豉香型白酒因其独特的脂肪风味而广受欢迎，尤其是在中国南方地区[1]。豉香型白酒采用大米为原料，经蒸煮后拌入大酒饼，边糖化边发酵，发酵后的醪液经釜式蒸馏后得乙醇体积分数为28%～38%的低度白酒，俗称“斋酒”，具有酒体浑浊、味道辛辣的特点[2]，需经过陈肉酝浸后形成豉香风味，最后经过陈酿、勾兑、过滤后得到成品酒[3]。陈肉酝浸是豉香型白酒的关键工序，是典型风格形成的必要工序，它能够通过提供醛和酸等物质丰富基酒的成分，并通过提供辛醛和壬醛等物质形成强烈的脂肪香气[1，4]。陈肉在生产过程中发生缓慢而复杂的脂质氧化变化，但操作较为繁琐且耗时，难以满足日益增长的市场需求，因此，需要加速陈肉的生产。
陈肉具有高酸价（acid value，AV）和高氧化水平的特点。到目前为止，已研究了光照、过氧化氢、脂肪氧合酶等对泡酒肥肉的加速氧化作用，但是都未能有效提高其酸价[5]。其中，在斋酒内加入适量取自陈肉浸泡过程中逸出的具有高酸价的肥油，共同浸泡使肥肉的酸价提高，然而这并不能根本意义上促进脂质氧化，而是一种传质作用[6]。
脂肪酶能催化甘油三酯水解生成甘油和游离脂肪酸。有研究报道，在多种食品系统中，油脂水解过程可以促进油脂氧化[7]。国内有研究者分别在羊肉发酵香肠[8]、腊鸭腿[9]中加入脂肪酶，发现适量地添加外源脂肪酶能加速腌腊肉制品脂肪酸的分解，从而加速脂质氧化。为了提高肉油的酸价和脂肪酶的利用效率，本研究采用包埋法固定脂肪酶，通过固定化脂肪酶的水解作用提高肉油自身的酸价，获得高酸价的肉油，并进一步研究高酸价肉油在传统泡酒工艺下的脂质氧化和风味变化，以期为替代传统工艺提出高效、简单的潜在途径。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
取自猪肩背部的新鲜肥猪肉（约5 cm×5 cm×5 cm，质量约50 g）、斋酒（酒精度为55%vol）：广东省九江酒厂有限公司；脂肪酶（10万U/g）：上海麦克林生化科技有限公司；37种脂肪酸甲酯标准品（均为色谱纯）：Sigma-Adrich（上海）贸易有限公司；明胶、海藻酸钠（均为生化试剂）、正己烷、甲醇、邻二氯苯（均为色谱纯）：上海阿拉丁生化科技股份有限公司。其余试剂均为国产分析纯。
1.2 仪器与设备
HH-S恒温水浴锅：巩义市予华仪器有限责任公司；C21-WT2118电磁炉：广东美的生活电器制造有限公司；JS39D-250绞肉机：浙江绍兴苏泊尔家居用品有限公司；ZWYD-2402恒温培养振荡器（摇床）：智诚分析仪器制造有限公司；FJ200-SH高速分散均质机：上海沪析实业有限公司；UV-2802S型紫外分光光度计：尤尼柯（上海）仪器有限公司；GC-2014C气相色谱（gas chromatography，GC）仪、Wondacap-WAX色谱柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）：岛津（中国）有限公司；PDMS/DVB/CAR固相微萃取探针：青岛贞正分析仪器有限公司；7000C顶空进样气相色谱-质谱联用（gas chromatography-mass spectrometer，GC-MS）仪、HP-5ms Ultra Inert色谱柱（15 m×0.25 mm×0.25 μm）：美国安捷伦公司。
1.3 方法
1.3.1 固定化脂肪酶的制备
准确称取海藻酸钠1.5 g，明胶1.5 g于烧杯中，混合后加入50 mL去离子水，于80 ℃水浴加热并搅拌，充分溶解后冷却至室温，再于100 r/min条件下加入100 mg脂肪酶直至充分混匀。用10 mL注射器将上述溶液逐滴加入4%的氯化钙溶液中，于4 ℃固化2 h。过滤后取酶制剂凝珠，用去离子水洗涤3次，抽滤，于4 ℃冰箱保存备用。
1.3.2 高酸价肉油的制备
