鱼露又被称为鱼酱油，以低值鱼和一定比例的海盐作为原料，经过数月甚至数年的自然发酵制成，是广东、福建等地常见的调味品。作为一种流行的调味品，传统鱼露具有突出的鲜味和咸味，并伴有一定的甜味和苦味。鱼肉中的蛋白质、脂质和糖类等营养物质在微生物和內源酶等作用下分解并发生美拉德反应，脂肪氧化、斯特勒克降解等代谢反应，产生醛、酮、醇、酯等化合物，从而形成鱼露独特的风味。发酵过程通常需要很长时间才能确保鱼露的溶解以及风味和颜色的发展，因此在不同的发酵时间下具有不同的味道特征。
整个发酵过程中，醛类物质通常被认为是鱼露的主要挥发性风味贡献物质，如3-甲硫基丙醛、3-甲基丁醛和2-辛烯醛等[1]，通常带有肉香味和烧焦味[2]。而其他物质随着发酵进程逐渐转化，表达出不同的变化趋势，对鱼露挥发性风味进行修饰。研究表明，鱼露在前期（1～3个月）变化较为缓慢，醇类、酸类和醛类物质迅速积累；而到中期（3～9个月），醇类（除1-辛烯-3-醇以外的醇类，尤其是乙醇）含量达到顶峰后，开始消耗，酯类物质含量显著增加，醛类和酸类含量仍然逐渐增加，开始形成较强的香气物质；随着发酵时间的变化，尤其是12个月，鱼露的代谢物明显与其他发酵时期不同[3-5]。然而，目前对鱼露的挥发性物质的变化研究多集中在0～12个月，对于12个月后的变化则不明。鱼露的挥发性风味是非常复杂的体系，对其完整的还原即不破坏其风味并将其完整提取出来是对风味物质研究的重要前提。
顶空固相微萃取（headspace solid-phase micro-extraction，HS-SPME）弥补了传统样品前处理过程技术的不足，提高了分析检测的整体效率，且较能真实的反应样品中挥发性物质组成。气相色谱-质谱联用技术（gaschromatographmass spectrometer，GC-MS）可同时实现挥发性物质的分离和鉴定。HS-SPME-GC-MS技术联用目前已经广泛应用于各类发酵产品的挥发性物质检测与分析，如发酵鱿鱼[6]、发酵虾酱[7]、发酵乳[8]和酸汤[9]等产品。
本研究以鳀鱼为原料，采用传统发酵加工技术进行鱼露制作，并利用HS-SPME-GC-MS方法分析从原料到发酵成熟过程中的挥发性风味物质种类和含量变化，为鱼露特殊风味的形成机理及发酵过程中的质量动态控制及提高鱼露的风味口感提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
鱼露发酵液（未发酵，发酵3个月、6个月、9个月、12个月、15个月）：广东省汕头鱼露厂有限公司。
1.2 仪器与设备
7890A-5975C气相-质谱联用仪（GC-MS）：美国Agilent公司；75 μm CAR/PDMS固相微萃取针：美国Supelco公司。
1.3 方法
1.3.1 样品处理
向25 mL的顶空瓶中加入5 mL鱼露样品和1.5 g NaCl，室温条件下搅拌20 min，45 ℃条件下平衡30 min；将已活化好的SPME纤维头（270 ℃老化30 min）在45 ℃条件下顶空萃取挥发性化合物30 min；于260 ℃条件下解吸5 min，完成进样。
1.3.2 挥发性成分的GC-MS分析
GC条件：色谱柱为HP-INNOWax TM聚乙二醇毛细管柱（60 mm×0.25 mm×0.25 μm），进样口温度为260 ℃，柱初始温度为35 ℃，保持5 min，以6 ℃/min的速率上升至225 ℃并持续10 min；载气为氦气（He），柱流速为1 mL/min；分流比为10∶1。
MS条件：电子电离（electron ionization，EI）源，离子源温度为230 ℃，电子能量70 eV，MS四级杆温度为150 ℃；扫描范围：50～550 m/z。
定性定量分析：GC-MS数据由计算机检索并与图谱库美国国家标准技术研究所（national institute of standards and technology，NIST）0.8L的标准质谱图对照分析，确认物质化学结构和名称。化合物相对含量采用峰面积归一化法进行分析确定。
1.3.3 关键风味化合物分析
