东北酸菜是以白菜或甘蓝经发酵制得的盐渍菜[1]。作为我国东北地区特色食品，酸菜因其独特的风味、爽脆的口感、浓郁醇厚的酸味和营养保健功效深受消费者喜爱。以酸菜为原料烹制的许多菜肴，也已成为我国北方地域饮食文化的一大特色。目前，随着现代食品加工技术的不断发展，酸菜已逐步由传统的自然发酵向人工接种乳酸菌发酵模式转变[2]。乳酸菌在酸菜的发酵中起主导作用，通过不同的代谢途径，丰富的代谢产物在酸菜发酵的过程中被不断积累，而这些代谢产物可赋予酸菜独特的风味[3-4]。因此，其常被用作酸菜工业生产中的发酵剂。研究表明，人工接种乳酸菌可缩短酸菜的发酵周期，降低酸菜亚硝酸盐含量，稳定酸菜质量并且改善酸菜品质[5]。然而，人工接种乳酸菌发酵的酸菜由于菌种单一，代谢产物少于由复杂菌系自然发酵的酸菜，因此在风味上略显不足[6]。
白酒作为另外一种传统发酵饮品，丰富的酯类和醇类物质对其饱满的风味具有重要贡献[7]。有研究表明，发酵泡菜的过程中添加一些辅料（如白酒），有助于弥补泡菜风味的不足[8]，而在工业生产上，为提高泡菜风味品质，同时避免生产过程中出现生花现象，部分企业也会在泡菜水中添加白酒[9]。然而，中国传统酱香型、浓香型和清香型白酒具有不同的风味特征与感官属性。相比于香型较浓的酱香型和香型较清爽的清香型，以乙酯类为风味形成关键化合物的浓香型白酒呈现的窖香、花香、果香和甜香的气味较为适中[10]，更适合作为辅料进行添加。但添加白酒作为辅料对酸菜的风味影响鲜有报道。此外，乳酸菌的生长不可避免会受到乙醇环境的胁迫[11]。研究表明，过高的乙醇浓度会增加乳酸菌细胞膜的通透性，引起胞内物质外流同时影响菌体内酶的活性，进而影响菌体的代谢与生理活性，抑制其生长甚至造成死亡[12-14]。因此为了有效提高乳酸菌在发酵后期生长代谢的稳定性，选育对醇类胁迫稳定的菌种势在必行。
本研究探究了酸菜中常见的7株乳酸菌的产酸能力与耐乙醇特性，并从中筛选优良性能的乳酸菌复配成发酵剂。将复配的发酵剂对大白菜进行接种发酵，通过添加浓香型白酒，对比不同方式发酵酸菜的挥发性风味物质与感官特性，明确筛选复配的乳酸菌发酵剂的实际应用效果以及白酒对东北酸菜风味与滋味的改善作用，旨在为东北酸菜的品质提升与酸菜发酵剂的研制提供依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）LNJ005：辽宁省农业科学院食品与加工研究所；发酵乳杆菌（Lactobacillus fermentum）BNCC194390、短乳杆菌（Lactobacillus brevis）BNCC337373、干酪乳杆菌（Lactobacilluscasei）BNCC134415、嗜酸乳杆菌（Lactobacillus acidophilus）BNCC186447、清酒乳杆菌（Lactobacillus sake）BNCC192620、柠檬明串珠菌（Leuconostoc citreum）BNCC194779：自北纳创联生物技术有限公司。大白菜、食盐和白酒（浓香型，酒精度42%vol）：辽宁省沈阳市农科院综合市场。
MRS液体培养基：蛋白胨10.0 g，牛肉粉8.0 g，酵母浸粉4.0 g，葡萄糖20.0 g，硫酸镁0.2 g，乙酸钠5.0 g，柠檬酸三铵2.0 g，磷酸氢二钾2.0 g，硫酸锰0.05 g，吐温80 1.0 g，蒸馏水1 L，调pH为6.0～6.4。121 ℃灭菌20 min。
MRS固体培养基：在MRS液体培养基中加入24 g/L琼脂，121 ℃灭菌20 min。
1.2 仪器与设备
SW-CJ-1FD型单人单面工作净化台：上海沪净医疗器械有限公司；CJ50-3叠加式培养箱：上海程捷仪器设备有限公司；YXQ-LS立式压力蒸汽灭菌器：上海博迅实业有限公司医疗设备厂；756型紫外可见分光光度计：上海菁华科技仪器有限公司；5975C气相色谱-质谱联用（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）仪：安捷伦科技有限公司；SA402B型电子舌：日本INSENT公司。