新鲜的肥猪肉在50 ℃温水中浸泡40 min，然后在沸水中煮15 min，煮熟的肥猪肉在绞肉机中绞碎，用双层纱布过滤后得到普通肉油。将普通肉油与固定化脂肪酶按质量比50∶3于30 ℃、120 r/min条件下反应20 h，作为加酶组，每4 h取样测其酸价。取最佳处理时间的肉油经双层纱布过滤除去固定化脂肪酶，再于95 ℃水浴加热去除肉油中可能残留的酶活，得到高酸价肉油。未经固定化脂肪酶水解的普通肉油也执行上述操作，作为对照组。
1.3.3 高酸价肉油的传统泡酒实验
以未经固定化脂肪酶水解的普通肉油为对照组，将获得的高酸价肉油与酒精度为55%vol的斋酒以料液比1.0∶2.5（g∶mL）加入密封罐中，于25 ℃的黑暗处静置浸泡60 d，每15 d取样检测其酸价、过氧化值、茴香胺值和脂肪酸组成，60 d后取样检测其挥发性化合物组成。
1.3.4 高酸价肉油的脂质氧化分析
油脂脂质氧化常用的评价指标包括酸价（AV）、过氧化值（peroxide value，PV）、茴香胺值（anisidine value，AnV）。将肉油与石油醚（沸程30～60 ℃）按料液比1∶1（g∶mL）混合后，静置提取24 h。经装有无水硫酸钠的漏斗过滤，取滤液，在低于40 ℃的水浴中，用旋转蒸发仪减压蒸干石油醚，残留物即为待测样品。酸价的测定参照国标GB 5009.229—2016《食品中酸价的测定》[10]。过氧化值的测定参照GB5009.227—2016《食品中过氧化值的测定》[11]。茴香胺值的测定参照国标GB/T 24304—2009《动植物油脂茴香胺值的测定》[12]。
1.3.5 高酸价肉油的脂肪酸组成分析
通过对BHOURI A M等[13]所报道的方法稍作调整，使用GC测定肉油的长链脂肪酸组成。准确称取约0.02 g待测样品，加入2 mL正己烷，充分振摇至其溶解，然后加入4 mL 2 mol/L的氢氧化钾-甲醇溶液，涡旋3 min，使待测样品中的脂肪酸完全甲酯化。静置后，取上层液体并用正己烷稀释10倍，然后经0.22 μm有机滤膜过滤后用于气相色谱分析。
气相色谱条件：Wondacap-Wax熔融石英毛细管色谱柱（30 m×0.32 mm×0.25μm）；载气为氮气（N2）；流速1.5 mL/min；进样量1 μL；进样口与检测器温度250 ℃；分流比1∶2；升温程序为在160 ℃保持3 min，再以10 ℃/min的速率升温至200 ℃，最后以2 ℃/min的速率升温至220 ℃，保持3 min。
定性、定量方法：通过脂肪酸甲酯化标准品的保留时间对待测样品中的脂肪酸进行定性，通过外标法进行定量。
1.3.6 高酸价肉油的挥发性化合物测定
参照WEN R X等[14]的方法采用固相微萃取-气相色谱-质谱法（solid phase microextraction-gas chromatography-mass spectrometry，SPME-GC-MS）测定肉油的挥发性化合物。
1.3.7 数据分析
采用软件Origin 8.5进行绘图，采用SPSS 17.0单因素分析方法进行数据分析，所有实验平行进行3次，最终结果均以“平均值±标准差”表示。
2 结果与分析
2.1 固定化脂肪酶处理肉油酸价的变化
普通肉油及固定化脂肪酶处理肉油过程中酸价的变化见图1。由图1可知，在加入固定化脂肪酶的肉油中，随着处理时间的延长，肉油的酸价逐渐上升而后下降；当水解时间为16 h时，酸价最高，达到（26.32±2.01）mg/g。而在对照组的肉油中，随着时间的延长，肉油的酸价变化缓慢且酸价始终较低，均在0.4 mg/g左右。水解16 h后，加酶组肉油的酸价约是对照组的66倍，即制备得到高酸价肉油。说明脂肪酶促进脂肪水解生成大量脂肪酸，导致酸价上升，从而获得高酸价肉油。因此，选择固定化脂肪酶处理肉油时间为16 h。
