葡萄酒的酿造是酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae，SC）将糖转化为酒精以及多种微生物协同参与的过程[1]，酵母菌自身发酵特性和代谢途径的不同，同时也会造成葡萄酒具有品质[2]和风味[3]的不同。目前，商业酿酒酵母的使用最为广泛，既具有良好的发酵特性又能够提升葡萄酒的口感与品质，但其会造成葡萄酒一些关键香气的丢失[4]。而有些非酿酒酵母（non-S.cerevisiae，NSC）能够赋予葡萄酒更加复杂的香气[5]并且具有较好的发酵性能。香气物质是评价葡萄酒品质和风味的重要指标，葡萄原料、酿酒酵母和酿造工艺是决定香气物质的关键因素[6-7]。因此使用非酿酒酵母对葡萄酒进行增香酿造和改善葡萄酒品质的研究越来越多。如毕赤酵母被证明在葡萄酒增香酿造提高花果香气中具有极大应用潜力，其具有高产乙酸乙酯和乙酸异丁酯等酯类特性[8]，祝霞等[9]利用戴尔有孢圆酵母（Torulaspora debrueckii）和SC混合发酵葡萄酒，可明显提升贵人香低醇白葡萄酒的香气品质；BELY M等[10-11]利用戴尔有孢圆酵母与SC按20∶1混合发酵使葡萄酒中的挥发酸酸度和乙醛含量降低了50%～60%。因此，选择优质的非酿酒酵母对葡萄酒的增香酿造具有重要的意义。
试验以前期研究从新疆天山北麓产区酿酒葡萄表皮分离筛选得到的3株优质野生非酿酒酵母菌为基础，探究非酿酒酵母菌的增香酿造潜力，用3株非酿酒酵母与商业酿酒酵母混合发酵赤霞珠干红葡萄酒，通过顶空固相萃取-气相色谱质谱联用（headspace solid phase extraction-gas chromatography-mass spectrometry，HS-SPME-GC-MS）技术检测酒样的挥发性香气成分，结合主成分分析（principal component analysis，PCA）及气味活度值（ordor activity value，OAV）对酒样的主要挥发性香气成分进行比较，以期开发具有增香酿造潜力的非酿酒酵母，为酿造具有本地特色的葡萄酒提供菌种资源。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
赤霞珠（Cabernet Sauvignon）酿酒葡萄：2021年10月采自新疆西域明珠葡萄酒有限公司葡萄园，葡萄可溶性固形物质量分数21.32%，可滴定酸质量浓度为7.21 g/L，pH 3.6，采后置于4 ℃冷库中保藏。
AWRI 796型活性酿酒酵母（S.cerevisiae）：澳大利亚Mauribrew公司；果胶酶（≥500 U/mg）、偏重亚硫酸钾（分析纯）：法国LALLEMAND公司；2-辛醇（色谱纯）：上海源叶生物科技有限公司。
毕赤克鲁维酵母（P.kluyveri）HSX-5、长孢洛德酵母（L.elongisporus）MNS-6、戴尔有孢圆酵母（T.debrueckii）YQX-8，30%无菌甘油-80 ℃保藏。
1.2 仪器与设备
75 μm CAR/PDMS萃取头：美国Supelco公司；HP-INNOWax毛细管色谱柱（30 mm×0.25 mm×0.5 μm）、7890B-5977A型气相色谱-质谱联用仪：美国Agilent公司；C-MAG HS 4型磁力搅拌器：德国IKA公司。
1.3 试验方法
1.3.1 菌株的活化
酿酒酵母活化：按照商业酵母使用说明活化，并调整菌浓度为1×106 CFU/mL；非酿酒酵母活化[12]：通过6%无菌葡萄糖溶液28 ℃培养24 h扩大培养两次，第3次使用糖度为8%的葡萄汁溶液接种第2次扩培发酵液，28 ℃培养24 h后调整菌体浓度为1×106 CFU/mL。
1.3.2 赤霞珠干红葡萄酒的制备