1.3 实验方法
1.3.1 菌种活化与稀释
将植物乳杆菌、干酪乳杆菌和柠檬明串珠菌的冻干菌粉分别接入20 mL的MRS液体培养基，30 ℃培养24 h。从菌悬液中取0.2 mL接种到20 mL的MRS液体培养基，30 ℃培养24 h。将二次传代培养的菌悬液进行10倍梯度稀释（10-4、10-5、10-6、10-7），分别从中取0.2 mL涂布于MRS固体培养基中30 ℃培养48 h。计算乳酸菌菌落总数。
1.3.2 耐乙醇、产酸能力强乳酸菌的筛选
取0.2 mL从二次传代培养的菌悬液，接入不同乙醇体积分数（1%、2%、4%、6%、8%、10%）的MRS固体培养基中进行涂布，30 ℃培养48 h，测定菌株存活率，筛选耐乙醇能力强的乳酸菌。
存活率Rsur计算公式如下：
式中：Na为未添加乙醇的MRS固体培养基中生长的乳酸菌数，CFU/mL；Nb为添加不同乙醇含量MRS固体培养基中生长的乳酸菌数，CFU/mL。
将对乙醇具有较高耐受性的乳酸菌在体积分数4%乙醇的MRS液体培养基中30 ℃培养24 h。每隔3 h测定菌液pH值，绘制选定乳酸菌在乙醇环境下的酸度变化曲线，筛选产酸能力强的乳酸菌。
1.3.3 人工接种东北酸菜样品制备及挥发性风味成分、感官特性分析
将筛选出的耐乙醇能力和产酸能力较强的乳酸菌的菌悬液以生理盐水稀释到相同浓度（菌体数量级为107CFU/mL）。将耐乙醇能力和产酸能力较强的乳酸菌菌悬液稀释液等体积混合均匀，制成液体混合菌发酵剂。
大白菜清洗切丝后，添加2%的食盐，搅拌均匀。随后将白菜丝装入塑料泡菜瓶中并压实。将液体发酵剂加入泡菜瓶中，封口前，向每个泡菜瓶中添加2%的白酒，20 ℃密封发酵30 d。酸菜样品从泡菜瓶的上、中、下三层收集，并混合均匀，备用[15]。自然发酵得到的酸菜（未添加发酵剂和白酒）编号为NF，植物乳杆菌发酵得到的酸菜编号为L.P，植物乳杆菌、干酪乳杆菌和柠檬明串珠菌混合发酵得到的酸菜编号为3LAB，3种乳酸菌混合发酵且添加白酒发酵得到的酸菜编号为3L+B。测定4种酸菜的理化、微生物指标并分析其挥发性风味成分及感官特性。
1.3.4 测定方法
可滴定酸：按照参考文献[16]的方法进行测定。还原糖含量：按照参考文献[15]的方法进行测定。
挥发性风味物质成分测定：采用顶空固相微萃取-气质联用方法（head space-solid phase microextraction-GC-MS，HS-SPME-GC-MS）对样品风味物质进行测定[15]。
样品处理：取5 g酸菜样品置于15 mL顶空瓶中，于60 ℃水浴40min，然后插入老化的纤维头，60℃条件下萃取40min。将萃取好的纤维头插入GC-MS的进样口，250 ℃解吸5 min。
气相色谱条件：Rxi-5Sil MS 色谱柱（30 m×250 μm×0.25 μm），高纯度氦气（He）作为载气，流速为1 mL/min，以1∶3的分流比运行。升温程序：柱温35 ℃保持3 min，以6 ℃/min升至160 ℃，再以10 ℃/min升至250 ℃，保持3 min。
质谱条件：离子源温度为200 ℃。电子电离（electron ionization，EI）源，电子能量为70 eV，质谱扫描范围为20～500 m/z。
感官评价：采用卫玲玲等[17]的方法并稍作修改。感官评分标准见表1。
表1 酸菜感官评分标准
Table 1 Sensory evaluation standards of Suancai
电子舌测定：采用配备酸、苦、涩、鲜、咸5个传感器的SA402B型电子舌。取自然发酵和添加白酒的人工接种发酵酸菜的发酵液各50 mL于测量杯中，每种样品重复测定4次。
1.3.5 数据分析
通过“SPSS 20.0”软件进行方差分析，在P＜0.05水平上进行Duncan检验。借助“Excel 2016”软件进行感官评价的统计与分析。采用“Origin 9.0”软件进行图形绘制。
2 结果与分析
2.1 耐乙醇乳酸菌的筛选
