2萃取系统：美国ASI公司；7890B-5977A气相色谱质谱联用（gas chromatographic-mass spectrometry，GC-MS）仪、7890B气相色谱仪带氢火焰离子化检测器（flame ionization detector，FID）、VF-WAXms毛细管色谱柱（60 m×250 μm×0.5 μm）：美国Agilent公司；AT.LZP-930毛细管色谱柱（18 m×0.53 mm×1.0 μm）：中科院兰州化学物理研究所；PDMS/DVB固相微萃取头（65 μm）：Supelco公司；ME204E电子天平：梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；FW400A高速万能粉碎机：北京科伟永兴仪器有限公司；WZS80手持糖度计：上海仪电物理光学仪器有限公司。
1.3 方法
1.3.1 洛党参萃取物的制备
以洛党参为原料，经粉碎至物料粒度为50目，利用SFE-2超临界CO2萃取仪进行萃取，萃取条件为：压强31MPa、温度53 ℃、时间63 min，萃取完成后，得到洛党参萃取物，备用。
1.3.2 洛党参萃取物-葡萄复合发酵酒加工工艺流程及操
作要点
新鲜葡萄→挑选、除梗、破碎→添加焦亚硫酸钾、果胶酶→成分调整→酵母活化、接种→主发酵→皮渣分离→下胶澄清后过滤除菌→洛党参萃取物-葡萄复合发酵酒成品
葡萄预处理：挑选成熟新鲜且无腐烂、虫蛀的葡萄经除梗、手捻破碎至破皮状态。
添加焦亚硫酸钾、果胶酶：于破碎后的葡萄中添加120 mg/L的焦亚硫酸钾进行处理。加入果胶酶30 mg/L进行酶解，25 ℃酶解30 min。
成分调整：采用葡萄糖调整初始糖度为25°Bx，添加洛党参萃取物5 mg/100 mL。
酵母的活化、接种：将5 g活性干酵母添加到含5%葡萄糖的50 mL温水中保持38 ℃活化20 min，按20 mg/100 mL接种至洛党参萃取物-葡萄料液中。
主发酵：洛党参萃取物-葡萄料液在28 ℃条件下发酵5～7 d至残糖基本不变，主发酵结束。
皮渣分离：纱布过滤后自然沉淀，取上清液。
下胶澄清、过滤除菌：于上清液中添加蛋清粉，其添加量为100 mg/L，进行下胶澄清，澄清完成后经0.25 μm滤膜过滤除菌，即得洛党参萃取物-葡萄复合发酵酒。
1.3.3 发酵工艺条件优化
（1）单因素试验
固定基本发酵条件为：发酵温度28 ℃，发酵时间6 d，焦亚硫酸钾添加量120 mg/L，酵母添加量20 mg/100 mL，果胶酶添加量30 mg/L，初始糖度25°Bx，洛党参萃取物添加量5 mg/100 mL，分别考查初始糖度（16°Bx、19°Bx、22°Bx、25°Bx、28°Bx）、酵母添加量（20 mg/100 mL、25 mg/100 mL、30 mg/100 mL、35 mg/100 mL、40 mg/100 mL）、洛党参萃取物添加量（2.0 mg/100 mL、3.5 mg/100 mL、5.0 mg/100 mL、6.5 mg/100 mL、8.0 mg/100 mL）和发酵时间（0、1 d、2 d、3 d、4 d、5 d、6 d）4个因素对洛党参萃取物-葡萄复合发酵酒感官评分、酒精度的影响。
（2）正交试验设计[18]
根据单因素试验分析结果综合考虑，最终确定初始糖度（A）、酵母添加量（B）、洛党参萃取物添加量（C）3个影响因素，建立3因素3水平的正交试验，优化洛党参萃取物-葡萄复合发酵酒发酵条件，正交试验因素与水平见表1。
表1 发酵条件优化正交试验设计因素与水平
Table 1 Factors and levels of orthogonal experimental design for fermentation conditions optimization
1.3.4 分析检测
发酵醪液糖度的测定：采用WZS80手持糖度计；还原糖、总糖、总酸的测定：参考国家标准GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》[19]。酒精度采用乙醇含量计算。
乙醇含量的测定：采用气相色谱仪。
气相色谱条件：AT.LZP-930毛细管色谱柱（18 m×530 μm×1.0 μm）；载气为高纯氮气（N2，14 mL/min），燃气（H2，40 mL/min），助燃气（空气，400 mL/min）；进样口温度200 ℃，分流比10∶1；色谱柱流量1 mL/min；升温程序为35 ℃保持8 min，以8 ℃/min升温至120 ℃，再以12 ℃/min升温至200 ℃保持2 min，运行时间共27.3 min；FID检测器温度为250 ℃[20]。
定性定量方法：保留时间定性，外标法定量（以乙醇标准品溶液的质量浓度为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y），绘制乙醇的标准曲线，得到乙醇标准曲线回归方程分别为Y=67.80X-415.26，相关系数R2为0.9985），代入回归方程计算乙醇含量。
