蒙古族传统乳制品蕴含着蒙古族丰富的传统文化，有着上千年的历史。其种类繁多、奶香浓郁、营养价值高，主要有浩乳德（奶豆腐）、毕希拉格（熟奶豆腐）、阿尔沁浩乳德（酸奶酪）、乌乳穆（奶皮子）、嚼克（稀奶油）、希日陶苏（黄油）、额德森苏（天然酸奶）和策格（酸马奶）等[1-2]。浩乳德来自蒙古语，中文名为奶豆腐，是蒙古族最为常见的一种乳制品。浩乳德通常是用牛乳经过自然发酵、凝乳、排除乳清、再加热搅揉成型制作而成的食物。其形状和普通豆腐相似，且多为乳白色，呈长方体或正方体。常以奶茶为伴，味微酸，其中拔丝浩乳德，更是内蒙古的特色佳肴。浩乳德以内蒙古中东部的察哈尔民族制作时间最早、产品种类最多、制作工艺最优、风味与营养最佳，曾更是以贡品而进献历代皇帝，是具有一定代表性和重要性的中国传统乳制品[3]。蒙古族传统乳制品含有大量的蛋白质、脂肪酸、维生素、钙、磷及微量元素，且不饱和脂肪酸和人体必需氨基酸含量较高，是老人、小孩补充钙、磷、锌等元素的绝好食物[4]。蒙古族传统乳制品不仅含有大量营养成分和特色风味物质，更蕴含着丰富的益生菌资源，对营养保健功能食品和商业发酵菌剂的开发具有巨大潜力，逐渐成为益生菌资源研究的热点[5]。目前针对传统浩乳德研究主要集中在储藏[6-7]、菌群[8-11]以及功能微生物[12-14]的研究。内蒙古农业大学双全教授在蒙古族传统浩乳德工业化生产[15]以及发酵保护剂优化[16-17]等方面做了开拓性的研究。现已有报道从传统浩乳德中分离获得乳酸片球菌（Pediococcusacidi lactici）、鼠李糖乳杆菌（Lactobacillus rhamnosus）和植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）等具有益生活性的乳酸菌[18-20]。王晓宇等[15]研究表明，利用筛选所得菌种研发的菌剂进行工业化生产奶豆腐时，最终奶豆腐出成率可达8.31%。李伟程等[21]对传统发酵酸牛奶、酸马奶和酸驼奶中益生菌的微生物多样性进行研究，发现发酵酸牛奶中细菌属以乳球菌属为主。莫蓝馨[22]以采集自内蒙古锡林郭勒盟的12份酸马奶和蒙古国巴彦洪格尔省的酸马奶、酸牛奶和奶酪等16份传统发酵乳制品样品为研究对象，共分离鉴定得到105株乳酸菌，其中优势菌为瑞士乳杆菌和马乳酒样乳杆菌。
目前，蒙古族传统乳制品的生产以家庭式或作坊式为主，缺乏统一的工艺技术标准和产品，品质差异很大且相关理论的研究较少。从市场中生产者需求和传统工艺流程来看，自然发酵生产状态是影响标准化生产的最大阻碍。由于自然发酵无法满足发酵时间和凝乳品质的标准化以及微生物安全，因此严重制约了产品的市场销售范围，前期研究甚至发现自然发酵会引入青霉属和曲霉属等有害真菌[23]。因此，本研究以前期从蒙古族自然发酵乳中分离、纯化、初步筛选得到乳酸乳球菌（Lactococcus lactis）XM-001和植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）XM-002，对其进行产酸凝乳和产双乙酰能力评价，通过筛选评价和菌株复配，用于研发一款高脂型浩乳德产品，不但能够保证菌株来源的安全性和稳定性，而且也为浩乳德的标准化生产以及工业生产标准的制定提供有益借鉴。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
1.1.1 实验材料