由表2可知，随乙醇含量的增加，乳酸菌的存活率均下降。发酵乳杆菌、嗜酸乳杆菌、清酒乳杆菌在乙醇体积分数为6%时，存活率均降至80%以下。表明这3种菌对乙醇的耐受程度较低。由于干酪乳杆菌、短乳杆菌、柠檬明串珠菌和植物乳杆菌在体积分数4%乙醇条件下存活率均＞90%，表明这4种菌对体积分数4%乙醇的耐受程度较高。因此选择这4种菌进行产酸能力测定。
表2 不同乙醇体积分数对乳酸菌存活率影响
Table 2 Effects of different volume fraction of ethanol on the survival rate of lactic acid bacteria
2.2 乙醇对乳酸菌产酸能力的影响
由图1可知，未添加和添加体积分数4%乙醇的植物乳杆菌、柠檬明串珠菌和干酪乳杆菌的产酸趋势基本相同。其中，植物乳杆菌和柠檬明串珠菌在添加乙醇后，分别在生长3 h和15 h时，环境的pH已经达到5以下。而添加乙醇的干酪乳杆菌初期生长平稳，18 h时后pH下降到5以下。相比之下，添加乙醇的短乳杆菌产酸速率较低，生长36 h后环境pH降到5以下。植物乳杆菌产酸速率快，能力强，生长稳定期环境pH达到3.6左右。柠檬明串珠菌前期生长略受抑制，但其产酸速率较快。而干酪乳杆菌中后期产酸速率快，且生长不受体积分数4%乙醇影响。因此可以选择植物乳杆菌、柠檬明串珠菌和干酪乳杆菌复配成生长稳定，产酸速率快、能力强的混合发酵剂。
图1 乙醇对4株乳酸菌产酸能力的影响
Fig.1 Effects of ethanol on the acid production ability of 4 lactic acid bacteria
2.3 白酒结合耐乙醇混菌发酵剂对酸菜微生物及理化指标的影响
采用植物乳杆菌、柠檬明串珠菌和干酪乳杆菌混合接种发酵酸菜，单纯植物乳杆菌发酵和自然发酵酸菜的菌落总数、可滴定酸含量和还原糖含量见图2。
图2 酸菜的菌落总数、可滴定酸和还原糖含量测定结果
Fig.2 Determination results the total number of colonies,titratable acid and reducing sugar content of Suancai
通过比较发现，自然发酵的酸菜中包含最多的乳酸菌数为9.22 lg（CFU/mL），而三种菌混合发酵酸菜的乳酸菌数又略少于植物乳杆菌接种发酵的酸菜。这可能是由于外源乳酸菌的添加，尤其是柠檬明串珠菌和植物乳杆菌产酸快，在发酵初期使得发酵环境的pH急剧下降，因此白菜自身或环境中所夹带的其他部分乳酸菌的生长因急剧的酸性环境变化而被抑制[18]。另一方面，韩宏娇等[19]认为发酵后期由于营养物质不断被消耗，导致发酵液中乳酸菌生长所需的碳、氮源不足，因此乳酸菌数减少。虽然发酵剂选用的是耐乙醇的乳酸菌，但添加白酒发酵的酸菜中乳酸菌数仍有所下降，这可能是由于白酒中的其他物质对乳酸菌的生长也有影响。此外，人工接种乳酸菌发酵酸菜的可滴定酸和还原糖含量均高于自然发酵的酸菜。由于接种快速产酸的乳酸菌后，乳酸菌代谢产生大量的乳酸、乙酸、丙酸等有机酸，快速增加了发酵液中可滴定酸的含量[20]。而接种乳酸菌发酵酸菜的还原糖含量较高，一方面由于大量的外源乳酸菌，对蔗糖具有高的利用率，而减少了对葡萄糖和果糖等还原糖的消耗，保留了部分还原糖[21]；另一方面，自然发酵酸菜中更多的微生物利用并消耗了还原糖，而人工接种发酵酸菜的乳酸菌活菌数少，因此代谢消耗的糖量减少，从而人工接种乳酸菌发酵酸菜的还原糖高于自然发酵的酸菜[22-23]。值得注意的是接种发酵的酸菜中，添加白酒的混菌发酵酸菜的可滴定酸含量比未添加白酒的混菌发酵酸菜降低4.02%，比单植物乳杆菌发酵的酸菜降低6.64%。成品过度酸化往往是发酵蔬菜工业生产中的一大难题[24]，而从结果上来看，白酒的添加，降低了乳酸菌发酵酸菜的酸度，这表明白酒的添加可以抑制乳酸菌发酵酸菜的过度酸化，使酸菜口感更加柔和。
2.4 白酒结合耐乙醇混菌发酵剂对酸菜风味及挥发性成分的影响
采用GC-MS对自然发酵酸菜、植物乳杆菌接种发酵酸菜、混菌接种发酵酸菜和添加白酒的混菌发酵酸菜的挥发性风味成分进行分析比较，结果见表3。
表3 不同发酵方式酸菜挥发性风味成分