参照刘登勇等[10]的方法计算样品中关键挥发性风味物质采用相对气味活度值（relativeodoractivityvalue，ROAV）。
选择对样品总体风味贡献最大的组分定义为ROAVstan=100，其他挥发性物质ROAV则按下式计算：
式中：C%A、TA分别表示各挥发性组分的相对百分含量/%和对应的感觉阈值/（mg/kg）；C%s tan、Ts tan分别表示对样品风味贡献最大组分的相对百分含量/%和感觉阈值/（mg/kg）。
1.3.4 数据处理
用IBM SPSS 25.0、Excel 2019软件和Origin 2019b 64Bit进行数据处理及作图。
2 结果与分析
2.1 发酵期间鱼露挥发性香气成分的鉴定
采用HS-SPME-GC-MS对不同发酵阶段鱼露样品的挥发性成分进行测定。不同发酵阶段鱼露挥发性风味物质总离子流色谱图见图1。由图1可知，鱼露在不同发酵阶段共检测出178种挥发性物质，其中酸类11种、醇类48种、醛类32种、酮类27种、酯类16种、烃类14种、苯环类10种、杂环类10种以及其他类10种。在各个发酵阶段，分别检测出65、69、75、90、90、92种挥发性物质。随着发酵时间的延长，鱼露中的挥发性物质种类和含量逐渐增加，尤其是酸类、酮类、烃类、苯环类。与其他研究相比[3，11-13]，本研究发酵时间更长，所检测到的挥发性风味物质的种类和含量也更多。
图1 不同发酵时间鱼露挥发性成分物质GC-MS分析总离子流色谱图
Fig.1 Total ion chromatogram of volatile compounds in fish sauce at different fermentation time analysis by GC-MS
不同发酵时间鱼露的挥发性风味物质含量见表1。由表1可知，酸类（2.99%～30.02%）、醇类（13.97%～41.77%）和醛类（8.67%～51.61%）总含量明显高于其他类挥发性化合物，这与陈丽丽等[13-14]的检测结果一致。
表1 不同发酵时期鱼露挥发性风味物质分析
Table 1 Analysis of volatile flavor compounds in fish sauce at different fermentation periods
续表
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注：“/”表示未检出。
酸类物质主要来源于氨基酸的分解代谢或脂肪酸的氧化，对鱼露提供奶酪香味。鱼露中含有多种短链挥发性有机酸，如乙酸、丙酸、丁酸及4-甲基戊酸，在整个发酵过程中均被检测到，其主要来源于直链脂肪酸。其中，由葡萄球菌和乳酸菌通过脂肪酸氧化和丙氨酸代谢产生的乙酸随着发酵时间增加，由原来的1.88%增加到12.99%，这与SAKPETCH P等[15]的研究结果一致。丙酸和4-甲基戊酸随着发酵时间先增加后减少。另外异戊酸和戊酸在发酵前期存在，而壬酸只在后期出现。然而，由于酸的阈值较高，酸对发酵鱼的挥发性风味作用较小。
醇类通过氨基酸降解或脂质氧化生成，通常被认为是发酵产品中许多生化反应的前体[16]。发酵水产品中的大部分醇是多不饱和脂肪酸氧化的降解产物，具有蘑菇香味和类金属风味，能够影响发酵水产品风味的形成。正丁醇、正戊醇、1-戊烯-3-醇、正己醇、（Z）-2-戊烯-1-醇及1-辛烯-3-醇在整个发酵过程中均被检测到。其中，丁醇、戊醇随着发酵时间呈减少趋势，1-戊烯-3-醇、己醇、（Z）-2-戊烯-1-醇随着发酵时间先增加后减少，1-辛烯-3-醇随着发酵时间先减少后增加。1-辛烯-3-醇由花生四烯酸氧化而成的，具有蘑菇香味，ZHOU Y Q等[17]的研究也检测到1-辛烯-3-醇，并认为其是鱼露中一种重要的气味化合物。异戊醇、1,3-戊二醇在发酵前期存在，糠醇只在发酵后期出现。异戊醇是由碳水化合物经糖酵解途径（Embden-meyerhof pathway，EMP）途径和氨基酸经Ehrlich途径产生的支链醇，脱羧酶和乙醇脱氢酶参与Ehrlich途径[18]。
