软枣猕猴桃（Actinidia arguta），别名奇异莓[1]，在我国黑龙江到广西境内的五岭山地，以及朝鲜、日本、俄罗斯均有分布[2]。其美味多汁，营养丰富，含多种维生素、矿物质、氨基酸等，其中维生素C含量高达4.3 g/kg，远超大枣、橙子等水果[3-5]。软枣猕猴桃可作药用，常被用于治疗肝炎、痢疾等疾病[6]。现代研究表明，其含有多糖、多酚、黄酮等活性物质[7-8]，具有抗氧化[9-10]、抗炎[11]、抗肿瘤[12-13]、降血糖[14-15]、提高免疫力[16]等功效。
梨的香味浓郁，富含多种氨基酸和维生素成分，具有润肺化痰、清热生津降燥等功效[17]。我国梨的品种众多，五九香梨就是其中一种，五九香梨是由中国农业科学院果树研究所培育并被广泛推广的优质品种[18]，目前主要分布在辽宁、北京、甘肃、河南、河北、云南等地。
果酒是一款深受大众喜爱的产品，其具有果实特有的香气和滋味。目前，有学者以软枣猕猴桃为单一水果进行果酒酿造[7，19-20]，也有将软枣猕猴桃与红曲酒混合后再发酵[8]或将软枣猕猴桃与苹果进行复合发酵[21]，得到的果酒口感和风味都较好。然而，市面上的软枣猕猴桃和五九香梨还是主要以鲜果出售为主，但其贮藏期短，易变软、易腐烂[22-23]，造成了资源的浪费。因此，本研究以市售软枣猕猴桃和五九香梨为主要原料制备复合果酒，并优化其发酵工艺，既可解决两种鲜果易腐而带来的浪费问题，也可增加产品品种的多样性，提高产品的附加值，为带动地区经济的发展奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
软枣猕猴桃、五九香梨、白砂糖：市售；葡萄酒、果酒专用酵母：安琪酵母股份有限公司；壳聚糖：山东隆科特酶制剂有限公司；果胶酶（酶活30 000 U/g）：山东隆科特酶制剂有限公司；亚硫酸氢钠（分析纯）：安徽陆荣生物技术有限公司。
1.2 仪器与设备
BHS-6型电热恒温水浴锅：宁波群安实验仪器有限公司；JD-5型酒精计：天津朗瑞安科技有限公司；YS-DS-880型果蔬打碎机：诸城市元杉工业装备有限公司；LB80T型阿贝折光仪：广州市数为电子科技有限公司。
1.3 方法
1.3.1 软枣猕猴桃-梨复合果酒加工工艺流程及操作要点
操作要点：挑选新鲜、无病虫害及机械伤害的软枣猕猴桃和五九香梨，在水中浸泡10 min，再以清水清洗干净并沥水、去核、破碎。将充分破碎后的软枣猕猴桃和五九香梨按一定的质量比混合均匀，再加入0.06%亚硫酸氢钠和100 mg/L的果胶酶，置于50 ℃的恒温水浴锅中水浴3 h。然后以白砂糖调节糖度，并在65 ℃下杀菌、灭酶30 min。冷却后接种经活化的果酒酵母，22 ℃恒温发酵6 d左右，直至发酵液糖度在6%以下时，主发酵结束。过滤皮渣，将所得果酒在20 ℃条件下后发酵5 d，澄清后再在0～4 ℃环境下陈酿2个月，得到软枣猕猴桃-梨复合果酒成品。
1.3.2 软枣猕猴桃-梨复合果酒发酵工艺优化
（1）单因素试验
以传统发酵方法进行果酒发酵，以发酵温度（18 ℃、20 ℃、22 ℃、24 ℃、26 ℃）、酵母接种量（0.03%、0.04%、0.05%、0.06%、0.07%）、初始糖度（15%、18%、21%、24%、27%）、五九香梨与软枣猕猴桃质量比5∶3、4∶3、1∶1、2∶3、1∶3为影响因素，以感官评分和酒精度为评价指标，进行单因素试验。
（2）响应面试验
在单因素试验的基础上，选择发酵温度（A）、酵母接种量（B）、初始糖度（C）和五九香梨与软枣猕猴桃质量比（D）四个自变量，以软枣猕猴桃-梨复合果酒的感官评分（Y）为响应值，进行响应面优化试验。响应面试验设计因素与水平见表1。
表1 复合果酒发酵条件优化响应面试验因素与水平
Table 1 Factors and levels of response surface experiments for compound fruit wine fermentation conditions optimization
1.3.3 感官评价
参考陈桂飞等[24]的感官评价方法并作相应修改，分别从澄清度、气味、色泽、口感4个方面进行评分，满分100分。软枣猕猴桃-梨复合果酒感官评分标准见表2。
表2 软枣猕猴桃-梨复合果酒感官评分标准
Table 2 Sensory evaluation standards of kiwiberry-pear compound fruit wine
1.3.4 指标测定