乳酸乳球菌（Lactococcus lactis）XM-001和植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）XM-002：锡林郭勒职业学院筛选及保藏；全脂灭菌纯牛奶（蛋白质3.2 g、脂肪3.8 g、碳水化合物4.8 g）：伊利集团；市售生鲜乳：锡林浩特市市场；商用菌剂1（由保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌、乳酸乳球菌乳酸亚种、乳酸乳球菌乳脂亚种、乳酸乳球菌双乙酰亚种、肠膜明串珠菌肠膜亚种、嗜酸乳杆菌、双歧杆菌、长双歧杆菌、婴儿双歧杆菌10种混合菌组成，菌活力达108 CFU/g）、商用菌剂2（由杜邦-丹尼斯克的酸奶发酵菌组成，菌活力达108 CFU/g）：昆山佰生优生物科技有限公司。
1.1.2 化学试剂
双乙酰标准品（纯度99.9%）：北京普慧智远生物科技有限公司；邻苯二胺、酚酞、氢氧化钠（均为分析纯）：国药集团化学试剂有限公司。
1.1.3 培养基
MRS固体培养基：北京路桥技术股份有限公司。
1.2 仪器与设备
HWS-250BX恒温恒湿培养箱：天津市泰斯特仪器有限公司；SW-J-2FD双人单面垂直净化工作台：苏州博莱尔净化设备有限公司；AXTG16G台式高速离心机：盐城市安信实验仪器有限公司；UV9100A紫外分光光度计：北京莱伯泰科仪器股份有限公司。
1.3 方法
1.3.1 菌株产酸凝乳能力评价
对菌株XM-001、XM-002、XM-001和XM-002复合菌1∶1进行产酸凝乳评价，并以两种商用菌剂为阳性对照，以全脂灭菌纯牛奶为阴性对照（CK），进行产酸凝乳能力评价。在25 ℃的条件下，发酵24 h，并以发酵酸度（吉尔涅尔度，°T）及最终常温凝乳状态（有无凝乳，凝块是否均匀、润滑，乳清是否析出）和感官风味等综合因素作为评价标准。
1.3.2 双乙酰风味物质测定
双乙酰标准曲线：取12支编号的试管分成2排放置，取一定量的双乙酰标准品溶液，并用8%三氯乙酸溶液补足10 mL，使双乙酰标准溶液的最终质量浓度为0、3.0 μg/mL、6.0 μg/mL、9.0 μg/mL、12.0 μg/mL和15.0 μg/mL。以双乙酰质量浓度（x）为横坐标，吸光度值（y）为纵坐标绘制标准曲线。
样品前处理：取15 mL自然发酵凝乳样品于50 mL离心管，加入15 mL 16%三氯乙酸溶液，颠倒混匀后4 000 r/min离心10 min，使用滤纸进行过滤，滤液为待测样品。同时，以全脂灭菌纯牛奶作为阴性对照。
双乙酰的测定[24]：准备12支15 mL试管分两排，第一排试管中加入0.5 mL 1%的邻苯二胺溶液，第二排试管为空白不加邻苯二胺溶液；摇匀后置于黑暗处放置30 min。待反应完全后第一排试管加2.0 mL浓度为4.0 mol/L的盐酸终止反应，第二排试管加2.5 mL盐酸，混匀后以第二排试管作为空白参比液，用石英比色皿在波长335 nm处测定吸光度值。取通过前处理的发酵乳样品，用8%的三氯乙酸溶液稀释3倍，重复上述实验步骤，然后代入双乙酰标准曲线回归方程中计算样品的双乙酰质量浓度。
1.3.3 浩乳德加工工艺流程及操作要点
将筛选得到乳酸乳球菌XM-001和植物乳杆菌XM-002，按照1∶1的比例混合制成复合菌剂加入到高温灭菌后的牛奶中在常温条件下进行自然发酵，并将发酵凝乳用于浩乳德的制作。具体制作工艺流程见图1。
图1 浩乳德制作流程
Fig.1 Production process of Hurood
1.3.4 分析检测
将制作完成的浩乳德放在阴凉干燥环境下晾晒16 h后计算浩乳德得率（浩乳德得率=浩乳德成品质量/原料乳的质量×100%）。随机抽选15位具有食品感官评定资质的检测人员，从外观色泽、口感、气味、组织状态和融水状态5个方面对浩乳德进行感官评价[15]，满分100分，感官评价标准见表1。
表1 浩乳德感官评价标准
Table 1 Sensory evaluation standards of Hurood