图1 普通肉油及固定化脂肪酶处理肉油过程中酸价的变化
Fig.1 Changes of acid value of common pork fat pulp and pork fat pulp treated with immobilized lipase
2.2 传统泡酒过程中高酸价肉油的脂质氧化
2.2.1 酸价的变化
传统泡酒过程中肉油酸价的变化见图2。由图2可知，传统泡酒过程中（0～60 d），普通肉油（对照组）的酸价由（0.59±0.05）mg/g变为（0.47±0.04）mg/g，期间的酸价只有微小波动，这表明普通肉油（对照组）的水解程度和氧化程度均很低。高酸价肉油浸泡0 d时的酸价[（26.32±2.01）mg/g]显著高于对照组（P＜0.05），这是因为在脂肪酶的水解作用下，脂肪被水解成脂肪酸；浸泡15 d时，高酸价肉油的酸价降低为（22.47±1.10）mg/g，可能是因为部分脂肪酸被氧化降解为氢过氧化物[15-16]。浸泡15～60 d时，高酸价肉油的酸价逐渐升高，浸泡60 d时，酸价为[（26.73±2.84）mg/g]，可能是因为高酸价肉油的脂质在泡酒过程中仍不断被水解为脂肪酸[17]，而且部分氧化产物（如醛类、酮类等物质）被进一步氧化为羧酸[18]。
图2 传统泡酒过程中肉油酸价的变化
Fig.2 Changes of acid value of pork fat pulp during traditional liquor soaking
不同小写字母表示组间差异显著（P＜0.05）。下同。
2.2.2 过氧化值的变化
几乎所有的油脂氧化过程均会产生氢过氧化物，它是脂质氧化的第一个中间产物，因此过氧化值（PV）可用来评价油脂的氧化程度。传统泡酒过程中肉油过氧化值的变化见图3。
图3 传统泡酒过程中肉油过氧化值的变化
Fig.3 Changes of peroxide value of pork fat pulp during traditional liquor soaking
由图3可知，肉油的PV均随浸泡时间的增加而逐渐升高，表明脂肪酸发生氧化，生成氢过氧化物。浸泡0～45 d内，高酸价肉油与对照组普通肉油的PV无显著性差异（P＞0.05）；浸泡60 d时，高酸价肉油的PV[（4.99±0.34）meq/kg]是浸泡0 d的12.17倍（P＜0.05），比同时期的普通肉油（对照组）显著提高了32%（P＜0.05）。结果表明，脂肪酶的作用促进了脂肪水解，快速生成脂肪酸，并氧化生成氢过氧化物，这与脂肪酶对火腿片的作用结果一致[15]。
2.2.3 茴香胺值的变化
脂肪酸氧化产生的氢过氧化物极不稳定，容易分解生成次级氧化产物，如α或β不饱和醛，其生成量用茴香胺值（AnV）表示[19]。传统泡酒过程中肉油茴香胺值的变化见图4。由图4可知，高酸价肉油与普通肉油（对照组）的AnV都随浸泡时间的增加而逐渐升高，且高酸价肉油的AnV高于对照组普通肉油。浸泡0～60 d内，高酸价肉油的AnV升高速度较快且幅度较大；而普通肉油（对照组）的AnV升高速度缓慢且幅度极小。当浸泡时间为60 d时，高酸价肉油的AnV为1.30±0.13，是同时期对照组的5.65倍（P＜0.05）。这表明脂肪酶制备得到的高酸价肉油氧化产生的大量氢过氧化物，进一步分解为醛、酮、酸等低分子物质[12]。
图4 传统泡酒过程中肉油茴香胺值的变化
Fig.4 Changes of anisidine value of pork fat pulp during traditional liquor soaking
2.3 传统泡酒过程中高酸价肉油脂肪酸的变化
传统泡酒过程中高酸价肉油长链脂肪酸组成的变化见表1。