选取新鲜的赤霞珠葡萄，除梗、去杂质坏果，破碎，取1.2 L葡萄醪置于2 L玻璃瓶中，添加100 mg/L偏重亚硫酸钾，2 h后按照10 mg/L加入果胶酶并20 ℃浸渍24 h。处理后按照葡萄醪体积的5%（V/V）接种菌株HSX-5、菌株YQX-8、菌株MNS-6，发酵48 h后按照5∶1比例接入酿酒酵母（SC），在25 ℃条件下进行酒精发酵，以酿酒酵母单菌发酵作为空白对照。在酒精发酵时，每天测温度和比重，当比重为0.993～0.996时，进行皮渣分离。皮渣分离后监控酒样中还原糖含量，待还原糖含量低于3 g/L时加入100 mg/L偏重亚硫酸钾终止发酵，收集葡萄汁于4 ℃进行苹果酸-乳酸发酵30 d，得到赤霞珠干红葡萄酒。每个酒样分为三部分，在15 ℃条件下装瓶保存待分析。
1.3.3 理化指标测定
葡萄酒酒度、残糖、总酸等理化指标参照国标GB 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》[13]测定。
1.3.4 挥发性香气物质的测定
挥发性香气成分测定采用SPME-GC-MS法，具体参考余欢等[14]的方法。
挥发性香气物质的提取：取10mL葡萄酒样品置于20mL顶空瓶中，加入5 μL 100 μg/mL的2-辛醇后加入磁力转子并密封顶空瓶，将老化后的75 μmCAR/PDMS萃取头插入样品瓶顶空部分，于45 ℃吸附45 min，吸附后的萃取头取出后插入气相色谱进样口，于250 ℃解吸3 min，启动GC-MS仪器进行分析。
GC-MS分析主要参考PLESSAS S等[15]方法。气相色谱条件：采用恒定流量模式，起始柱温40 ℃，以5 ℃/min升至90 ℃；再以10 ℃/min升至230 ℃，保留7 min。载气为纯度99.99%的氦气（He），流量0.8 mL/min，汽化室温度230 ℃。质谱条件：电子电离（electron ionization，EI）源；电子能量70 eV，接口温度为250 ℃，离子源温度为200 ℃，灯丝发射电流为100 μA，检测器电压1 kV。
定性定量方法：通过比较质谱与美国国家标准技术研究所（national institute of standards and technology，NIST）15质谱数据库结合文献比对来鉴定化合物质，保留正、反匹配度均大于800（最大值为1 000）的鉴定结果。挥发性物质的定量[13]采用内标法，以2-辛醇作为内标，其计算公式如下：
式中：CX为待测组分质量浓度，μg/L；M1为各组分的峰面积；M2为内标物的峰面积；V1为内标物质量浓度，μg/L。
同时通过香气浓度除以其阈值计算各香气化合物的气味活度值（OAV），OAV越大香气化合物对风味的贡献越大。
1.3.5 数据分析
采用SPSS 19.0进行香气物质组间显著性差异分析（Duncan检验，P＜0.05），使用Origin Pro 2019软件进行PCA主成分分析，Microsoft Office 2016进行挥发性香气数据的整理。
2 结果与分析
2.1 赤霞珠干红葡萄酒理化指标
不同菌株发酵赤霞珠干红葡萄酒样品发酵结束后的理化指标测定结果见表1。由表1可知，4个酒样的酒精度在12%vol左右，残糖均低于3 mg/L，发酵比较彻底，没有酸败现象。与对照组SC相比混合发酵酒样总酸质量浓度上升，但挥发酸质量浓度均降低，这与BELY M等[10]研究结果一致。pH值均在3.4左右，葡萄酒具有较好的稳定性以及感官品质。不同菌株发酵赤霞珠干红葡萄酒酒样理化指标均符合国家标准GB/T 15037—2006《葡萄酒》[16]，适用于后续对其香气成分的测定。
表1 不同菌株发酵干红葡萄酒样品理化指标检测结果
Table 1 Determination results of physical and chemical indexes of dry red wine samples fermented by different yeast strains
注：同列不同字母表示组间存在显著性差异（P＜0.05）。
2.2 赤霞珠干红葡萄酒挥发性香气成分