浩乳德水分、蛋白质和脂肪检测分别按照GB 5009.3—2016《食品中水分的测定》[25]、GB 5009.5—2016《食品中蛋白质的测定》[26]、GB 5009.6—2016《食品中脂肪的测定》[27]中的方法进行测定。
1.3.5 数据统计分析采用SPSS Statistics 20.0软件进行数据的统计分析，进行相关性分析，实验结果以“平均值±标准差”表示。
2 结果与分析
2.1 产酸凝乳能力评价结果分析
产酸凝乳能力是乳制品生产加工中常用于评价菌株活力和筛选良好发酵性能的重要参考依据之一。乳制品在发酵过程中菌株会将乳中的蛋白质、乳糖等逐渐分解不仅产生氨基酸和乳酸等营养成分，还能为发酵乳赋予一些独特的风味物质，如双乙酰、乙醛、乙偶姻、有机酸、脂肪酸等[28]。鲜奶中的乳糖被乳酸菌发酵生成乳酸、乙酸、柠檬酸等有机酸，能够降低胃肠道pH，抑制肠道病原菌，调节肠道菌群平衡[29]。因此，乳酸菌的产酸能力是评价其活力和筛选优良菌株的重要指标。凝乳能力也是作为酸奶等乳制品生产的关键环节，在生产凝乳制品的过程中，多依靠控制凝乳过程及性质来调控乳制品质构与风味特征的目的[30-31]。尤其是在蒙古族传统乳制品的制作过程中，凝乳程度是影响产品品质的关键因素之一，一般会通过调控加热凝乳过程来达到可控的产品风味与品质[32]。本研究对菌株XM-001、菌株XM-002及商用菌剂进行产酸凝乳评价，结果见表2。
表2 不同菌株产酸凝乳能力评价结果
Table 2 Evaluation results of ability of acid production and milk curdling by different strains
由表2可知，发酵24 h后，菌株XM-001酸度可达（84.30±4.16）°T；菌株XM-002酸度为（36.00±2.08）°T，二者相比，菌株XM-001产酸快，凝乳状态较好，感官风味好；复合菌酸度可达（88.00±4.00）°T。商用菌剂1酸度为（69.30±1.10）°T，商用菌剂2酸度为（63.00±1.21）°T。与两种商用菌剂比，菌株XM-001凝乳状态很好，产酸远高于商用菌剂，但感官风味略差。菌株XM-002感官风味与商用菌剂相似，而凝乳状态和酸度次于商用菌剂；将菌株XM-001和XM-002用1∶1的比例进行复配，其酸度可达（88.00±4.00）°T，感官评分达90分。结果表明，菌株XM-001是具有较强发酵能力的乳酸乳球菌，菌株XM-002是感官风味较好的植物乳杆菌。二者复配后产酸凝乳和感官风味均有较好提升。
2.2 双乙酰含量测定结果分析
双乙酰被认为是产生乳制品奶油香味的主要物质[24]，也是评价发酵奶制品的一个关键因素。测定结果见表3。
表3 不同菌株制备浩乳德中双乙酰含量测定结果
Table 3 Determination results of diacetyl contents in Hurood prepared by different strains μg/mL
由表3可知，菌株XM-001发酵24 h后的双乙酰含量为（21.40±1.36）μg/mL，菌株XM-002发酵24 h后的双乙酰含量为（23.90±4.05）μg/mL，二者复合配比后的菌剂双乙酰含量可达（24.60±0.77）μg/mL，由此可知，复配后菌株的双乙酰含量有所提升，但提升并不显著。而商用菌剂1和商用菌剂2的双乙酰含量分别为（38.00±1.71）μg/mL、（32.56±4.62）μg/mL，均高于本研究所筛选菌株的产双乙酰含量，这可能是由于两种商用菌剂均是多种菌株复配所得，因此在多种菌株共同作用下加快了风味代谢反应，促进双乙酰等风味物质的产出，所以整体双乙酰含量比本研究所得单株菌偏高。