1.3.5 洛党参萃取物-葡萄复合发酵酒挥发性成分分析
采用顶空固相微萃取（head space-solid phase microextraction，HS-SPME）法[21]结合气相色谱质谱联用仪测定挥发性风味成分。
HS-SPME条件：所用固相微萃取头为PDMS/DVB（65 μm）。样品量为10 mL，加NaCl 3 g，于40 ℃萃取40 min。
气相色谱条件：VF-WAXms毛细管色谱柱（60 m×250 μm×0.5 μm）；进样口温度220 ℃，不分流进样；载气为氦气（He），流速1 mL/min；升温程序为50 ℃保持2 min，6 ℃/min升温至180℃，再以8 ℃/min升温至240 ℃保持25 min，运行时间共56.2 min[22]。
质谱条件：电子电离（electron ionization，EI）源，电子能量70 eV，离子源温度230 ℃，MS四级杆温度150 ℃，扫描方式为SCAN，质量扫描范围33～350 m/z。
定性定量方法：各组分通过美国国家标准技术研究所（nationalinstituteofstandardsandtechnology，NIST）MSSearch 2.2解谱分析进行定性，积分峰面积确定相对含量。
1.3.6 洛党参萃取物-葡萄复合发酵酒的感官评价
参考GB/T 15037—2006《葡萄酒》[23]的感官要求建立洛党参萃取物-葡萄复合发酵酒的感官评分标准，分别从外观、香气、口感3个方面对复合发酵酒进行感官评价，满分为100分，由5名专业葡萄酒品评人员按照评分标准对复合发酵酒进行感官品评并打分。洛党参萃取物-葡萄复合发酵酒的感官评分标准见表2。
表2 洛党参萃取物-葡萄复合发酵酒的感官评分标准
Table 2 Sensory score standards of Luolong Codonopsis pilosula extracts-grape compound fermented wine
1.3.7 数据处理
运用软件IBM SPSS Statistics 25.0进行正交试验设计，采用Origin2021软件进行绘图。
2 结果与分析
2.1 发酵工艺优化的单因素试验
2.1.1 初始糖度的确定
初始糖度对洛党参萃取物-葡萄复合发酵酒品质的影响见图1。
图1 初始糖度对复合发酵酒品质的影响
Fig.1 Effect of initial sugar content on the quality of compound fermented wine
由图1可知，随着发酵醪液初始糖度在16°Bx～28°Bx范围内升高，洛党参萃取物-葡萄复合发酵酒酒精度逐渐升高；随着发酵醪液初始糖度在16°Bx～25°Bx范围内升高，感官评分逐渐升高；当初始糖度＞25°Bx，感官评分逐渐平稳；初始糖度为25°Bx时，感官评分为94.6分，酒精度约为12.5%vol，酒体清澈透明、酒色纯正、入口饱满利口，感官评价良好。综合考虑，确定最佳的初始糖度为25°Bx。
2.1.2 酵母添加量的确定
酵母添加量对洛党参萃取物-葡萄复合发酵酒品质的影响见图2。
图2 酵母添加量对复合发酵酒品质的影响
Fig.2 Effects of yeast addition on the quality of compound fermented wine
由图2可知，随着酵母添加量在20～30 mg/100 mL的增加，酒精度与感官评分逐渐增加；酵母添加量为30mg/100mL时，酒精度及感官评分均最高，分别为12.8%vol、95.5分；酵母添加量＞30 mg/100 mL，酒精度及感官评分逐渐下降，可能是过多的酵母接种量不利于发酵的正常进行。综合考虑，确定最佳的酵母添加量为30 mg/100 mL。
2.1.3 洛党参萃取物添加量的确定
洛党参萃取物添加量对洛党参萃取物-葡萄复合发酵酒品质的影响见图3。
图3 洛党参萃取物添加量对复合发酵酒品质的影响
Fig.3 Effects of Luolong Codonopsis pilosula extracts addition on the quality of compound fermented wine
由图3可知，洛党参萃取物添加量在2～5 mg/100 mL范围内的增加，酒精度及感官评分均逐渐增加；洛党参萃取物添加量为5 mg/100 mL时，酒精度及感官评分均最高，分别为11.8%vol、94.3分；洛党参萃取物添加量＞5 mg/100 mL时，酒精度下降、感官评分降低，其原因可能是，洛党参萃取物对酵母产生了一定的抑制作用，洛党参萃取物添加量过多导致参香比例升高，从而影响酒体综合感官品质。综合考虑，确定最佳的洛党参萃取物添加量为5 mg/100 mL。
2.1.4 发酵时间的确定
发酵时间对洛党参萃取物-葡萄复合发酵酒品质的影响见图4。
图4 发酵时间对复合发酵酒品质的影响
Fig.4 Effect of fermentation time on the quality of compound fermented wine