由表2可知，在不同菌株发酵赤霞珠干红葡萄酒酒样中共检出56种挥发性香气物质，其中SC酒样37种，PK1酒样41种，PK2酒样44种，PK3酒样39种，包括16种酯类、19种醇类、9种醛类、7种酸类、2种酮类和3种萜烯类。各混合发酵酒样组间除酸类物质之外，其他香气物质组成和含量之间均存在显著差异（P＜0.05），既有新生成的物质，也有损失的物质，非酿酒酵母对葡萄酒酯类和醇类物质改善最为显著。
表2 不同菌株发酵干红葡萄酒样品的挥发性香气成分测定结果
Table 2 Determination results of volatile aroma compounds in dry red wine samples fermented by different yeast strains
续表
注：同行不同字母表示组间差异显著（P＜0.05），“nd”表示未检出；阈值中“nf”表示该物质阈值未查出；OAV值中“-”表示其OAV＜0.1。
2.2.1 非酿酒酵母对葡萄酒香气成分的影响
酿酒酵母在酒精发酵过程中通过自身代谢生成酒精的同时会产生甘油和高级醇等副产物[21]，其中高级醇对葡萄酒的风味具有重要作用，当质量浓度＞400 mg/L时，会使葡萄酒具有强烈的刺鼻味，而当质量浓度＜300 mg/L时，可以使葡萄酒的香气更具复杂性[22]。由图1和表2可知，在各混合发酵葡萄酒样品中共检出19种醇类物质，总质量浓度均＜300 mg/L，相较于单菌发酵的SC酒样，混合发酵酒样中的高级醇含量均显著增加（P＜0.05），主要是异戊醇和2-苯乙醇含量的显著增加（P＜0.05）。其中异戊醇含量从44.25mg/L（SC酒样）上升至58.21mg/L（PK1酒样）、54.80mg/L（PK2酒样）和57.02 mg/L（PK3酒样），分别上升32%、24%和29%，且其OAV＞1，是葡萄酒的主要香气物质。适量的异戊醇可以增加葡萄酒的醇厚感。2-苯乙醇可以赋予葡萄酒玫瑰和蜂蜜气味[23]，同时也是威代尔冰葡萄酒的特征香气[24]，通常相较于酿酒酵母，非酿酒酵母具有更强的产2-苯乙醇能力。研究发现混合发酵样品的2-苯乙醇含量均高于单菌发酵酒样SC，其中PK3酒样中2-苯乙醇质量浓度最高（4 367.91 μg/L），说明长孢洛德酵母更具产2-苯乙醇能力。在检测到的其他醇类物质中，PK1酒样新生成了月桂醇、2-癸烯-1-醇，PK2酒样新生成了2,3-丁二醇、3-乙基-2-戊醇、正癸醇，PK3酒样2,3-丁二醇、正癸醇、1,3-丁二醇，在一定程度上使葡萄酒风味更具复杂性。
图1 不同菌株发酵干红葡萄酒样中各类别挥发性香气物质含量比较
Fig.1 Comparison of contents of various types of volatile aroma compounds in dry red wine samples fermented by different yeast strains
酯类物质对葡萄酒的花果香气具有主要贡献[22]。在葡萄酒样品中共检出16种酯类物质，其中SC酒样（12种）、PK1酒样（12种）、PK2酒样（15种）、PK3酒样（13种），相较于SC酒样（17.73 mg/L），PK1酒样（22.68 mg/L）和PK2酒样（20.92 mg/L）混合发酵酒样酯类物质总含量均显著升高（P＜0.05）。主要表现为辛酸乙酯、己酸乙酯和乙酸乙酯含量的上升以及物质组成的差异，其中辛酸乙酯具有白兰地的香气，己酸乙酯具有草莓、菠萝香气，乙酸乙酯可赋予葡萄酒微带果香的酒香气味。同时PK1新生成了乙酸异丁酯和乙酸异戊酯，PK2新生成了乙酸异丁酯、乙酸异戊酯和水杨酸甲酯，PK3新生成了丙酮酸乙酯，乙酸异丁酯和乙酸异戊酯的OAV均＞1，是PK1和PK2酒样的主要香气，增强了葡萄酒的香蕉等水果香气。在检出的16种酯类物质中共有8种物质OAV＞1，为葡萄酒的主要贡献香气，其含量在混合发酵酒样中表现为上升，增强了葡萄酒花果类香气强度。