醛类化合物阈值低，是食品中重要的香气化合物。通过赋予青草、坚果、糖果和奶酪的气味，醛类化合物通常在不同的发酵产品中被消费者广泛接受[19]。本研究检测到的醛类主要由脂肪醛组成，其中戊醛、己醛、庚醛、辛醛、壬醛和（E）-2-辛烯醛等来源于不饱和脂肪酸的自氧化和酶氧化，而支链醛是由氨基酸通过Strecker降解和微生物代谢活性生成的[20]。己醛、（E）-2-己烯醛、（E）-2-辛烯醛、壬醛及苯甲醛在整个发酵过程中均被检测到。其中，己醛、壬醛和苯甲醛随着发酵时间先减少后增加，（E）-2-己烯醛及（E）-2-辛烯醛随着发酵时间呈增加趋势。3-甲硫基丁醛只在发酵前期存在，2-甲基丁醛、3-甲硫基丙醛在中后期出现。其中，2-甲基丁醛提供坚果香味，是鱼露的特征气味之一[21]，来源于异亮氨酸的Strecker降解。3-甲硫基丙醛的产生是一个由氨基转移酶和α-酮酸脱羧酶活性介导的过程，具有较低的阈值，赋予成品肉味和熟土豆的香味[18]，GIRI A等[21]在发酵鱼酱、鱼露、酱油和酱油制品也检测到3-甲硫基丙醛，并对鱼露的气味影响最大。
酮类化合物由多不饱和脂肪酸氧化或降解，氨基酸降解或微生物氧化产生。据GAO P等[22]报道，酮类物质导致鱼露气味中有奶酪味。在整个发酵过程中，2-丁酮、2,3-戊二酮及3,5-辛二烯-2-酮等均被检测到。其中，2-丁酮和2,3-戊二酮含量呈稳定趋势；3,5-辛二烯-2-酮含量不断增加（0.03%～0.96%），具有动物油脂味和哈喇味，对腥味有一定加和作用[23]。烷基二酮可令食品具有强烈的奶香，2,3-戊二酮及2-丁酮均呈现奶香味，黄油的香味可增强腥味物质的腥味[24]。
酯类是通过有机酸和醇的酯化反应形成的。由短链酸合成的酯类通常有助于产生水果香气，而由长链酸合成的酯类则提供脂肪味[25]。本研究检出了10种芳香族类化合物，有研究表明这些物质可能是因环境被污染而在鱼肉中富集导致，会使鱼露呈不愉快的风味[26]。在样品中检测到的杂环化合物包括吡啶、呋喃及其衍生物。这些化合物通常由美拉德反应或氨基酸分解形成。据报道，在杂环化合物中，呋喃类化合物会对发酵产品产生气味影响，使其具有焦糖、甜味和烘焙风味[27]。吲哚是一类具有复杂气味特征的含氮化合物，被认为是微生物酶分解色氨酸的产物[28]。它们在低浓度时伴随着令人愉悦的气味，而在高浓度时会变成强烈而持久的粪便气味[29]。
烷烃和烯烃是由脂肪酸的自氧化生成的。烷烃类化合物（0.46%～0.97%）通常认为不具有气味活性，故对鱼露整体风味贡献不大。烯烃类化合物（0.32%～5.04%），具有较低的阈值，并且大多带有果香味，因此能赋予鱼露清新和香甜味[25]。在样品中还检测到柠檬烯，通常来自香料，由于其存在于饲料中，可能在鱼中积累[30]。
将各类别挥发性物质含与发酵时间进行皮尔逊相关性分析，其相关性如图2所示，酸类、酮类、烃类、酯类、苯环类、杂环类的相关系数＞0，说明随着发酵时间的延长，这些物质总含量整体呈现上升趋势，15月时百分含量分别达到了28.89%、5.29%、2.26%、2.03%、8.75%、9.13%；醇类、醛类、其他类化合物的相关系数＜0，说明这些物质总含量整体呈现下降趋势，15月时百分比分别达到了13.97%、27.84%、1.84%。
图2 鱼露中各类挥发性物质与发酵时间相关系数图
Fig.2 Correlation coefficient between various volatile substances and fermentation time of fish sauce
2.2 基于ROAV计算分析鱼露的主要挥发性风味变化
对检测结果中的风味成分在水中的香味阈值进行查询并计算，按照食品风味研究的一般方法[31]，当物质的ROAV≥1时，则该物质对于挥发性风味的贡献大，为主要香气成分，ROAV越大，对风味的贡献就越大；当0.1≤ROAV＜1时，该成分起到风味修饰作用[32]。ROAV越大说明这种物质对样品的总体风味贡献也越大。结合表1数据，可判断鱼露发酵0月时，正辛醛对其总体风味贡献程度最大，故规定其ROAV=100，同理，鱼露发酵3月时2-乙基呋喃总体风味贡献程度最大，鱼露发酵6、9、12、15月时3-甲硫基丙醛总体风味贡献程度最大，其他风味成分的ROAV由式（1）计算得出，结果见表2。