由图4可知，随着发酵时间在1～5 d范围内的增加，感官评分及酒精度均逐渐增加；当发酵时间为5 d时，酒精度为13.7%vol，感官评分为95.6分；当发酵时间＞5 d，感官评分逐渐平稳，但酒精度仍然呈上升趋势。在第5天时，已达到酒体综合较好状态，继续发酵导致酒精度继续增加会对酵母逐渐产生抑制作用。综合考虑，确定最佳的发酵时间为5 d。
2.2 发酵工艺优化正交试验结果与分析
固定发酵时间为5 d，选择初始糖度（A）、酵母添加量（B）、洛党参萃取物添加量（C）3个因素，以洛党参萃取物-葡萄复合发酵酒感官评分为评价指标，进行正交试验设计，正交试验结果与分析见表3，方差分析见表4。
表3 发酵工艺优化正交试验结果与分析
Table 3 Results and analysis of orthogonal experiments for fermentation process optimization
由表3可知，3个因素对洛党参萃取物-葡萄复合发酵酒感官评分影响的主次顺序为A＞B＞C，即初始糖度＞酵母添加量＞洛党参萃取物添加量，获得发酵工艺条件的最佳方案组合为A2B2C2，即初始糖度25 °Bx、酵母添加量30 mg/100 mL、洛党参萃取物添加量5.0 mg/100 mL，该工艺方案组合并未出现在正交试验设计方案中，需要对此方案进行验证试验。通过3次平行验证试验，在该优化工艺条件下得到的洛党参萃取物-葡萄复合发酵酒酒精度为12.8%vol，感官评分为96.1分。表明该方案符合优化结果，达到洛党参萃取物-葡萄复合发酵酒工艺优化的目的。
由表4可知，由P值可知，初始糖度对复合发酵酒感官评分影响显著（P＜0.05），酵母添加量和洛党参萃取物添加量的影响不显著（P＞0.05），由F值可知，各因素对洛党参萃取物-葡萄复合发酵酒的感官评分影响次序分别为初始糖度＞酵母添加量＞洛党参萃取物添加量。
表4 正交试验结果方差分析
Table 4 Variance analysis of orthogonal experiments results
注：“*”表示对结果影响显著（P＜0.05）。
2.3 洛党参萃取物-葡萄复合发酵酒品质分析
2.3.1 洛党参萃取物-葡萄复合发酵酒理化指标分析
洛党参萃取物-葡萄复合发酵酒中理化指标检测结果见表5。由表5可知，洛党参萃取物-葡萄复合发酵酒党参炔苷含量1.24 mg/L；酒精度为12.8%vol；甲醇含量9.08 mg/L，远低于安全限量值400 mg/L；总糖含量31.83 g/L，说明属于半甜葡萄酒；还原糖（以葡萄糖计）25.78 g/L，还原糖和总糖含量较高柔和了发酵酒整体的口感；总酸含量（以酒石酸计）5.26 g/L，说明洛党参萃取物-葡萄复合发酵酒的酸度合适，口感上较为容易接受；沙门氏菌和金黄色葡萄球菌皆未检出。洛党参萃取物-葡萄复合发酵酒理化指标及微生物指标符合GB 15037—2006《葡萄酒》和GB 2758—2012《发酵酒及其配制酒》[24]的要求。
表5 复合发酵酒理化及微生物指标检测结果
Table 5 Determination results of physicochemical and microbiological indexes of compound fermented wine
2.3.2 洛党参萃取物-葡萄复合发酵酒挥发性成分分析
洛党参萃取物-葡萄复合发酵酒样品挥发性成分的GC-MS分析结果见表6。由表6可知，洛党参萃取物-葡萄复合发酵酒共鉴定出16种化合物，其中醇类8种，酯类4种，醛类2种，酸类1种，酮类1种。由其相对含量可以看出，复合发酵酒中醇类化合物相对含量为94.43%，占主要地位；其次为酯类化合物，相对含量为3.17%；醛类、酸类和酮类化合物的相对含量共为2.4%。由此可知，复合发酵酒的风味物质主要来源于醇类，酸类、酯类、醛类、酮类化合物为辅，乙酸乙酯相对含量较高，其辅以酒体清新的青草香气[25]，与其他微量成分共同构成较为协调的酒体风格。
表6 复合发酵酒样品中挥发性风味成分的GC-MS分析
Table 6 Volatile flavor components in compound fermented wine samples analyzed by GC-MS
3 结论
以葡萄与洛党参萃取物为主要原料经过发酵制备洛党参萃取物-葡萄复合发酵酒，通过单因素试验及正交试验确定最佳发酵工艺条件为初始糖度25°Bx、酵母添加量30 mg/100 mL、洛党参萃取物添加量5 mg/100 mL，在此优化条件下，洛党参萃取物-葡萄复合发酵酒理化和微生物指标复合相关国标要求要求，感官评分为96.1分，酒精度为12.8%vol，酒体清澈透明无杂物、香味清新略带梨香和草本植物香味、入口丰甜、回味较长的半甜葡萄酒。
在乡村振兴战略时代背景下，以提高农产品附加值为目标的食品研发是一条值得探索的道路，该研究可为贵州道真特色中药材洛党参的应用寻找一个新的方向，为提高农产品附加值提供基础依据与技术支持。
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