表1 传统泡酒过程中肉油长链脂肪酸组成的变化
Table 1 Changes of long chain fatty acids composition of pork fat pulp during traditional liquor soaking g/100 g
注：“-”表示未检出。
由表1可知，浸泡0 d时，高酸价肉油的脂肪酸总量为（58.20±0.18）g/100 g，比普通肉油（对照组）[（55.63±0.95）g/100 g]提高了4.62%；饱和脂肪酸（saturated fatty acid，SFA）和不饱和脂肪酸（unsaturated fatty acid，UFA）分别是普通肉油（对照组）的1.07倍和1.01倍，这可能是因为脂肪酶促进肉油脂肪水解并释放了更多的脂肪酸[20]。浸泡60 d时，高酸价肉油的脂肪酸总量为（51.99±0.16）g/100 g，普通肉油（对照组）的脂肪酸总量为（58.96±0.33）g/100 g，这可能是因为高酸价肉油的脂质氧化速度快于普通肉油（对照组），脂肪酸迅速被氧化降解为氢过氧化物、醛、酮等物质，导致其脂肪酸总量减少[21]。总体而言，高酸价肉油的饱和脂肪酸（SFA）、单不饱和脂肪酸（monounsaturated fattyacid，MUFA）、多不饱和脂肪酸（polyunsaturated fatty acid，PUFA）和脂肪酸总量的变化趋势都与普通肉油（对照组）的变化趋势一致，其中C16：0、C18：1和C18：0是两组肉油中含量最丰富的3种脂肪酸，这与李玲芳等[22]的研究结果一致。浸泡60 d时，C16：0、C18：1和C18：0的含量分别占高酸价肉油脂肪酸总量的38.07%、28.54%和17.45%，分别占普通肉油（对照组）脂肪酸总量的35.80%、28.82%和19.30%。
2.4 传统泡酒过程中高酸价肉油挥发性化合物的变化
通过SPME-GC-MS测定固定化脂肪酶处理前后的肉油及其在传统浸制条件下浸泡60 d后的挥发性物质组成，结果见表2。
由表2可知，肉油中共检测出43种挥发性化合物，包括5种醇类，4种醛类，11种酯类，16种碳氢化合物，1种呋喃，1种醚类和5种含氮化合物。
表2 肉油在传统条件下浸泡0 d和60 d的挥发性化合物组成
Table 2 Composition of volatile compounds in pork fat pulp soaked for 0 d and 60 d under traditional conditions mg/kg
续表
注：“nd”表示未检出。
浸泡0 d时，普通肉油（对照组）和高酸价肉油的挥发性化合物组成相似。其中，2,4-二甲基己烷未在高酸价肉油中检出，甲氧基苯肟未在普通肉油（对照组）中检出。与普通肉油（对照组）相比，高酸价肉油中正己醛的含量显著提高了229%（P＜0.05）。正己醛具有青草气味，被认为是ω-6不饱和脂肪酸的氧化产物[23]，推测是脂肪酶的作用促进脂质降解和氧化。
浸泡60 d时，高酸价肉油的挥发性化合物种类共有38种，含量为（46.99±0.50）mg/kg，其种类和含量分别比普通肉油（对照组）提高40.74%和25.74%。其中，酯类和醛类物质的含量增加最明显，高酸价肉油的酯类和醛类含量分别是普通肉油（对照组）的5.99倍和4.29倍，醛类物质含量的增加可能是高酸价肉油脂质氧化程度较高产生大量次级氧化产物导致的[16]；酯类物质含量的增加可能是来源于斋酒本身的成分扩散[24]，也可能来源于高酸价肉油氧化产生的酸类物质与斋酒中的乙醇发生的酯化反应[25]。与浸泡60 d的普通肉油（对照组）相比，高酸价肉油中的正己醛和壬醛分别是对照组的5.36倍和3倍。顺-2-壬烯-1-醇、庚醛、乙酸苯乙酯、壬酸乙酯、9-癸烯酸乙酯以及一些芳香烯类物质为高酸价肉油特有的成分，未在普通肉油（对照组）中检出。顺-2-壬烯-1-醇被描述为绿色的、脂肪的味道[26]，庚醛具有独特的脂肪香味[27]，而乙酯类具有强烈的果味和低阈值[28]，一些芳香烯如D-柠檬烯可以提供花香[29]、柑橘香[30]，α-蒎烯则可以提供薄荷香[25]。