酒精度测定：参照GB 5009.225—2016《酒中乙醇浓度的测定》中的酒精计法；糖度测定：采用折光计法[25]；酸度测定：参照GB 12456—2021《食品中总酸的测定》中的pH计电位滴定法；总糖、干浸出物和挥发酸测定：参照GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》；沙门氏菌测定：参照GB 4789.4—2016《食品微生物学检验沙门氏菌检验》；金黄色葡萄球菌测定：参照GB 4789.10—2016《食品微生物学检验金黄色葡萄球菌检验》。
2 结果与分析
2.1 软枣猕猴桃-梨复合果酒发酵工艺优化单因素试验
2.1.1 发酵温度对感官评分和酒精度的影响
由图1可知，随着发酵温度在18～26 ℃范围内的上升，果酒的感官评分和酒精度呈现先上升再下降的趋势。发酵温度在18～22 ℃时，果酒的感官评分和酒精度随之增加；当发酵温度为22 ℃时，感官评分和酒精度均达到最大值，分别为84分和10.3%vol；当发酵温度高于22 ℃之后，果酒的感官评分和酒精度随之下降。发酵温度较低时，微生物活性较低，生长繁殖速度慢，进而使发酵不充分，果酒风味展现不足，酒精度不够；随着温度的升高，微生物生长繁殖迅速，但超过其最适生长温度则反而会抑制微生物的活性，使发酵时间缩短，发酵不充分，果酒果香不足，酒体寡淡，酒精度较低。因此，选择最佳发酵温度为22 ℃。
图1 不同发酵温度对复合果酒感官评分和酒精度的影响
Fig.1 Effect of different fermentation temperature on sensory score and alcohol content of the compound fruit wine
2.1.2 酵母接种量对感官评分和酒精度的影响
由图2可知，随着酵母接种量在0.03%～0.07%范围内的上升，果酒的感官评分和酒精度呈现先上升再下降的趋势。酵母接种量在0.03%～0.05%时，果酒的感官评分和酒精度随之增加；当酵母接种量为0.05%时，感官评分和酒精度达到最大值，分别为83分和10.2%vol；当酵母接种量＞0.05%之后，酒精度和感官评分随之逐渐降低。分析认为，过量的酵母菌导致发酵液中的糖类被更多地用以微生物自身的生长繁殖，反而使发酵不充分，酒精度降低，果酒变得寡淡，感官评分值下降。因此，选择最佳酵母接种量为0.05%。
图2 不同酵母接种量对复合果酒感官评分和酒精度的影响
Fig.2 Effect of different yeast inoculum on sensory score and alcohol content of the compound fruit wine
2.1.3 初始糖度对感官评分和酒精度的影响
由图3可知，随着初始糖度在15%～27%范围内的上升，果酒的感官评分和酒精度呈现先上升再下降的趋势。当初始糖度在15%～21%范围内增加，复合果酒的感官评分和酒精度随之增加；当初始糖度为21%时，感官评分和酒精度为达到最大值，分别为84分和10.2%vol；当初始糖度＞21%之后，酒精度和感官评分随之逐渐降低。糖分是微生物生长繁殖的重要碳源，是生成酒精的重要底物，糖分充足则发酵产生的风味物质更多，果酒更加饱满，产生的酒精量也更高。然而，糖度太高则会增大发酵环境的渗透压，导致微生物脱水，发生质壁分离，抑制了微生物活力，反而使发酵不充分，酒品质欠佳，酒精度降低。同时，初始糖度太高也会导致酒体偏甜，影响发酵果酒的综合口感。因此，选择最佳初始糖度为21%。
图3 不同初始糖度对复合果酒感官评分和酒精度的影响
Fig.3 Effects of different initial sugar content on sensory scores and alcohol content of the compound fruit wine
2.1.4 五九香梨与软枣猕猴桃质量比对感官评分和酒精度的影响
由图4可知，五九香梨与软枣猕猴桃质量比为5∶3、4∶3、1∶1、2∶3时，复合果酒的感官评分、酒精度呈现上升趋势，在五九香梨与软枣猕猴桃质量比为2∶3时，感官评分、酒精度达到最大值，分别为86分和9.6%vol；五九香梨与软枣猕猴桃质量比在2∶3～1∶3时，风味反而有所下降。分析认为，梨的浓郁风味物质相对较少，甜度相对较低，使发酵果酒的风味不足。随着猕猴桃比例的增大，猕猴桃独特的风味逐渐凸显，果酒风味有所提升。但是，软枣猕猴桃中酸含量相对较高，pH降低影响了酵母的发酵活力，使酒精度也有所降低。因此，选择最佳五九香梨与软枣猕猴桃质量比为2∶3。
图4 不同五九香梨与软枣猕猴桃质量比对复合果酒感官评分和酒精度的影响