葡萄酒中的酸类物质主要来源于葡萄果实和酒精发酵代谢，其中脂肪酸是主要的酸类物质，当脂肪酸气味活度值＜1时，可以增加葡萄酒风味复杂性[25]。由表2可知，在酒样中共检测出7种酸类物质，其中SC酒样5种，PK1酒样7种，PK2和PK3酒样6种，从酸类物质总含量角度单菌发酵和混合发酵差异不显著，但混合发酵也具有一定的降酸作用。但相较于SC酒样，混合发酵酒样新生成了丙酮酸和硬脂酸，多样的酸类物质是有利于葡萄酒的平衡。在检出的酸类物质中，只有辛酸的OAV＞1，是葡萄酒的的主要酸类香气物质，会给葡萄酒带来酸败的味道，而PK1酒样降低了辛酸的含量，对葡萄酒风味具有积极的作用。
葡萄酒中的醛类物质主要来源于酒精发酵过程氨基酸在酶的作用下产生的醛。由表2可知，在4个酒样中共检出9种醛类物质，相较于SC酒样（46.84 μg/L），PK1（122.54 μg/L）和PK2（96.00 μg/L）中的醛类物质显著提升（P＜0.05），其中壬醛和葵醛的OAV＞1，是主要的醛类香气物质，在PK1和PK2中的含量均显著提升（P＜0.05），增加了葡萄酒的脂蜡香和甜橙香气。在其他香气物质中，共检出3种萜烯类和2种酮类，其中PK2酒样新生成了2-辛酮，增加了葡萄酒苹果香气；在PK1和PK2酒样中检出β-大马士酮，能够贡献葡萄酒中的甜香、花香和蜂蜜香[26]。PK2酒样香茅醇含量显著提升，赋予葡萄酒新鲜玫瑰类香气。同时PK1和PK3酒样新生成了橙花醇，增加了葡萄酒中的玫瑰和橙花的香气。
2.2.2 主要香气成分主成分分析
为了进一步比较非酿酒酵母菌对葡萄酒香气的影响，选取OAV＞0.1的22种香气化合物进行主成分分析，结果见图2。由图2可知，两个主成分PC1和PC2的方差贡献率分别为55.1%和26.7%，累计方差贡献率为81.8%。4个酒样在载荷图中分别位于四个象限中且距离较远，说明酒样之间存在显著差异。
图2 不同菌株发酵干红葡萄酒样品中OAV＞0.1的香气化合物主成分分析结果
Fig.2 Results of principal component analysis of aroma compounds with OAV＞0.1 in dry red wine samples fermented by different yeast strains
酿酒酵母单菌发酵酒样SC主要贡献香气有庚酸乙酯、正己醇、辛酸和香茅醇；混合发酵PK1酒样主要贡献香气为辛酸乙酯、葵酸乙酯、乙酸乙酯、乙酸异丁酯、壬酸乙酯、2-苯乙醇和壬醛；PK2酒样主要贡献香气为丁酸乙酯、己酸乙酯、乙酸异戊酯、乙酸苯乙酯、1-辛醇、1-壬醇、异丁酸、葵醛和β-大马士酮；PK3酒样主要贡献香气为异丁醇和异戊醇。其中PK1和PK2混合发酵酒样的OAV较高，对葡萄酒的风味更具有积极正面的影响。
3 结论
通过对3株自选优质非酿酒酵母与商业酿酒酵母混合发酵赤霞珠葡萄酒的挥发性香气物质进行检测分析，共检出56种挥发性香气物质，其中包括16种酯类、19种醇类、9种醛类、7种酸类、2种酮类和3种萜烯类。与商业酵母单菌发酵相比，毕赤克鲁维酵母HSX-5和戴尔有孢圆酵母YQX-8能够显著增加葡萄酒酯类香气物质（P＜0.05），主要是辛酸乙酯、己酸乙酯和乙酸乙酯，增强葡萄酒花果类香气；混合发酵酒样中的醇类物质均高于酿酒酵母单菌发酵，表现为2-苯乙醇和异戊醇等高级醇含量的上升，赋予葡萄酒厚重的口感和玫瑰类香气。同时混合发酵各组均产生了新物质，增加了葡萄酒风味体系的丰度。主成分分析结果表明，4个酒样间存在显著差异，其中毕赤克鲁维酵母HSX-5和戴尔有孢圆酵母YQX-8发酵酒样主要贡献香气种类较多且气味活度值较高，对葡萄酒香气的影响显著。结果表明，菌株HSX-5和YQX-8更具有增香酿造潜力，后续工作可进一步探索促进香气的机理以及和酿酒酵母的协同作用机理。
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