对照组中，浸泡60 d的肉油的挥发性化合物的种类是浸泡0 d的3.86倍，其含量比浸泡0 d的提高了22.65%；高酸价肉油中，浸泡60 d的肉油的挥发性化合物的种类是浸泡0 d的5.43倍，其含量比浸泡0 d的提高了52.17%。说明斋酒浸泡过程能促进肉油和高酸价肉油的挥发性化合物释放，且高酸价肉油比未经脂肪酶处理的肉油具有更高丰度的挥发性化合物。
3 结论
固定化脂肪酶处理肉油16 h可获得高酸价肉油，其酸价是普通肉油（对照组）的66倍，达到（26.32±2.01）mg/g；该高酸价肉油在传统条件下泡酒60 d后，其酸价和茴香胺值分别是普通肉油（对照组）的58.11倍和5.65倍，其过氧化值比对照组提高了32%，说明脂肪酶促进了脂质的水解和氧化。传统泡酒过程中，高酸价肉油的饱和脂肪酸、单不饱和脂肪酸、多不饱和脂肪酸和脂肪酸总量的变化趋势均与对照组普通肉油的变化趋势一致，其中C16：0、C18：1和C18：0含量最丰富，分别占总含量的38.07%、28.54%和17.45%。脂肪酶作用前后肉油的挥发性化合物种类相差不大，但经过斋酒浸泡60 d后，其挥发性化合物的种类和含量都显著提高，且高酸价肉油更具有产生丰富风味的潜力，其挥发性化合物的种类和含量较对照组分别提高40.74%和25.74%，其中酯类和醛类物质的含量增加最明显，分别是对照组的5.99倍和4.29倍。综上，固定化脂肪酶可以促进泡酒肉油的脂质氧化和挥发性物质产生，为豉香白酒肥肉陈化工艺创新提供潜在途径。
[1]FAN H Y,FAN W L,XU Y.Characterization of key odorants in Chinese Chixiang aroma-type liquor by gas chromatography-olfactometry,quantitative measurements,aroma recombination,and omission studies[J].J Agr Food Chem,2015,63(14):3660-3668.
[2]李大和.试论豉香型白酒独特风格的成因[J].酿酒科技，2004（1）：24-25，27.
[3]郑衍立.豉香型白酒的风格特征与市场趋势[J].酿酒科技，2005（7）：109-111.
[4]曾新安，张本山.豉香型米酒生产中浸泡脂肪的变化[J].酿酒，2002，29（3）：54-56.
[5]魏岱岳.泡酒肥肉脂质氧化及其限速反应的加速因素[D].广州：华南理工大学，2020.
[6]WEI D Y,DENG P H,TIAN X F,et al.Accelerating the oxidation of pork fat by illumination and fat oil for the production of Baijiu beverage[J].J Sci Food Agr,2021,101(3):918-926.
[7]JIN G F,ZHANG J H,YU X,et al.Lipolysis and lipid oxidation in bacon during curing and drying-ripening[J].Food Chem,2010,123(2):465-471.
[8]杨华，张琳，马俪珍，等.外源酶缩短羊肉发酵香肠成熟期的效果研究[J].食品科学，2010，31（15）：81-86.