2.3 浩乳德品质分析
2.3.1 浩乳德的产率及感官评价
由表4可知，采用菌株XM-001和XM-002复合菌株（1∶1）发酵制作的浩乳德感官评分为（85.2±1.91）分，复合菌剂生产的浩乳德与自然发酵制得的浩乳德产品相比，整体感官评分较好，质地光滑，组织较细腻，具有突出的脂香风味，但所制得浩乳德融水状态略差，受热易分散。经计算制得浩乳德产品平均得率为（9.4±0.21）%，与王晓宇[15]利用筛选所得菌种进行工业化生产浩乳德时，通过对菌种添加量、发酵温度、排乳清温度以及搅和温度进行工艺优化后，浩乳德出成率为8.31%，略低于本研究结果。由此可知，本实验所筛选的菌种进行浩乳德制作时，产品得率有所提高，但产品整体融水状态浑浊，受热易分散。这可能是由于在浩乳德制作过程中上层乳脂析出较少，使得最终产品中含脂率偏高。因此推断本复合菌种有利于生产高脂型浩乳德产品。
表4 浩乳德产品得率与感官评分
Table 4 Yield and sensory score of Hurood product
2.3.2 浩乳德理化指标
由图2可知，菌株XM-001、XM-002复合菌株（1∶1）用复合菌剂发酵制备的浩乳德，蛋白质平均含量为（32.1±1.9）%，而传统浩乳德中蛋白质平均含量为（32.1±2.7）%，二者含量相似，略高于地方标准DBS15/001.3—2017《食品安全地方标准蒙古族传统乳制品第3部分：奶豆腐》要求（蛋白质含量＞26%）；用复合菌剂生产的浩乳德水分平均含量为（39.4±2.3）%，符合DBS15/001.3—2017要求（水分＜53%）[33]，而传统浩乳德中水分含量为（55.1±3.8）%，其水分含量偏高一些，这可能与浩乳德制作工艺中晾晒脱水程度有关[34]。如浩乳德按水分含量可分为干、半干、湿三种类型，而依据产品类型的不同，浩乳德的蛋白质、脂肪、水分等营养成分指标也有所不同[35]。传统浩乳德中脂肪平均含量为（8.4±2.2）%，复合菌剂生产的浩乳德脂肪平均含量为（22.6±2.8）%（P＜0.01）。由于本研究所使用的复合菌剂在制作浩乳德时常温发酵18 h，酸度到65°T以上，就达到了发酵终点。菌种发酵时间短，产品出现脂肪上浮较少，使得脱脂率降低，最终所得产品脂肪含量较高。由此可以进一步推断该复合菌剂有利于生产高脂型浩乳德，所得产品不仅脂肪等营养价值增高，更赋予了其突出的脂香风味。
图2 浩乳德理化指标检测结果
Fig.2 Determination results of physicochemical indexes of Hurood
不同小写字母表示差异显著（P＜0.05）。
3 结论
本实验通过对菌株XM-001和XM-002产酸凝乳能力和产双乙酰风味物质评价，最终确定菌株XM-001的产酸凝乳状态优于对照菌株，且产酸能力远高于商用菌剂，但整体感官风味和双乙酰含量略差。菌株XM-002发酵感官风味与商用菌剂相近，但产酸凝乳能力和双乙酰含量次于商用菌剂，将菌株XM-001和XM-002按照1∶1比例进行复配发酵后，用此复合菌株制作浩乳德，所得产品整体得率、感官评分以及理化指标与传统浩乳德相比均较好，其中复合菌株所生产的浩乳德的脂肪含量明显高于传统自然发酵生产的浩乳德，具有极显著性差异（P＜0.01）。本实验所使用的复合菌剂在制作浩乳德时，菌种发酵时间短，出现脂肪上浮较少，使得脱脂率降低，最终所得产品脂肪含量偏高。因此该复合菌株有利于生产高脂型浩乳德产品，而脂肪含量增加，更赋予了其浓厚的脂香风味，不但能够保证菌株来源的安全性和稳定性，而且为浩乳德的标准化生产以及工业生产标准的制定提供有益借鉴。
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