Table 3 Volatile components of Suancai under different fermentation modes
续表
续表
注：“-”表示未检出。
四种发酵方式酸菜的风味物质及挥发性成分有明显差异。自然发酵的酸菜共检测出45种物质，而接种植物乳杆菌和混菌发酵的酸菜检测出的物质均较少，分别为27种和30种。自然发酵酸菜的风味及挥发性物质以醇为主（40.92%），其次是酸（19.09%）、氨基酸（13.08%）和碳氢化合物（8.68%）。接种植物乳杆菌和混菌发酵酸菜的风味及挥发性物质中醇、酯和氨基酸的含量高于自然发酵，而碳氢化合物低于自然发酵酸菜。相比之下，添加白酒并接种混菌发酵的酸菜检测出42种物质。虽然醇类含量较低（27.34%），但酸、酯和氨基酸的含量较高，分别占总量的6.66%、25.99%和20.80%。含碳数较低的脂肪酸乙酯是酒类的主体成分，具有鲜花及果香[25]，尤其是己酸乙酯与丁酸乙酯是浓香型白酒的主要香味成分，而添加白酒不仅为酸菜增加了低碳脂肪酸的占比，还引入了独有的己酸乙酯与丁酸乙酯，增加了酸菜的芳香气味。与接种发酵的酸菜相比，白酒增加了酸菜中乙酸的占比。乙酸具有清爽的米醋香味，能够增加酸菜的爽口度。然而，白酒的添加，导致了酸菜中酸类物质种类的减少，与氨基酸含量的增加。这与可滴定酸降低的结果一致，也表明白酒可以促进酸类向氨基酸的转化。此外，添加白酒的酸菜检测出了自然发酵和接种发酵并未检测出的酮类和含硫化合物。酮类物质具有浓郁的香味，是酒类风味的重要组成[26]，具有香气的调节作用。因此添加白酒接种发酵的酸菜中检测到的新的风味物质结构能够赋予酸菜独特的风味特征，而较少种类与含量的醇、呈味酸以及较高含量的氨基酸又能为酸菜呈现新的滋味。
2.5 白酒结合耐乙醇混菌发酵剂对酸菜感官品质的影响
酸菜感官品质评价结果见图3。从图3A和图3B中酸菜的感官评分结果可以看出，自然发酵的酸菜在感官品质上优于仅由乳酸菌接种发酵的酸菜，这一结果在其他相关研究中也得到认证[27]。与单植物乳杆菌发酵的酸菜相比，混合乳酸菌发酵的酸菜在颜色、香气、味道和口感上均有优势。而添加了白酒并由混菌发酵剂发酵的酸菜在感官评分上明显高于仅由乳酸菌接种发酵甚至是自然发酵的酸菜，尤其是在颜色、味道和口感上具有显著优势。虽然在香气品质上稍逊于自然发酵，但也明显好于仅由乳酸菌接种发酵的酸菜。
图3 酸菜的感官品质评价结果
Fig.3 Sensory quality evaluation results of fermented suancai
A感官评分；B感官特性；C电子舌风味分析。
由图3C可知，添加白酒的接种发酵酸菜与自然发酵酸菜相比，酸味和鲜味略有提高。这与可滴定酸含量和风味物质成分的测定结果一致，与自然发酵相比，添加白酒发酵的酸菜的酸类物质和氨基酸占比增加，因此酸味和鲜味提升。此外，白酒结合混菌发酵可以降低酸菜苦味，尤其降低了苦和涩的后味，这与还原糖测定结果一致，添加白酒导致酸菜还原糖含量增加，因此降低了苦味。而苦涩味降低能有效提高品尝的愉悦感。综合主观和客观的感官评价结果，表明筛选的植物乳杆菌、干酪乳杆菌和柠檬明串珠菌混合作发酵剂在对改善人工接种单一乳酸菌发酵酸菜的感官品质上具有有效作用，而白酒的添加对于人工接种乳酸菌发酵酸菜的品质的进一步提升具有重要意义。
3 结论
本研究从7种发酵酸菜常用乳酸菌中筛选出3种耐乙醇型乳酸菌，分别为植物乳杆菌、干酪乳杆菌和柠檬明串珠菌，并复配成发酵剂，用于酸菜的发酵。通过对耐乙醇型复配发酵剂发酵的酸菜的乳酸菌数、可滴定酸含量和还原糖以及感官品质进行分析，耐乙醇型复配发酵剂适用于酸菜的发酵，可以抑制酸菜的后酸化，同时形成以酯、酮、含硫化合物和氨基酸为主的新型风味结构，改善人工接种酸菜的感官品质并显著提升酸菜的鲜味。该结果为进一步研究人工接种乳酸菌发酵酸菜的风味形成机理提供理论基础，同时，对乳酸菌发酵酸菜的品质提升和新产品创制提供思路。
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