[9]吴若娜，李诚，付刚，等.外源脂肪酶对腊鸭腿品质的影响[J].食品工业科技，2013，34（19）：161-164，168.
[10]中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会.GB 5009.229—2016食品中酸价的测定[S].北京：中国标准出版社，2016.
[11]中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会.GB 5009.227—2016食品中过氧化值的测定[S].北京：中国标准出版社，2017.
[12]中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局，中国国家标准化管理委员会.GB/T 24304—2009动植物油脂茴香胺值的测定[S].北京：中国标准出版社，2009.
[13]BHOURI A M,HARZALLAH H J,DHIBI M,et al.Nutritional fatty acid quality of raw and cooked farmed and wild sea bream(Sparus aurata)[J].J Agr Food Chem,2010,58(1):507-512.
[14]WEN R X,HU Y Y,ZHANG L,et al.Effect of NaCl substitutes on lipid and protein oxidation and flavor development of Harbin dry sausage[J].Meat Sci,2019,156:33-43.
[15]甘春生，郇延军，邵利君，等.外源酶调控火腿片成熟技术研究[J].食品与发酵工业，2010，36（9）：155-160.
[16]封莉，邓绍林，黄明，等.脂肪酶对中式香肠脂肪降解、氧化和风味的影响[J].食品科学，2015，36（1）：51-58.
[17]戚巍威，徐为民，徐幸莲，等.传统风鸭加工过程中脂肪水解和氧化的研究[J].食品与发酵工业，2008，34（1）：35-38
[18]BAI S,WANG Y R,LUO R M,et al.Formation of flavor volatile compounds at different processing stages of household stir-frying mutton sao zi in the northwest of China[J].LWT-Food Sci Technol,2021,139:110735.
[19]何志平，庞林江.油脂氧化检测方法研究进展[J].安徽农业科学，2010，38（21）：11460-11462.
[20]SONG S Q,TANG Q,HAYAT K,et al.Effect of enzymatic hydrolysis with subsequent mild thermal oxidation of tallow on precursor formation and sensory profiles of beef flavours assessed by partial least squares re-gression[J].Meat Sci,2014,96(3):1191-1200.
[21]桑胜旺，简玉英，李浠源，等.外源脂肪酶改善腊鱼品质[J].食品与发酵工业，2020，46（6）：178-183.
[22]李玲芳，陆方菊，余剑霞，等.泡酒肥肉浸制过程中脂肪氧化和脂肪酸组成的变化[J].食品工业科技，2018，39（9）：5.
[23] BA H V,RYU K S,LAN N T K,et al.Influence of particular breed on meat quality parameters,sensory characteristics,and volatile components[J].Food Sci Biotechnol,2013,22(3):651-658.
[24]VILLACÍS M F,RASTOGI N K,BALASUBRAMANIAM V M.Effect of high pressure on moisture and NaCl diffusion into turkey breast[J].LWT-Food Sci Technol,2008,41(5):836-844.
[25] SUN W Z,ZHAO Q Z,ZHAO H F,et al.Volatile compounds of Cantonese sausage released at different stages of processing and storage[J].Food Chem,2010,121(2):319-325.
[26]ZHANG J,SUN Y X,GUAN X Q,et al.Characterization of key aroma compounds in melon spirits using the sensomics concept[J].LWT-Food Sci Technol,2022,161:113341.
[27]ZHOU H M,ZHAO B,ZHANG S L,et al.Development of volatiles and odor-active compounds in Chinese dry sausage at different stages of process and storage[J].Food Sci Hum Well,2021,10(3):316-326.
[28] YANG Y,SUN Y,PAN D,et al.Effects of high pressure treatment on lipolysis-oxidation and volatiles of marinated pork meat in soy sauce[J].Meat Sci,2018,145:186-194.
[29]于慧子.中华绒螯蟹与锯缘青蟹中关键气味活性化合物的鉴定[D].上海：上海海洋大学，2011.
[30]周如隽，赵雯琪，张越，等.基于GC-MS与GC-O法分析两种桔子油中特征性香气成分[J].香料香精化妆品，2021（3）：1-5.