表2 不同发酵时间的鱼露主要挥发性风味成分的相对风味活度值
Table 2 ROAVs of the main volatile compounds in fish sauce at different fermentation time
如表2所示，发酵0月鱼露的主体风味物质为醛类、醇类、含氮化合物和含硫化合物；发酵3月鱼露的主体风味物质为酸类、醇类、醛类、酮类、苯环类、杂环类、含氮化合物和含硫化合物；发酵6月鱼露的主体风味物质为醇类、醛类、苯环类、杂环类和含硫化合物；发酵9月鱼露的主体风味物质为醇类、醛类、苯环类和酯类化合物；发酵12月鱼露的主体风味物质为醇类、醛类、苯环类和杂环类化合物；发酵15月鱼露的主体风味物质为醇类、醛类、苯环类和杂环类化合物。异戊醇是整个鱼露发酵过程中的主体风味物质；丁酸、异戊醛、己醛、苯甲醛、2-甲基丁醛、2,3-戊二酮、三甲胺、二甲基二硫、二甲基三硫是鱼露发酵前期的主体风味物质；丁酸乙酯是鱼露发酵中期的主体风味物质；癸醛、（E）-2-壬烯醛、3-乙基苯酚是鱼露发酵后期的主体风味物质；3-甲硫基丙醛是鱼露发酵中后期的主体风味物质且风味贡献率最大，这与李春生等[3]的研究结果一致。为进一步明晰鱼露挥发性风味化合物在发酵过程中的动态变化。
2.3 热图聚类分析
本研究选取在发酵过程中各阶段的主体风味物质，对其含量的变化进行聚类分析，结果见图3。
图3 鱼露发酵过程中挥发性化合物含量变化的聚类分析热图
Fig.3 Cluster analysis heat map of volatile compounds contents during fish sauce fermentation
由图3可知，丁酸、（Z）-4-庚烯醛、癸醛、壬醛、3-甲硫基丙醛、（E,Z）-2,6-壬二烯醛、3-乙基苯酚、丁酸乙酯和苯酚九种物质随发酵时间逐渐增加，说明这9种化合物很大程度上影响了鱼露发酵过程中的风味。发酵3月和6月的鱼露气味相似，发酵9月、12月和15月的鱼露气味相似，说明在发酵3月、9月时，挥发性风味发生显著变化。
3 结论
采用HS-SPME-GC-MS技术，检测了鱼露发酵过程中挥发性风味物质的动态变化，对比分析其发酵过程中变化较明显的化合物，共检测出化合物178种，分别为酸类11种、醇类48种、醛类32种、酮类27种、酯类16种、烃类14种、苯环类10种、杂环类10种以及其他类10种。酸类（2.99%～30.02%）、醇类（13.97%～41.77%）和醛类（8.67%～51.61%）总量明显高于其他类挥发性化合物。酸类、酮类、烃类、酯类、苯环类、杂环类的含量随着发酵时间的延长整体呈现上升趋势，15月时相对含量分别达到了28.89%、5.29%、2.26%、2.03%、8.75%、9.13%；醇类、醛类、其他类化合物的含量则整体呈现下降趋势，15月时相对含量分别达到了13.97%、27.84%、1.84%。然后采用ROAV法和聚类分析发酵过程中各样品的主体风味构成。结果表明鱼露发酵前期的主体风味物质有丁酸、异戊醛、己醛、苯甲醛、2-甲基丁醛、2,3-戊二酮、三甲胺、二甲基二硫、二甲基三硫；发酵中期的主体风味物质是丁酸乙酯；发酵后期的主体风味物质有癸醛、（E）-2-壬烯醛、3-乙基苯酚；3-甲硫基丙醛是鱼露发酵中后期风味贡献率最大的物质。鱼露的主要关键风味物质由丁酸、（Z）-4-庚烯醛、癸醛、壬醛、3-甲硫基丙醛、（E,Z）-2,6-壬二烯醛、3-乙基苯酚、丁酸乙酯和苯酚组成。通过研究鳀鱼发酵过程中风味物质种类和相对含量变化，为鱼露特殊风味的形成机理及发酵过程中的质量动态控制提供参考依据，进一步指导鳀鱼发酵的风味品质优化。
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