Fig.4 Effects of different mass ratio of Wujiuxiang pear and kiwiberry on sensory scores and alcohol content of the compound fruit wine
2.2 软枣猕猴桃-梨复合果酒发酵工艺优化响应面试验
2.2.1 回归模型的建立及方差分析
在单因素试验的基础上，采用Design Expert 10.0.3进行多元回归分析。以发酵温度（A）、酵母接种量（B）、初始糖度（C）、五九香梨与软枣猕猴桃质量比（D）为自变量，以软枣猕猴桃-梨复合果酒的感官评分（Y）为响应值，进行4因素3水平响应面试验设计及结果见表3，方差分析见表4。对表3的数据拟合得到二次多元回归方程如下：
表3 复合果酒发酵条件优化响应面试验设计与结果
Table 3 Design and results of response surface experiments for compound fruit wine fermentation conditions optimization
表4 回归模型方差分析
Table 4 Variance analysis of regression model
注：“**”表示对结果影响极显著（P＜0.01）；“*”表示对结果影响显著（P＜0.05）。
由表4可知，软枣猕猴桃-梨复合果酒感官评分变化的回归模型变量关系极显著（P＜0.01），失拟项不显著（P＞0.05），表明选用的二次多项模型的拟合程度良好。试验模型的决定系数R2=0.978 9，校正决定系数R2adj=0.957 8，表明该回归方程相关性较好。由P值可知，一次项B对结果影响显著（P＜0.05），一次项A、C、D，二次项A2、B2、C2、D2，交互项AC、AD、BD、CD对结果影响极显著（P＜0.01）。由F值可知，影响软枣猕猴桃-梨复合果酒酒品因素的先后排序为：发酵温度（A）＞五九香梨与软枣猕猴桃质量比（D）＞初始糖度（C）＞酵母接种量（B）。
2.2.2 响应面交互作用分析
各因素之间的交互作用对复合果酒感官评分影响的响应面及等高线见图5。
图5 各因素间交互作用对复合果酒感官评分影响的响应面及等高线
Fig.5 Response surface plots and contour lines of effects of interaction between each factor on sensory scores of the compound fruit wine
由图5可知，发酵温度与初始糖度、发酵温度与五九香梨与软枣猕猴桃质量比、酵母接种量与五九香梨与软枣猕猴桃质量比、初始糖度与五九香梨与软枣猕猴桃质量比交互作用的三维图较陡，曲面变化较为明显，说明这几组因素的交互作用对果酒的感官评分影响较大，该结论与表4方差分析结果一致。
2.2.3 验证试验
通过响应面设计试验结果分析，当发酵温度为22.4 ℃、酵母接种量为0.05%、初始糖度为20.5%、五九香梨与软枣猕猴桃质量比为2∶2.92时，感官评分达到理论最大值，为92分。为了使试验操作更简单易行，将最佳条件修正为：发酵温度22 ℃、酵母接种量0.05%、初始糖度21%、五九香梨与软枣猕猴桃质量比2∶3；根据此工艺条件，分别进行3次平行试验，制作软枣猕猴桃-梨复合果酒。所得软枣猕猴桃-梨复合果酒感官评分平均实际值为91分，与理论值基本一致，因此利用响应面法优化此工艺条件是可行性。
2.3 理化指标及微生物指标测定
复合果酒酒精度为10.3%vol，总酸含量为5.4 g/L，总糖含量≤4.0 g/L，干浸出物含量≥18.0 g/L，挥发酸含量（以乙酸计）≤1.0 g/L，致病菌（沙门氏菌和金黄色葡萄球菌）未检出，指标符合标准QB/T 5476—2020《果酒通用技术要求》和GB 2758—2012《发酵酒及其配制酒》中理化指标以及微生物限量要求。
3 结论
通过响应面法确定了软枣猕猴桃-梨复合果酒发酵的最佳工艺条件：发酵温度22 ℃、酵母接种量0.05%、初始糖度21%、五九香梨与软枣猕猴桃质量比2∶3。在此优化工艺条件下，感官评分为91分，酒精度为10.3%vol，得到的软枣猕猴桃-梨复合果酒的颜色淡黄，酒体通透，有软枣猕猴桃和五九香梨特有的复合果香，口感细腻，酒味醇厚，甜度合适。所得的软枣猕猴桃-梨复合果酒的理化指标和微生物指标均符合国家相关标准。
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